ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm nhiễm
Orientia tsutsugamushi , ấu trùng sốt mò tại khu vực Tây Bắc
2.1.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu mầm bệnh sốt mò lưu hành tại cộng đồng:
+ Người dân tại điểm nghiên cứu, không phân biệt tuổi, giới
+ Các loài chuột tại điểm nghiên cứu
+ Trung gian truyền bệnh: ấu trùng mò
- Đối tượng nghiên cứu đặc điểm bệnh sốt mò:
+ Hệ thống sổ sách, bệnh án các trường hợp mắc bệnh sốt mò đến khám và điều trị tại các bệnh viện đa khoa 4 tỉnh từ ngày 01/01/2016 đến ngày 31/12/2017
Tiêu chuẩn xác định bệnh [5]:
Dựa vào tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm:
Chẩn đoán chỉ cần một tiêu chuẩn lâm sàng, bao gồm triệu chứng sốt, vết loét đặc trưng, có thể kèm theo hạch sưng đau, ban dát sẩn Các chỉ số bạch cầu dao động từ 4.000 đến 12.000, trong khi mức lympho có thể bình thường hoặc tăng, và chỉ số máu lắng cũng tăng cao.
+ Chỉ tiêu bắt buộc: Phải có vết loét đặc trưng
- Nếu không có vết loét đặc trưng, bắt buộc phải có một test sau đây dương tính:
Các phương pháp xét nghiệm để phát hiện kháng thể bao gồm: xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (IgM ELISA), xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA), và xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp (IIP).
+ Một số xét nghiệm khác như: Phân lập O tsutsugamushi; Nhuộm soi kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn ở tế bào nuôi cấy; Xét nghiệm PCR
- Nghiên cứu được triển khai tại 4 tỉnh thuộc khu vực Tây Bắc, gồm: Sơn
La, Điện Biên, Lai Châu và Hòa Bình là những tỉnh có điều kiện sinh địa cảnh thuận lợi cho sự phát triển, nhưng vẫn đối mặt với nhiều khó khăn về kinh tế - xã hội Khu vực này chủ yếu là vùng đồng bào dân tộc thiểu số, đã ghi nhận số ca mắc bệnh sốt mò cao trong những năm qua và đóng vai trò quan trọng trong chính trị, an ninh và quốc phòng.
- Viện Nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01 năm 2016 đến tháng 6 năm 2018
- Nghiên cứu dịch tễ học mô tả có phân tích
- Nghiên cứu hồi cứu có phân tích đặc điểm bệnh sốt mò từ hồ sơ bệnh nhân sốt mò lưu tại 4 bệnh viện tuyến tỉnh
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu của mục tiêu 1 như sau:
Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu mục tiêu 1
- Cỡ mẫu điều tra cộng đồng dân cư: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu: pε 2 p)
Nghiên cứu có cỡ mẫu n, với tỷ lệ ước tính quần thể p = 0,2104, cho thấy 21,04% người dân tỉnh Khánh Hòa có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi, theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên Mức ý nghĩa thống kê được thiết lập ở α = 0,05.
Nghiên cứu mô tả một số đặc điểm nhiễm
Orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò và đặc điểm phân bố bệnh sốt mò tại khu vực Tây Bắc
Xác định tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo các yếu tố như tỉnh, giới, tuổi, dân tộc và nghề nghiệp Đánh giá đặc điểm phân bố bệnh nhân sốt mò tại bốn tỉnh khu vực Tây Bắc theo các tiêu chí tỉnh, giới, tuổi và thời gian trong năm.
Nghiên cứu về đặc điểm và phân bố vật chủ cũng như trung gian truyền bệnh sốt mò tại các điểm nghiên cứu cho thấy sự đa dạng trong thành phần loài và mật độ chuột Việc điều tra này giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự lây lan của bệnh sốt mò trong khu vực nghiên cứu.
Xác định tỷ lệ chuột có kháng thể kháng O tsutsugamushi
Xác định tỷ lệ chuột nhiễm ấu trùng mò
Xác định thành phần loài mò thu thập được
Z 1- α/2 = 1,96 (Tương ứng α = 0,05) ε = 0,1 (Mức chính xác tương đối)
Cỡ mẫu tính được tối thiểu là 1.442 người
- Cỡ mẫu điều tra hồi cứu bệnh nhân sốt mò:
Tất cả bệnh nhân được chẩn đoán mắc sốt mò và điều trị tại bệnh viện đa khoa ở bốn tỉnh Hòa Bình, Sơn La, Điện Biên và Lai Châu trong khoảng thời gian từ 01/01/2016 đến 31/12/2017 đều đáp ứng tiêu chuẩn nghiên cứu.
Thực tế, đã chọn được 230 hồ sơ bệnh nhân sốt mò đưa vào nghiên cứu (dựa vào mô tả đặc điểm lâm sàng và vết loét đặc trưng)
- Cỡ mẫu điều tra vật chủ và trung gian truyền bệnh: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu: d2 p)
Nghiên cứu này sử dụng cỡ mẫu n, với tỷ lệ ước tính quần thể p = 0,125, dựa trên thông tin từ tác giả Đoàn Trọng Tuyên về tỷ lệ chuột có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi tại Gia Lai Mức ý nghĩa thống kê được thiết lập là α = 0,05.
Z 1- α/2 = 1,96 (Tương ứng α = 0,05) d = 0,02 (Sai số tuyệt đối)
Cỡ mẫu tính được tối thiểu là 1.050 con chuột
2.1.2.3 Chọn mẫu điều tra cộng đồng dân cư
Theo phương pháp chọn mẫu nhiều giai đoạn:
Bài viết này đề cập đến việc chọn lựa bốn tỉnh thuộc khu vực Tây Bắc, nơi có nhiều bệnh nhân mắc sốt mò được ghi nhận và hệ thống y tế cơ sở đang gặp nhiều khó khăn Các tỉnh được lựa chọn bao gồm: [tên các tỉnh].
Hòa Bình, Sơn La, Điện Biên và Lai Châu
Trong nghiên cứu về bệnh sốt mò, bốn huyện có tỷ lệ mắc bệnh cao trong hai năm 2014 - 2015 đã được chọn, bao gồm huyện Mai Châu (tỉnh Hòa Bình), huyện Yên Châu (tỉnh Sơn La), huyện Mường Ảng (tỉnh Điện Biên) và huyện Phong Thổ (tỉnh Lai Châu).
Chúng tôi đã chọn 30 xã từ tổng số 66 xã của 4 huyện bằng phương pháp chọn mẫu chùm xác suất tỷ lệ với kích thước quần thể Danh sách các xã được chọn sẽ được công bố cụ thể sau đây.
+ Huyện Mai Châu: xã Chiềng Châu, Mai Hạ, Vạn Mai, Mai Hịch, Nà Phòn, Tòng Đậu, Đồng Bảng
+ Huyện Yên Châu: Thị trấn Yên Châu, xã Chiềng Đông, Chiềng Sàng, Chiềng Pằn, Viêng Lán, Chiềng Khoi, Chiềng Hặc, Sập Vạt
+ Huyện Mường Ảng: Thị trấn Mường Ảng, xã Ẳng Nưa, Ẳng Cang, Ẳng Tở, Mường Lạn, Xuân Lao, Búng Lao
+ Huyện Phong Thổ: Thị trấn Phong Thổ, xã Ma Ly Pho, Khổng Lào, Bản Lang, Mường So, Nậm Xe, Hoang Thèn, Lả Nhì Thàng
- Lập danh sách và đánh số thứ tự toàn bộ các hộ gia đình trong 30 xã
Chọn 1.520 hộ gia đình theo phương pháp ngẫu nhiên hệ thống Mỗi hộ gia đình được chọn, tiến hành khám các thành viên trong gia đình, phỏng vấn và lấy mẫu máu xét nghiệm chủ hộ
2.1.3.1 Đánh giá thực trạng lưu hành mầm bệnh sốt mò tại cộng đồng dân cư khu vực Tây Bắc
- Khám lâm sàng, phỏng vấn và lấy máu của những người được chọn để xét nghiệm xác định tỷ lệ người dân có miễn dịch với Orientia tsutsugamushi
- Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản và xét nghiệm tại Viện Nghiên cứu Y
- Dược học quân sự, Học viện Quân y
- Phân tích thực trạng bệnh sốt mò tại điểm nghiên cứu
2.1.3.2 Nội dung đánh giá một số đặc điểm phân bố bệnh sốt mò tại 4 tỉnh Tây Bắc
- Tra cứu, chọn hồ sơ bệnh nhân sốt mò điều trị tại bệnh viện 4 tỉnh từ ngày
01 tháng 01 năm 2016 đến ngày 31 tháng 12 năm 2017
- Nghiên cứu, phân tích một số đặc điểm phân bố của bệnh nhân sốt mò điều trị tại 4 bệnh viện đa khoa tỉnh khu vực Tây Bắc
2.1.3.3 Nội dung nghiên cứu đặc điểm, phân bố vật chủ và trung gian truyền bệnh sốt mò
- Thu thập chuột bằng bẫy trong nhà và ngoài nhà
- Xác định tỷ lệ, thành phần loài, mật độ, sự phân bố của chuột tại điểm nghiên cứu
- Xác định mật độ chuột (chung và từng loài)
- Xác định tỷ lệ chuột có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi tại các địa điểm nghiên cứu
+ Thu thập mẫu máu của chuột tại các điểm nghiên cứu theo kỹ thuật thường quy của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương
+ Xét nghiệm tìm kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi trong huyết thanh chuột bằng sinh phẩm chẩn đoán nhanh
- Đánh giá thực trạng nhiễm mò ở ở chuột tại các địa điểm nghiên cứu
- Xác định thành phần loài, sự phân bố mò tại các địa điểm nghiên cứu
2.1.4 Các biến số nghiên cứu
Bảng 2.1 Danh sách, định nghĩa biến số nghiên cứu
TT Tên biến số Định nghĩa Loại biến
1 Nhóm tuổi Là tuổi của đối tượng nghiên cứu được tính bằng năm chia thành các nhóm
2 Giới Giới tính của đối tượng tham gia nghiên cứu
TT Tên biến số Định nghĩa Loại biến
3 Dân tộc Dân tộc của đối tượng tham gia nghiên cứu
4 Nghề nghiệp Nghề nghiệp chủ yếu và phải dành nhiều thời gian cho công việc này nhất
5 Vùng sinh thái Đặc điểm sinh thái tại điểm nghiên cứu được phân loại
Người tham gia nghiên cứu, có kết quả xét nghiệm ELISA phát hiện Orientia tsutsugamushi dương tính
Người bệnh được chẩn đoán là bệnh sốt mò (theo tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh của
Bộ Y tế) điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh
Thời gian (tháng) bệnh nhân vào viện khám và điều trị bệnh sốt mò (theo bệnh án)
9 Loài chuột Tên loài chuột được định loại theo tài liệu Bộ gặm nhấm - Động vật chí Việt Nam
Biến phân loại Định loại chuột
10 Mật độ chuột Chỉ số chuột (con/100 bẫy/đêm)
Chuột bắt được tại điểm nghiên cứu, có kết quả XN kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi dương tính
Xét nghiệm máu toàn phần chuột
Chuột bắt được tại điểm nghiên cứu phát hiện có ấu trùng mò ký sinh
Xét nghiệm tìm mò trên chuột
13 Loài mò/ấu trùng mò
Tên loài mò/ấu trùng mò được định loại theo tài liệu phân loại mò ở Việt Nam
Biến phân loại Định loại mò
2.1.5 Các chỉ số nghiên cứu
- Tỷ lệ % người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi = Số mẫu có kết quả xét nghiệm ELISA Orientia tsutsugamushi dương tính/ Số mẫu xét nghiệm x 100
- Mật độ chuột (con/100 bẫy/đêm) = Số chuột bẫy được đêm/tổng số bẫy đặt 1 đêm x 100
Tỷ lệ phần trăm chuột mang kháng thể chống lại Orientia tsutsugamushi tại các địa điểm nghiên cứu được tính bằng cách lấy số chuột có kết quả xét nghiệm dương tính với kháng thể chia cho tổng số chuột được bắt và nhân với 100.
- Tỷ lệ % chuột nhiễm mò = Số con chuột có ấu trùng mò / Số con chuột bắt được x 100
- Tỷ lệ % thành phần các loài chuột = Số chuột được định loại theo từng loài /Số chuột thu được x 100
- Tỷ lệ % thành phần các loài mò = Số chuột có ấu trùng mò được định loại theo từng loài /Số chuột có ấu trùng mò thu được x 100
2.1.6 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.1.6.1 Kỹ thuật lấy, bảo quản mẫu huyết thanh
- Lấy 5 ml máu tĩnh mạch ngoại vi người, cho vào ống đựng có chất chống đông EDTA
- Ly tâm ở nhiệt độ thường với tốc độ 1.500 vòng/phút trong thời gian 5 phút
- Tách chuyển phần huyết tương sang ống đựng mới
- Bảo quản ở -20°C trong thời gian ngắn (dưới 1 tháng), và lưu ở tủ âm sâu -80°C trong thời gian dài
2.1.6.2 Kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng O tsutsugamushi ở người
Bộ sinh phẩm ELISA Panbio (Úc) được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng O.tsutsugamushi với độ nhạy đạt 96,6% và độ đặc hiệu là 94,4% Việc thực hiện xét nghiệm cần tuân thủ quy trình hướng dẫn từ Nhà sản xuất để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
2.1.6.3 Kỹ thuật bẫy thu thập chuột và định loại
- Sử dụng bẫy lồng kích thước 24 x 14 x 14cm (mắt lưới bẫy 15x15 mm)
Tại mỗi điểm nghiên cứu, chúng tôi đã đặt 10 đêm với 100 bẫy mỗi đêm, bao gồm 50 bẫy trong nhà và 50 bẫy ngoài trời Các bẫy được đặt trong nhà và ở khu vực nương rẫy, rừng cách nhà ở từ 100-500m Mồi cho bẫy chuột sử dụng khoai lang, sắn hoặc bắp ngô tươi.
- Định loại chuột theo Bộ gặm nhấm - Động vật chí Việt Nam [23]
2.1.6.4 Kỹ thuật xét nghiệm tìm kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi trên chuột
Sử dụng test SD BIOLINE Tsutsugamushi (Hàn Quốc) có độ nhạy 84,0% và độ đặc hiệu 94,4% Thực hiện xét nghiệm theo quy trình hướng dẫn của Nhà sản xuất
- Lấy que thử khỏi túi nhôm, đặt lên một nơi bằng phẳng và khô ráo
- Dùng bơm tiêm lấy máu tim chuột, nhỏ 1 giọt vào giếng mẫu (S) Nhỏ tiếp 3 - 4 giọt (khoảng 100~120 μl) dung môi pha loãng
- Khi phản ứng bắt đầu sẽ nhìn thấy vạch màu tím di chuyển đến giữa cửa sổ kết quả trên thanh que thử
- Đọc kết quả sau 10 ~ 15 phút
2.1.6.5 Kỹ thuật thu thập ấu trùng mò
Thu thập ấu trùng mò trên chuột sau khi đã gây mê lấy huyết thanh
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm (kit) phát hiện Orientia tsutsugamushi quy mô phòng thí nghiệm
phát hiện Orientia tsutsugamushi quy mô phòng thí nghiệm 2.2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm dương tính với Orientia tsutsugamushi (nhóm bệnh)
- Mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi (nhóm chứng)
- Mẫu bệnh phẩm dương tính với một số loài vi khuẩn có thể gây triệu chứng bệnh tương tự như Orientia tsutsugamushi
- Bộ sinh phẩm phát hiện Orientia tsutsugamushi bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt RPA được chế tạo
Viện Nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y
Nghiên cứu được thực hiện từ 01/2016 đến 6/2018
- Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện Orientia tsutsugamushi tại phòng thí nghiệm
- Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của sản phẩm
Sơ đồ quy trình chế tạo bộ kit
Hình 2.3 Quy trình chế tạo kit phát hiện Orientia tsutsugamushi
- Chế tạo 500 bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi bằng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt RPA
- Mẫu bệnh phẩm (+) với Orientia tsutsugamushi (nhóm bệnh): 37 mẫu
- Mẫu bệnh phẩm (-) với Orientia tsutsugamushi (nhóm chứng): 100 mẫu
- Mẫu bệnh phẩm dương tính với một số loài vi khuẩn có thể gây triệu chứng bệnh tương tự như Orientia tsutsugamushi: 13 mẫu
Tối ưu điều kiện phản ứng khuếch đại acid nucleic
Tối ưu thành phần phản ứng khuếch đại acid nucleic
Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của công nghệ RPA
Chúng tôi đã tiến hành sản xuất thử nghiệm 500 bộ test chẩn đoán Orientia tsutsugamushi nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit Ngoài ra, chúng tôi cũng kiểm tra độ chính xác và độ lặp lại của bộ kit, cùng với việc đánh giá độ ổn định của sản phẩm chẩn đoán này.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bộ kit
Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán Orientia tsutsugamushi của bộ kit
2.2.3.1 Thiết kế phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ khác nhau để phát hiện Orientia tsutsugamushi
- Nghiên cứu tách dòng giải trình tự vùng gen bao ngoài đoạn gen đích dự định thiết kế primer/probe
- Nghiên cứu thiết kế primer và probe cho phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ khác nhau để chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
- Nghiên cứu thiết kế primer và probe cho phản ứng khuếch đại chứng nội
2.2.3.2 Tối ưu phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ khác nhau sử dụng ADN khuôn tổng hợp từ plasmid
Nghiên cứu nhân dòng plasmid với trình tự đích cho phản ứng khuếch đại acid nucleic nhằm thiết lập chứng dương và phát triển panel độ nhạy với các nồng độ khác nhau.
- Đánh giá kết quả nhân dòng đoạn gen quan tâm của Orientia tsutsugamushi
- Nghiên cứu chế tạo panel độ nhạy gồm nhiều dải nồng độ plasmid chứa trình tự gen đích của Orientia tsutsugamushi
- Nghiên cứu tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc độ thay đổi nhiệt độ của phản ứng
- Nghiên cứu tối ưu các thành phần phản ứng khuếch đại acid nucleic, bao gồm dung dịch đệm, enzyme ADN polymerase, nồng độ primer và probe
- Nghiên cứu đánh giá ngưỡng phát hiện của từng công nghệ sử dụng panel độ nhạy với dãy các nồng độ khác nhau
Nghiên cứu này nhằm đánh giá độ đặc hiệu của từng công nghệ thông qua việc sử dụng panel độ đặc hiệu, bao gồm các mẫu bệnh phẩm âm tính với Orientia tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm dương tính với một số loài vi khuẩn khác.
2.2.3.3 Xây dựng quy trình chế tạo và đánh giá các tiêu chí kỹ thuật bộ kit sử dụng công nghệ khuếch đại acid nucleic có khả năng chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
- Lựa chọn công nghệ khuếch đại acid nucleic có khả năng chẩn đoán
Orientia tsutsugamushi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất để hoàn thiện quy trình và xây dựng quy trình chế tạo kit
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp lại trong mỗi lần xét nghiệm và giữa các lần xét nghiệm của bộ kit
- Đánh giá độ ổn định của quy trình khuếch đại acid nucleic chẩn đoán
Orientia tsutsugamushi trong máu của bệnh nhân sốt mò
- So sánh với bộ kit khuếch đại acid nucleic chẩn đoán Orientia tsutsugamushi của nước ngoài
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bộ kit chẩn đoán Orientia tsutsugamushi
- Xây dựng hướng dẫn quy trình xét nghiệm chẩn đoán Orientia tsutsugamushi bằng kit khuếch đại acid nucleic
2.2.4 Các kỹ thuật đã áp dụng chế tạo bộ kit
2.2.4.1 Kỹ thuật thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu
Quy trình lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi cho xét nghiệm bắt đầu bằng việc thu thập 5 ml máu vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA Mẫu máu cần được vận chuyển đến labo trong vòng 6 tiếng, sau đó được ly tâm ở tốc độ 1.500 vòng/phút trong 5 phút để tách huyết tương Huyết tương sau đó được chuyển vào ống nhựa polypropylene, trong khi phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng để phân tích gen sau này nếu cần Cả mẫu huyết tương và tế bào đều được lưu trữ ở nhiệt độ -20°C cho đến khi tiến hành phân tích.
- Tách chiết ADN từ mẫu máu, huyết tương hoặc huyết cầu: ADN được tách chiết bằng bộ kit Anapure ADN/ARN Viral Mini Kit Anabio (Việt
Quy trình tách huyết tương và dịch cơ thể được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất, sử dụng thể tích máu, huyết tương hoặc huyết cầu là 600 µL để chiết xuất ADN, với thể tích ADN thu được cuối cùng là 60 µL Để kiểm tra nồng độ và chất lượng mẫu ADN đã chiết xuất, sử dụng bộ kit đo nồng độ ADN siêu nhạy (5 pg/µL) trên hệ thống Fragment Analyzer của Advance Analytical (Mỹ).
2.2.4.2 Kỹ thuật PCR và điện di phân tích sản phẩm PCR
Kỹ thuật PCR truyền thống là phương pháp khuếch đại ADN trong ống nghiệm (in-vitro) sử dụng hai mồi xuôi và ngược Phản ứng này cho phép nhân số lượng đoạn gen quan tâm rất nhanh chóng, với tốc độ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, từ một chuỗi ban đầu có thể tạo ra khoảng một tỉ chuỗi sau 30 chu kỳ Sản phẩm của phản ứng PCR truyền thống được phát hiện và phân tích sau khi hoàn tất toàn bộ quá trình.
Kỹ thuật PCR là một công cụ quan trọng trong sinh học phân tử, cho phép xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh, thực hiện giải trình tự gen trực tiếp và tạo dòng phân tử, phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau.
Kỹ thuật điện di phân tích ADN là phương pháp quan trọng giúp phát hiện và phân tích ADN được chiết tách từ các mẫu có nguồn gốc khác nhau, cũng như từ các sản phẩm PCR.
Phương pháp điện di ngang với gel agarose thường được sử dụng để phân tích ADN tách chiết hoặc sản phẩm PCR, mang lại kết quả tốt với các nồng độ gel khác nhau Sau khi điện di, các bản gel được nhuộm với ethidium bromide và chụp ảnh dưới đèn UV để đọc kết quả Nghiên cứu này áp dụng phương pháp điện di mao quản, giúp nâng cao độ phân giải và độ nhạy trong phân tích ADN từ các mẫu nghiên cứu.
Giải trình tự gen bắt đầu bằng việc xác định kích thước các sản phẩm PCR qua điện di, dựa vào thang ADN chuẩn Sản phẩm ADN, được coi là kết quả của phản ứng với mồi đặc hiệu, sẽ được cắt ra khỏi gel agarose và tinh sạch bằng kit Các sản phẩm tinh sạch này có thể được sử dụng trực tiếp cho giải trình tự gen hoặc để tạo dòng phân tử trước khi tiến hành giải trình tự Kết quả giải trình tự sau đó sẽ được so sánh với trình tự gen trong ngân hàng và đối chiếu các mẫu với nhau thông qua phần mềm chuyên dụng.
2.2.4.3 Kỹ thuật tách dòng gen
Sản phẩm PCR chứa trình tự gen đích 47kDa của O.tsutsugamushi được cắt bằng enzyme BamHI để tạo ra đoạn ADN đầu dính, sau đó được chèn vào vector pJET1.2/blunt Đoạn chèn và vector pJET1.2 được lai ghép với enzyme T4 ligase và biến nạp vào tế bào E.coli DH5α.
Plasmid tái tổ hợp được tách chiết từ 3ml dịch nuôi cấy bằng bộ Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi tách chiết, chất lượng plasmid được kiểm tra thông qua đo mật độ quang để xác định nồng độ và phương pháp giải trình tự Plasmid tinh sạch thu được được sử dụng làm gen đích để tối ưu hóa các phản ứng realtime PCR và RPA.
2.2.4.4 Kỹ thuật realtime PCR định lượng
Phương pháp realtime PCR định lượng dựa trên việc đo tín hiệu quang liên tục sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR huỳnh quang, cho phép xác định nồng độ ADN khuôn ban đầu Trong phản ứng này, ngoài hai mồi xuôi và ngược để khuếch đại đoạn gen, còn có một mẫu dò đặc hiệu phát ra tín hiệu huỳnh quang khi phản ứng xảy ra Mẫu dò này được khoá ở đầu 3’ để ngăn không cho nó kéo dài trong quá trình PCR Mặc dù một đầu của mẫu dò gắn với phân tử phát ra tín hiệu huỳnh quang (FAM), nhưng tín hiệu này thường bị hấp thụ bởi phân tử khác ở đầu còn lại Trong bước kéo dài chuỗi của phản ứng PCR, hoạt tính này sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang, cho phép đo lường chính xác nồng độ ADN.
Enzyme Taq với hoạt tính exonuclease 5'-3' cắt tách hai đầu của mẫu dò đặc hiệu, cho phép đầu FAM phát ra tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu này có thể được đo liên tục sau mỗi chu kỳ phản ứng.
Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê y sinh học trên máy tính theo chương trình SPSS 17.0
Trong thiết kế primer và probe cho phản ứng realtime PCR, gen đích 47 kDa chỉ có ở Orientia tsutsugamushi và không xuất hiện ở các loài khác thuộc chi Rickettsia Các trình tự primer và probe đã được thiết kế và phân tích tương đồng với các trình tự khác bằng công cụ Primer3.
Trình tự gen 47 kDa có tính bảo tồn cao hơn 97% trong 25 chủng Orientia khác nhau đã được lựa chọn làm gen đích để thiết kế primer và probe cho phản ứng RPA Việc này nhằm mục đích phát hiện chính xác các chủng Orientia thông qua phản ứng RPA.
Orientia tsutsugamushi là một loại vi khuẩn gây bệnh Các trình tự mồi cho nghiên cứu được thiết kế bằng phần mềm PrimedRPA Gen đích của Orientia tsutsugamushi được xác định từ cơ sở dữ liệu của Ngân hàng gen với mã truy cập KY594258.1.
Sai số và khống chế sai số
Sai số trong quá trình thu thập thông tin tại thực địa, thực hiện quy trình kỹ thuật, nhập liệu và xử lý số liệu nghiên cứu:
- Tập huấn cho nghiên cứu viên, kỹ thuật viên thực hiện thành thục, đúng các quy trình kỹ thuật chuẩn: Thu thập, định loại chuột, ấu trùng mò;
Các quy trình kỹ thuật xét nghiệm nhằm phát hiện kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi trên người và chuột, cùng với các quy trình chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán Orientia tsutsugamushi trong phòng thí nghiệm, đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và kiểm soát bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Số liệu về bệnh nhân mắc sốt mò có thể chứa sai số hệ thống do việc báo cáo chưa phản ánh đầy đủ tổng số ca mắc thực tế trong cộng đồng Nguyên nhân của sai số này bao gồm độ chính xác của chẩn đoán, chất lượng hệ thống báo cáo, lưu trữ hồ sơ và công tác thống kê y tế ở các tuyến khác nhau Đây là loại sai số khó khắc phục, nhưng có thể giảm thiểu bằng cách tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu.
Để giảm thiểu sai số do nhập liệu, cần thiết kế bộ công cụ thu thập số liệu chuẩn, thực hiện nhập liệu hai lần, làm sạch và kiểm tra số liệu trước khi tiến hành phân tích.
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức Học viện Quân y phê duyệt và tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh trong suốt quá trình thực hiện.
Người tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện, có thể từ chối hoặc dừng tham gia nghiên cứu bất cứ lúc nào
Quá trình lấy mẫu máu và thực hiện thí nghiệm tại phòng thí nghiệm được tiến hành với sự tuân thủ nghiêm ngặt các biện pháp an toàn, nhằm bảo vệ cả đối tượng nghiên cứu và nhân viên nghiên cứu.
Thông tin thu thập chỉ sử dụng vào mục tiêu nghiên cứu, kết quả nghiên cứu được phản hồi cho cơ quan y tế địa phương nghiên cứu
Các thông tin cá nhân bảo đảm tính bí mật cá nhân, không được sử dụng cho phân tích và báo cáo trong luận án
Kết quả nghiên cứu sẽ được chia sẻ với các cơ quan trung ương và y tế địa phương, nhằm tạo cơ sở cho việc xây dựng kế hoạch dự phòng và kiểm soát bệnh sốt mò hiệu quả.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò tại khu vực Tây Bắc
tại khu vực Tây Bắc 3.1.1 Kết quả điều tra huyết thanh phát hiện kháng thể Orientia tsutsugamushi lưu hành trong cộng đồng dân cư
Theo điều tra cắt ngang tại 30 xã thuộc 4 tỉnh Hòa Bình, Sơn La, Điện Biên và Lai Châu, có 1.520 người được xét nghiệm huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi.
Bảng 3.1 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo tỉnh
Tỉnh Mẫu điều tra (n) Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) p
Ghi chú: p 1-2 : giá trị p của (1) và (2) Nhận xét:
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi là 12,17%, trong đó Hòa Bình có tỷ lệ cao nhất với 16,72%, tiếp theo là Điện Biên với 14,42% Tỉnh Sơn La và Lai Châu ghi nhận tỷ lệ thấp hơn, lần lượt là 9,05% và 8,67% Sự khác biệt giữa các tỉnh là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Bảng 3.2 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo giới
Giới tính Số mẫu xét nghiệm (n) Số mẫu (+) Tỷ lệ % p
Kết quả bảng 3.2 cho thấy: Sự khác biệt về tỷ lệ mang kháng thể kháng
Orientia tsutsugamushi giữa nam và nữ trong khu vực nghiên cứu không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05
Bảng 3.3 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo tuổi
Nhóm tuổi Số mẫu xét nghiệm (n) Số mẫu (+) Tỷ lệ % p
Kết quả từ bảng 3.3 chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm Orientia tsutsugamushi cao nhất thuộc về nhóm tuổi 41 - 50 với 23,01%, trong khi nhóm dưới 20 tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 6,7% Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 0,05.
Bảng 3.5 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo nghề nghiệp
Nghề nghiệp Mẫu điều tra (n) Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) p
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm Orientia tsutsugamushi ở nhóm người làm nông nghiệp là 24,68%, trong khi nhóm làm rừng có tỷ lệ 15,38% Cả hai tỷ lệ này đều cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với các nhóm nghề khác như quân nhân, làm rẫy và tự do, với p
