Cá tra là một mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam và cũng là sản phẩm thủy sản được nhiều thị trường trên thế giới ưa chuộng. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá tra gặp rất nhiều khó khăn do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu không ổn định, việc nuôi với mật số cao làm cho các bệnh trên cá tra thường xuyên xảy ra hơn. Các bệnh như gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiellla ictaluri và bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila là các bệnh gây thiệt hại nhiều nhất về kinh tế cho người nuôi cá tra, bệnh đã lây lan và có chiều hướng gia tăng.Kháng sinh là phương pháp điều trị được sử dụng, chi phí đầu tư cho kháng sinh trong vốn sản xuất đang ngày càng nhiều, cùng với việc sử dụng kháng sinh các chủng vi khuẩn kháng thuốc phát triển và trở nên rất khó điều trị. Để giải quyết vấn đề này, thực khuẩn thể là một phương pháp tiềm năng. Thực khuẩn thể có tính đặc hiệu tấn công vào vi khuẩn đích nên không làm hại các vi sinh vật có lợi trong môi trường xung quanh, không gây bệnh cho con người hay động vật khác; thực khuẩn thể cũng có khả năng đồng tiến hóa với vi khuẩn nên có thể kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn kháng phage; thực khuẩn thể có thể được sản xuất bằng cách lên men vi khuẩn trong môi trường giá rẻ và chỉ cần một lượng nhỏ để bắt đầu . Các nghiên cứu về thực khuẩn thể đang cho những kết quả rất tốt ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên ở quy mô in vivo thì chưa được nhiều. Nhằm để đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể trong việc kiểm soát bệnh gan thận mủ trên cá tra ở quy mô in vitro, kết quả sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu ở quy mô lớn hơn và tương lai việc sản xuất các chế phẩm thực khuẩn thể trị bệnh trên thủy sản nói chung sẽ được phát triển mạnh mẽ, trước là để giảm thiệt hại do dịch bệnh, sau là có thể đẩy lùi vấn đề nhức nhối hiện nay: “vi khuẩn kháng kháng sinh”.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM THỰC KHUẨN THỂ KIỂM SOÁT BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Sinh viên thực : Mã số sinh viên : Giảng viên hướng dẫn : TPHCM tháng năm 2021 LỜI CẢM ƠN Đề Cương Luận Văn báo cáo mơ tả chi tiết định làm, cách thức thực (phương pháp, thời gian) kết dự kiến mong muốn đạt Đây “tấm bảng đồ đường” đắc lực sinh viên cần chuẩn bị chu đáo trước trình làm luận văn Đề cương luận văn Luận văn tốt nghiệp sản phẩm tạo ra, đúc kết kiến thức từ trình học hỏi suốt năm ngồi ghế nhà trường Làm đề cương luận văn trình giúp sinh viên nhìn nhận lại kiến thức học ứng dụng để giải vấn đề thực tế Bên cạnh giúp sinh viên rèn luyện kỹ lên kế hoạch, quản lý thời gian, kỹ thuyết trình phản biện Trong suốt trình thực đề cương luận văn em nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cơ, gia đình bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Đại học Bách Khoa đồng hành hỗ trợ em suốt trình thực đề cương Nhân em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô thuộc trường Đại Học Bách Khoa ln tận tình bảo cho chúng em tận tình học sống, đặc biệt quý thầy cô Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh học Cảm ơn gia đình bên con, yêu thương Cảm ơn bạn bè ln hỗ trợ MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CFU LB MOI TE TSA TSB PCR PFU Colony-forming unit Lysogeny broth multiplicity of infection Tris and EDTA Tryptone Soya Agar Tryptic soy broth Polymerase chain reaction Plaque-forming unit DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG Chuyên đề luận văn CHƯƠNG PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài Cá tra mặt hàng xuất chủ lực Việt Nam sản phẩm thủy sản nhiều thị trường giới ưa chuộng Tuy nhiên, năm gần đây, việc sản xuất tiêu thụ cá tra gặp nhiều khó khăn giá bấp bênh, thị trường xuất không ổn định, việc nuôi với mật số cao làm cho bệnh cá tra thường xuyên xảy Các bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiellla ictaluri bệnh xuất huyết Aeromonas hydrophila bệnh gây thiệt hại nhiều kinh tế cho người nuôi cá tra, bệnh lây lan có chiều hướng gia tăng Kháng sinh phương pháp điều trị sử dụng, chi phí đầu tư cho kháng sinh vốn sản xuất ngày nhiều, với việc sử dụng kháng sinh chủng vi khuẩn kháng thuốc phát triển trở nên khó điều trị Để giải vấn đề này, thực khuẩn thể phương pháp tiềm Thực khuẩn thể có tính đặc hiệu cơng vào vi khuẩn đích nên khơng làm hại vi sinh vật có lợi mơi trường xung quanh, không gây bệnh cho người hay động vật khác; thực khuẩn thể có khả đồng tiến hóa với vi khuẩn nên kiềm hãm phát triển vi khuẩn kháng phage; thực khuẩn thể sản xuất cách lên men vi khuẩn môi trường giá rẻ cần lượng nhỏ để bắt đầu Các nghiên cứu thực khuẩn thể cho kết tốt quy mơ phịng thí nghiệm Tuy nhiên quy mơ in vivo chưa nhiều Nhằm để đánh giá hiệu chế phẩm thực khuẩn thể việc kiểm soát bệnh gan thận mủ cá tra quy mô in vitro, kết tảng cho nghiên cứu quy mô lớn tương lai việc sản xuất chế phẩm thực khuẩn thể trị bệnh thủy sản nói chung phát triển mạnh mẽ, trước để giảm thiệt hại dịch bệnh, sau đẩy lùi vấn đề nhức nhối nay: “vi khuẩn kháng kháng sinh” 1.2 Đối tượng 1.2.1 Cá tra Chuyên đề luận văn Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài cá da trơn, nước ngọt, sống chủ yếu đồng Sông Cửu Long, mặt hàng xuất thứ hai, chiếm 23.2% tổng xuất thủy sản nước, tạo 8.6 tỷ đô la Mỹ cho kinh tế quốc dân năm Tuy nhiên năm gần việc sản xuất xuất cá tra gặp nhiều vấn đề khó khăn giá bấp bênh, thị trường xuất không ổn định đặc biệt năm 2020 giá cá tra xuống thấp dịch bệnh COVID-19 số bệnh cá tra khiến người nuôi phải chịu lỗ nặng nề Ba tác nhận gây bệnh thường xuất cá tra vi khuẩn (Edwardsiellla ictaluri, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnare, ), kí sinh trùng vi nấm Trong tác nhân gây thiệt hại to lớn Edwardsiellla ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết [1] Trong năm gần dịch bệnh bùng phát lây lan diện rộng cần phải tìm phương pháp có hiệu nhanh chóng để đẩy lùi bệnh giảm thiệt hại cho người nông dân 1.2.2 Bệnh gan thận mủ Bệnh gan thận mủ bệnh lý thường gặp cá tra gây tổn thất nặng nề cho người nuôi, thường xảy vào mùa lũ khoảng tháng đến tháng Bệnh có khả xuất đến lần chu kì ni, xuất hầu hết giai đoạn phát triển cá tra gây thiệt hại nặng nề giai đoạn giống từ 10-50% [2] Khi bệnh cá có biểu bên ngồi khơng rõ ràng, tách đàn, bơi lờ đờ, bỏ ăn tỉ lệ chết cao xuất nhiều đốm trắng đục kích cở 1-3 mm gan, thận tỳ tạng [1] Hình 1 Nội tạng cá tra bị gan thận mủ Chuyên đề luận văn 1.2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri – Nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ Vi khuẩn E ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterbacteriaceae, Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria ngành Proteobacteria [3] Loài vi khuẩn E.ictaluri tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho nhiều loài cá ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy sản tồn giới [4] E.ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước biến đổi từ 1.2-1.5x 0.4-0.6 µm [5] Vi khuẩn E ictaluri có khả di động yếu, không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, có lên men mơi trường glucose Chúng phát triển tốt 28 oC tăng trưởng chậm không tăng trưởng 37 oC [6] 1.2.4 Thực khuẩn thể Thực khuẩn thể: Bacteriophages (còn gọi phage) định nghĩa virus lây nhiễm vi khuẩn Thực khuẩn thể phát cách độc lập Frederick Twort Felix d’Hérelle vào đầu kỉ XX [7],[8] Các phage thiết kế điều trị, nhiên phổ biến kháng sinh lúc nên liệu pháp phage dần trở nên bị quên lãng, nghiên cứu thực khuẩn thể tiếp tục Liên Xô cũ ( Georgia Nga) Ba Lan [9] Dưới kính hiển vi phage có cấu trúc đa dạng phức tạp Phần lớn phage biết virus có đuôi thuộc Caudovirales Chúng cấu tạo lớp vỏ capsid bao gồm protein lipoprotein bảo vệ vật liệu di truyền DNA hay RNA với Đi nhận dạng vật chủ thơng qua thụ thể sợi (Hình 1.1) [9] Chun đề luận văn Hình Mơ thực khuẩn thể thuộc Caudoviriales Thực khuẩn thể nghiên cứu có tên G7 phân lập từ gan cá tra thu thập từ chợ thành phố Hồ Chí Minh Đặc điểm vịng sinh tan: có tâm vịng ngồi mờ, vỏ capsid thực khuẩn thể G7 có hình khối đa diện khơng có đi, kích thước sấp sỉ 48 nm Thực khuẩn thể có chu kì xâm nhiễm kéo dài 55 phút với hệ số nhân 71.7 ± 3.77 [10] Hình Hình chụp thực khuẩn thể G7 kính hiển vi điện tử 1.3 Mục tiêu đề tài Đề tài: “Đánh giá hiệu chế phẩm thực khuẩn thể kiểm soát bệnh gan thận mủ cá tra với mục tiêu: xác định kết liên quan đến hiệu chế phẩm phage để tạo sở cho việc tính tốn liều lượng phage phù hợp việc kiểm 10 Chuyên đề luận văn Trước thử nghiệm, số lượng lớn cá tra ( n=10) chọn ngẫu nhiên giải phẫu để xác nhận khơng có có mặt A hydrophila, E ictaluri ký sinh trùng Quy trình thực cá tuân thủ nghiêm ngặt theo quy định y tế chăm sóc thao tác động vật thí nghiệm 2.3 Bố trí thí nghiệm 260 cá tra khỏe mạnh chia làm 21 nhóm đặt thùng nhựa chứa nước có dung tích 50 lít ni 30 oC, 20 con/ bể Mỗi nghiệm thức thực lần Sơ đồ bố trí thí nghiệm thể hình minh họa: B3P4 B4P4 B5P4 B6P4 B7P4 B3P5 B4P5 B5P5 B6P5 B7P5 16 Chuyên đề luận văn B3P6 B4P6 B5P6 B6P6 B7P6 B3P0 B4P0 B5P0 B6P0 B7B0 3 17 Chuyên đề luận văn B0P0 Hình 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Ký hiệu B viết tắt Bacteria (vi khuẩn), ký hiệu P viết tắt Phage, số nồng độ vi khuẩn phage xử lý Bảng Bảng thiết kế thí nghiệm Nhóm B3P4 B4P4 B5P4 B6P4 B7P4 B3P5 B4P5 B5P5 B6P5 B7P5 B3P6 B4P6 B5P6 B6P6 B7P6 B3P0 B4P0 B5P0 B6P0 B7P0 B0P0 Vi khuẩn (CFU/ mL) 1.1 × 103 1.1 × 104 1.1 × 105 1.1 × 106 1.1 × 107 1.1 × 103 1.1 × 104 1.1 × 105 1.1 × 106 1.1 × 107 1.1 × 103 1.1 × 104 1.1 × 105 1.1 × 106 1.1 × 107 1.1 × 103 1.1 × 104 1.1 × 105 1.1 × 106 1.1 × 107 Phage (PFU/ g) 1.6 × 104 1.6 × 104 1.6 × 104 1.6 × 104 1.6 × 104 1.6 × 105 1.6 × 105 1.6 × 105 1.6 × 105 1.6 × 105 1.6 × 106 1.6 × 106 1.6 × 106 1.6 × 106 1.6 × 106 0 0 0 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế phẩm thực khuẩn thể lên cá tra tiến hành vòng 14 ngày Với cơng việc ngày sau: • Ngày 1: Cho cá ăn cho phun phage theo mật độ thiết kế nhiên lúc chưa bổ sung vi khuẩn 18 Chuyên đề luận văn • Ngày 2: Cá cho lây nhiễm vi khuẩn với mật độ thiết kế: 10 3, 104, 105, 106, 107 CFU/mL 24 • Từ ngày đến ngày 14: Cho cá ăn ngày lần với viên thức ăn có phun phage Cơng việc bắt đầu lúc 6h sáng ngày tiến hành thu 1.4 mL mẫu nước từ bể số 63 bể để xác định có mặt phage nước Sau tiếng bắt đầu kiểm tra nhiệt độ, pH nước nuôi cá Nhiệt độ pH phải dao động từ: 26 - 28 oC 7,25 - 7,5 Sau 12 tiếng, tiếp tục cho cá ăn cử ngày, trước ghi cho cá ăn ghi lại số liệu nhiệt độ, pH Tỷ lệ tử vong cá ghi lại ngày trước lúc cho ăn buổi chiều Lượng nước thêm vào ngày khoảng 20-30% Gan thận cá chết sử dụng để phân lập vi khuẩn mơi trường TSA sau PCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định lần chủng vi khuẩn gây bệnh [14] 2.4 Thời gian dự kiến thực đề tài Từ 18/1 đến 3/2 : Tiến hành khảo sát tất thí nghiệm phịng thí nghiệm khoa Thủy sản thuộc Đại học Cần Thơ Sau báo cáo kết với giáo viên hướng dẫn viết báo cáo luận văn hoàn chỉnh 19 Chuyên đề luận văn CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Tính tốn tỷ lệ tử vong tích lũy ngày cá Hằng ngày ghi lại số lượng cá chết theo bảng minh họa nghiệm thức xử lý phage với nồng độ 1.6 × 104 PFU/mg tính tốn tỷ lệ tử vong tích lũy Bảng Bảng ghi lại số liệu cá chết Nghiệm thức Ngày 10 11 12 13 14 B3P4 B4P4 B5P4 3 B6P4 B7P4 Tỷ lệ tử vong tích lũy bể tính cơng thức: Có tổng cộng bể cho nghiệm thức nên sau tính tốn bể ta chia để lấy giá trị trung bình Vẽ đồ thị so sánh tỷ lệ tử vong tích lũy sau 14 ngày nghiệm thức : không xử lý phage , xử lý phage với mật độ 1.6 × 104 , 1.6 × 105, 1.6 × 106 Mục đích thí nghiệm để đánh giá hiệu chế phẩm thực khuẩn thể điều trị bệnh gan thận mủ Trong mơi trường có có mặt vi khuẩn mà khơng có phage, tỷ lệ tử vong tích lũy cá ngày cao, có phage tỷ lệ tử vong giảm xuống chứng minh hiệu chế phẩm phage, đồng thời giúp ta lựa chọn mật độ thực khuẩn thể hiệu điều trị 3.2 Xác định mật độ thực khuẩn thể nước 20 Chuyên đề luận văn Mục đích: để kiểm tra liệu thực khuẩn phun vào viên thức ăn phần lớn có bám lên viên thức ăn hay không, giải phóng mơi trường nước 1.4 mL mẫu nước ngày lấy từ bể số 63 bể trước cho cá ăn bữa sáng khoảng Ly tâm 1000 vòng/ phút oC phút, lấy dịch pha loãng chuẩn độ theo trình tự phương pháp Plaque assay để xác định mật độ phage nước Plaque assay: phương pháp phổ biến thường sử dụng để định lượng thực khuẩn thể 100 µL dịch lọc 200 µL vi khuẩn ni qua đêm vào ống nghiệm chứa TSB 0.5% agar (đã nấu chảy giữ 37 oC) sau votex đổ hỗn hợp lên đĩa thạch LB 1.5% agar Ủ qua đêm 30 oC đếm số vịng sinh tan hình thành đĩa thạch xác định PFU/mL dịch lọc 3.3 Giải phẫu cá- Phân lập vi khuẩn Cá sau chết giải phẫu lấy gan, thận để kiểm tra có mặt vi khuẩn Tiến hành lấy dịch từ nốt mủ gan, thận trải lên môi trường TSA ủ 28 oC 24 Các khuẩn lạc lấy để kiểm tra phản ứng PCR 3.4 3.4.1 Phản ứng PCR Chiết tách Acid nucleic Vi khuẩn nuôi tăng sinh (24 giờ) ống nghiệm chứa mL môi trường LB Chuyển 1.5 mL dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf thêm vào 100 µL dung dịch TE (10nM Tris HCl 1mM EDTA) Đun 95 oC 15 phút Làm lạnh nước đá Ly tâm 14 000 vòng/ phút phút Rút phần dung dịch đo xác định hàm lượng DNA máy so mày quan phổ bước sóng 260 nM theo cơng thức : Hàm lượng DNA (µg/mL) = Giá trị đo ỏ 260 nm x 50 x độ pha loãng 3.4.2 Khuyếch đại DNA 21 Chuyên đề luận văn Thành phần hóa học thực phản ứng PCR gồm: 10 X PCR buffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 μM dNTPs, 5U Taq DNA polymerase, 0.4 μM mồi EiFd-1, 0.4 μM mồi EiRs1, 20 ng DNA mẫu nước Chu kỳ nhiệt thực phản ứng 95 oC phút, 90 oC 30 giây, 53 oC 45 giây, 72 oC 30 giây Lặp lại chu kỳ 30 lần, 72 oC 10 phút [15] 3.5 Điện di Quá trình điện di thực với dung dịch TAE 0.5X thạch chứa 1.5% agarose Đọc kết dựa vào thang DNA 1kb plus để xác định trọng lượng phân tử Trọng lượng phân tử DNA vi khuẩn E ictaluri cần phát 407 bp 3.6 Xử lý số liệu Dữ liệu phân tích phần mềm SPSS Statistics 20 ANOVA áp dụng để xác định khác biệt đáng kể khả sống sót cá nhiễm E ictaluri sau nhận không nhận liệu pháp phage Trong tất phân tích, giá trị xác suất nhỏ 0,05 coi có ý nghĩa thống kê (p