(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, kết quả điều trị bệnh do gnathostoma spp, định danh mầm bệnh trên người và vật chủ trung gian tại phía nam việt nam (2016 2017)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu 1 và 2: Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh do

Gnathostoma spp trên người tại phía Nam Việt Nam (2016-2017) Đánh giá kết quả điều trị bệnh do Gnathostoma spp bằng ivermectin tại điểm nghiên cứu

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân cho nghiên cứu tại phòng khám chuyên khoa ký sinh trùng bao gồm việc xác định các đối tượng đến khám đáp ứng đầy đủ các tiêu chí chọn mẫu đã được đề ra.

 Tiền sử ăn thủy sản tái hoặc sống, chưa nấu chín, đi du lịch đến các vùng có bệnh lưu hành phổ biến

 Triệu chứng lâm sàng của hội chứng ấu trùng di chuyển da niêm mạc hoặc phủ tạng như ngứa, mày đay, nổi mẫn đỏ, ban đỏ, ban trường,

 Bạch cầu ái toan tăng > 500 bạch cầu/ ml máu

 Huyết thanh chẩn đoán miễn dịch với kháng nguyên Gnathostoma hay kháng thể kháng Gnathosoma spp dương tính

- Tỉnh táo, có khả năng nghe, hiểu, trả lời bằng tiếng Việt Nam

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

- Không có giới hạn về tuổi

 Những bệnh nhân chỉ dương tính với ký sinh trùng khác không phải G spinigerum

 Người từ chối giữa chừng, không tự nguyện tham gia nghiên cứu

 Người đang mắc các bệnh cấp tính, mãn tính nghiêm trọng

 Người có tiền sử bệnh về thần kinh, suy nhược thần kinh

 Người có tiền sử bệnh về thị giác như đục thủy tinh thể, thoái hóa võng mạc

 Người có tiền sử bệnh về hô hấp mạn tính như hen phế quản, viêm phế quản mạn

 Người có tiền sử bệnh về dạ dày tá tràng

 Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú

 Có tiền sử dị ứng với các yếu tố như phấn hoa, nấm mốc, thức ăn, thuốc

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Thu thập bệnh án và khám bệnh: Phòng khám chuyên khoa Viện Sốt rét

Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn và phòng khám Đa khoa Trọng Nghĩa TP

Xét nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn, phòng khám Đa khoa Trọng Nghĩa, và Bộ môn Ký sinh học thuộc Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.

Chúng tôi đã lựa chọn hai phòng khám để thu thập bệnh án do có đội ngũ chuyên gia Ký sinh trùng có khả năng khám, chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan Việc này cũng đại diện cho khu vực miền Trung và miền Nam, giúp thuận tiện trong việc thu thập đủ mẫu nghiên cứu.

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2016 - tháng 4/2017

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 2.1.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tiến cứu mô tả đã phân tích tất cả các ca bệnh đáp ứng tiêu chuẩn chọn mẫu Những bệnh nhân này được đưa vào danh sách nghiên cứu và sẽ tiếp tục được xem xét trong nghiên cứu can thiệp điều trị nhằm đánh giá hiệu quả điều trị.

- Nghiên cứu can thiệp thuốc điều trị không đối chứng (tự chứng trước và sau điều trị)

- Nghiên cứu tại phòng xét nghiệm với các ấu trùng Gnathostoma spp thu được trên bệnh nhân về hình thái và sinh học phân tử

Theo nghiên cứu trước đây, thuốc ivermectin có tỷ lệ thất bại khoảng 20% Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn tỷ lệ này để ước tính tỷ lệ thất bại với độ tin cậy 95% và độ chính xác (d) là 10%.

Bảng 2.1: Cỡ mẫu tối thiểu dựa trên tỷ lệ thất bại lâm sàng ivermectine

Tỷ lệ ước tính trong quần thể (p), độ tin cậy 95% d 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384 0,10 18 35 49 61 72 81 87 92 95 96

(Nguồn: Phương pháp nghiên cứu khoa học, Scientific links, 2015)

- Khi đó, cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu đánh giá hiệu lực phác đồ thuốc ivermectine là n = 61 bệnh nhân

Để đảm bảo không xảy ra tình trạng mất mẫu và theo dõi trong nghiên cứu kéo dài, cần tăng thêm 20% số ca, do đó cỡ mẫu cuối cùng cần nghiên cứu là 73 ca.

Bệnh nhân đến khám tại hai phòng khám ký sinh trùng và đáp ứng tiêu chuẩn chọn mẫu sẽ được ghi danh, lưu trữ mẫu huyết thanh và hồ sơ bệnh án cho nghiên cứu Quá trình thu thập mẫu sẽ dừng lại khi đủ số lượng yêu cầu.

Lập danh sách bệnh nhân và tiến hành cân đo trọng lượng cơ thể để tính toán liều thuốc phù hợp Mỗi bệnh nhân sẽ được uống một liều duy nhất ivermectin theo khuyến cáo, với liều lượng 0,2mg/kg.

2.1.4.1 Mục tiêu 1: Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh do Gnathostoma spp trên người tại phía Nam Việt Nam (2016-2017)

Da và niêm mạc có thể xuất hiện các triệu chứng như ngứa, mày đay, nổi mẩn đỏ, và các vệt hay lằn đỏ trên da Ngoài ra, có thể gặp ban đỏ từng vùng hoặc theo từng đợt, cũng như hội chứng ấu trùng di chuyển hoặc ban trườn.

 Tiêu hóa: Đau thượng vị; Rối loạn tiêu hóa (phân lỏng, sệt); Chán ăn, buồn nôn

 Hô hấp: Ho (ho khan, không đờm) kéo dài; đau ngực; khó thở; khò khè

 Thị giác: Rối loạn thị lực (mờ mắt); đau cơ quanh mi mắt; nhìn mờ kiểu song thị

 Thần kinh: Đau đầu, chóng mặt; rối loạn giấc ngủ (mất ngủ)

- Đặc điểm cận lâm sàng:

 Công thức máu: Số lượng bạch cầu; số lượng bạch cầu ái toan

 Chức năng gan: SGOT, SGPT

 ELISA anti Gnathostoma: S/CO: Mật độ quang của mẫu/giá trị cắt;

Dương tính khi S/CO ≥ 1,0, Âm tính khi S/CO < 1,0

2.1.4.2 Mục tiêu 2: Đánh giá kết quả điều trị bệnh do Gnathostoma spp bằng ivermectin tại điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị bệnh nhân nhiễm giun đầu gai bằng ivermectin với liều duy nhất 0,2mg/kg cho thấy sự cải thiện rõ rệt Sau 2 tháng và 6 tháng điều trị, các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng đều giảm đáng kể, chứng minh tính hiệu quả của phương pháp này.

 Thuốc ivermectin (biệt dược Pizar) hàm lượng là 3mg, cùng số log

18003, ngày sản xuất 22/09/2015 và hạn sử dụng 22/09/2018 và nhà sản xuất là công ty cổ phần dược phẩm DAVIPharm

 Đánh giá một số tác dụng không mong muốn sau uống thuốc 48 giờ:

Chóng mặt, nhức đầu, đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy phân lỏng, đau cơ, sốt, ngứa, ban đỏ trên da

2.1.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Kỹ thuật hỏi bệnh và khám lâm sàng là những bước quan trọng trong quá trình ghi chép và sao bệnh án gốc Việc này dựa trên các thông tin được điền vào bệnh án nghiên cứu theo mẫu soạn sẵn, như được trình bày trong phụ lục 3.

- Các bác sĩ và xét nghiệm viên tham gia nghiên cứu được tập huấn thực hành lâm sàng tốt trước khi tiến hành nghiên cứu

+ Lấy 1 ống máu đông 3ml để làm huyết thanh chẩn đoán miễn dịch ELISA và xét nghiệm chức năng gan

+ Lấy 1 ống máu không đông 2ml để làm công thức máu

- Kỹ thuật miễn dịch ELISA:

Chẩn đoán ký sinh trùng Gnathostoma spp được thực hiện qua xét nghiệm huyết thanh tìm kháng thể IgG bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng bộ sinh phẩm của Công ty TNHH sản xuất thương mại hóa chất Việt Sinh Bộ kit này được cấp phép lưu hành số 73/2016/BYT-TBCT tại Việt Nam, với mã hiệu KST5-GnathoELISA, số lô 180416, ngày sản xuất 18/04/2016 và hạn sử dụng đến 18/04/2019 Bộ kit tuân thủ tiêu chuẩn VS/TCCS05 và sử dụng kháng nguyên tiết từ ấu trùng G spinigerum để phát hiện kháng thể trong huyết thanh người.

+ Phản ứng ELISA được thực hiện bán tự động với máy Human HumaReader HSSH gồm hai thành phần HumaReader HS là máy đọc ELISA

96 giếng hoàn toàn tự động, tự động đọc và tính toán, Combiwash là máy rửa và ủ ELISA 96 giếng hoàn toàn tự động

Nguyên vật liệu: o Dụng cụ:

+ Kim, ống chích vô trùng, ống nghiệm 5ml: dùng để lấy máu

+ Ống nghiệm có nút đậy 180 mm x 18 mm, máy ly tâm tốc độ 10.000 vòng/ phút

+ Micropipette loại 0 – 20 àl, 0 – 200 àl, 0 – 1000 àl: dựng trong kỹ thuật ELISA

+ Dàn máy ELISA Human HumaReader HSSH gồm có máy rửa Combiwash và ủ tự động và máy đọc ELISA hoàn toàn tự động

Qui trình làm phản ứng ELISA ( làm theo hướng dẫn của bộ kit):

 Pha loãng huyết thanh bệnh nhân, chứng âm, chứng dương theo tỷ lệ

1/400 àl với dung dịch pha loóng cú sẵn

 Nhỏ 100 àl huyết thanh, chứng õm, chứng dương vào cỏc giếng khỏng nguyên

 Ủ tự động ở nhiệt độ 37 0 C trong 1 giờ

 Rửa bằng máy tự động

 Gắn cộng hợp 100 àl vào mỗi giếng

 Ủ tự động ở nhiệt độ 37 0 C trong 1 giờ

 Rửa bằng máy tự động

 Phủ cơ chất TMB (Tetrametyl - benzidin)

 Ủ tự động ở nhiệt độ 37 0 C trong 30 phút

 Đo bằng máy ELISA Human HumaReader HSSH

Bộ sinh phẩm KST5-GnathoELISA do nhà sản xuất cung cấp có độ nhạy đạt 96,7% và độ đặc hiệu lên tới 99,1% Đặc biệt, hiện chưa có báo cáo nào về phản ứng chéo với các bệnh ký sinh trùng khác.

Kết quả xét nghiệm được xác định dựa trên mật độ quang (OD), được tính bằng tỷ số giữa OD của mẫu thử (S) và OD của ngưỡng (CO) Theo thông tin từ nhà sản xuất, giá trị CO trong bộ kit là 0,5; kết quả dương tính được ghi nhận khi tỷ số S/CO ≥ 1,0, trong khi kết quả âm tính khi S/CO < 1,0.

 Kê đơn và giải thích bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị và hẹn tái khám sau 2 tháng và 6 tháng

Bệnh nhân cần uống thuốc ivermectin với một ly nước đầy (240ml) trước hoặc sau khi ăn 2 giờ Liều lượng thuốc được tính dựa trên trọng lượng của bệnh nhân tại thời điểm uống, với liều duy nhất là 0,2 mg/kg.

Bệnh nhân được uống thuốc tại chỗ trước sự chứng kiến của Bác sĩ điều trị

Mục tiêu 3: Xác định loài Gnathostoma spp gây bệnh cho người và vật chủ

- Các mẫu ấu trùng Gnathostoma spp thu được trên người, lươn và cá được phân tích các chỉ số về hình thể xác nhận giống, loài Gnathostoma

Tất cả các mẫu ấu trùng Gnathostoma spp được thu thập từ người, lươn và cá đều được bảo quản trong cồn 70 độ, nhằm phục vụ cho việc định danh thông qua các kỹ thuật hình thái học và sinh học phân tử, bao gồm PCR và giải trình tự.

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: tháng 6/2016 – 5/2017

+ Thu mẫu ấu trùng Gnathostoma spp trên người: tại 2 phòng khám của mục tiêu 1

+ Thu mẫu giun/ấu trùng Gnathostoma spp ở cá, lươn: tại Bộ môn Ký sinh trùng ĐHYD TPHCM

Xét nghiệm định loài ấu trùng Gnathostoma spp trên các vật chủ trung gian như lươn và cá được thực hiện thông qua phương pháp hình thái học và sinh học phân tử tại Trường Đại học Y Dược TP.HCM và Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch TP.HCM.

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả: Mô tả cắt ngang tỷ lệ cá, lươn nhiễm Gnathostoma spp và hình thái học ấu trùng Gnathostoma

- Nghiên cứu tại phòng xét nghiệm: Mô tả hình thái và định danh ấu trùng

Gnathostoma bằng hình thái học và sinh học phân tử

- Tỷ lệ nhiễm Gnathostoma trên cá lóc và lươn đồng: Sử dụng công thức tính n= 2 1 / 2

 p: Tỷ lệ nhiễm G spinigerum trong điều tra trên số lươn của Lê Thị Xuân cùng cộng sự năm 2000 là 11% [20], lấy p = 0,11

 Z1-/2: Hệ số tin cậy, ứng với độ tin cậy 95% thì Z1-/2 = 1,96;

 ε: Sai số tương đối mong muốn chọn ε = 10,0% tức là ε = 0,1 Với công thức này, cỡ mẫu được tính toán là 3105 con

- Trên người: toàn bộ ấu trùng thu được

Cá lóc và lươn đồng được thu mua tại chợ N, thành phố Hồ Chí Minh, sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm để kiểm tra ấu trùng Gnathostoma spp Tất cả ấu trùng thu được sẽ được bảo quản trong cồn 70 để phục vụ cho quá trình định danh.

- Phương pháp hình thái: Tất cả ấu trùng thu được trên lươn, cá và người

- phương pháp sinh học phân tử: 10 ấu trùng được chọn ngẫu nhiên trong số những ấu trùng thu được ở lươn và cá, tất cả ấu trùng thu được ở người

- Mô tả các đặc điểm hình thái học: kích thước, hình thể và cấu tạo

- Xác định loài Gnathostoma spp bằng phương pháp sinh học phân tử trên cơ sở gen đích Cox-1 và xác định loài bằng giải trình tự gen 5.8S rRNA-ITS2

- So sánh sự tương đồng phân tử với đoạn gen chuẩn trên Genbank và lập cây phả hệ

2.2.5 Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.5.1 Kỹ thuật ép mô: Dùng để phát hiện ấu trùng Gnathostoma spp trong nội tạng của cá, lươn

Nội tạng cá và lươn được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt giữa hai miếng kính kích thước 20 x 20 cm Sau đó, ép nhẹ hai mặt kính lại để quan sát mô dưới ánh sáng đèn Nếu phát hiện nang ấu trùng, tiến hành phẫu tích bằng kính hiển vi soi nổi Olympus với độ phóng đại 4x để tách ấu trùng ra.

2.2.5.2 Kỹ thuật tiêu cơ: Dùng để phát hiện ấu trùng Gnathostoma spp trong cơ của cá và lươn

Thịt cá và lươn được cắt nhỏ và ngâm trong dung dịch pepsin - HCl 1% trong 24 giờ để tiêu hóa mô Sau đó, mẫu được ly tâm để thu cặn, và ấu trùng giun được quan sát và thu hồi dưới kính hiển vi soi nổi Olympus với độ phóng đại 4x.

+ Các ấu trùng Gnathostoma spp được thu thập lại, đặt vào trong đĩa petri và dùng kính hiển vi soi nổi loại Olympus để đánh giá kết quả

+ Mỗi ấu trùng sau khi đo các kích thước để xác định phân loại theo hình thái học được thu vào tuýp riêng, giữ cố định trong cồn ethanol 70%

2.2.5.3 Xác định loài bằng hình thái học

Dựa trên các đặc điểm: Kích thước, hình thể, cấu tạo đầu giun [52] [77] [90]

Hình thể và cấu tạo đầu:

- Là giun tròn có rảnh cổ giữa thân và đầu

- Miệng có 2 môi hình bán nguyệt

Bảng 2.5: Kích thước ấu trùng Gnathostoma spp [24][77]

Kích thước (mm) Min- Max trung bình Ấu trùng thu được ở lươn

Chiều rộng 0,16 – 0,23 0,19 Ấu trùng thu được ở người

Bảng 2.6: Số lượng và hình dạng của gai trên đầu ấu trùng [77] Đặc điểm G spinigerum G hispidum G doloresi

Số hàng gai trên đầu 4 4 4

Số gai trên mỗi hàng > 40