pseudomonas flourescens và khả năng tạo độc tố mosquitocidal exotoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  SEMINAR PSEUDOMONAS FLOURESCENS VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘC TỐ MOSQUITOCIDAL EXOTOXIN GVHD: PHẠM MINH NHỰT NHÓM SVTH: 1. NGUYỄN THỊ NHƯ YẾN (MSSV: O851110308) 2. NGUYỄN THỊ THANH TRANG (MSSV: 0851110262) 3. CAO TUẤN VŨ (MSSV: 0851110303) 4. LÊ HÒANG THÚY OANH (MSSV: 0851110168) 5. TRẦN TẤN LỢI (MSSV: 0851110123) 6. ĐINH QUANG TRUNG (MSSV: 08511102 ) -THÁNG 04/2011- MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHUƠNG I. TỔNG QUAN TÁC NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC PSEUDOMONAS FLOURESCENS 1.1. Lịch sử phát hiện 1.2. Phân loại 1.3. Đặc điểm 1.3.1. Đặc điểm chung 1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc 1.3.3. Đặc điểm sinh hóa 1.4. Cấu trúc 1.4.1. Cấu trúc tế bào 1.4.2. Cấu trúc phân tử 1.5. Yếu tố độc lực 1.6. Cơ chế gây bệnh 1.7. Bệnh và các triệu chứng bệnh 1.8. Các biện pháp phòng và xử lý bệnh CHUƠNG II: CÁC PHUƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 2.1. Phương pháp truyền thống (Phương pháp nuôi cấy) 2.1.1. Nhuộm gram 2.1.2. Oxygen relationships test 2.1.3. Thử nghiệm KIA/TSI và khả năng sinh H 2 S 2.1.4. Thử nghiệm khả năng phát triển ở 4 0 C trong môi truờng YE agar 2.1.5. Thử nghiệm biến duỡng citrate trên môi truờng Koser’s Citrate Broth 2.1.6. Thử nghiệm nitratase 2.1.7. Thử nghiệm gelatinase 2 2.1.8. Thử nghiệm tính di động 2.1.9. Thử nghiệm tạo sắc tố pyvertine và pyocianine 2.2. Phương pháp hiện đại 2.2.1. Phuơng pháp PCR-ribotyping 2.2.2. Phuơng pháp DAS-ELISA 2.2.3. Định lượng bắng phương pháp QC-PCR CHUƠNG III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 3 LỜI MỞ ĐẦU Pseudomonas fluorescens là một vi khuẩn gram âm, hình que, là môt loại vi khuẩn thường thấy trong vật chất hữu cơ phân rã như lá mục nát và đất. Trong thực phẩm, Pseudomonas fluorescens là một chất gây hư hỏng phổ biến, đặc biệt là nó họat động tích cực ở nhiệt độ thấp như trong tủ lạnh. Các sản phẩm sữa đặc biệt dễ bị ô nhiễm Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas fluorescens đuợc quan tâm và gây lo lắng trong môi truờng bệnh viện vì các vi khuẩn này được biết là chống lại nhiều loại thuốc kháng sinh và các sản phẩm chất khử trùng. Ở những bệnh nhân có hệ thống miễn dịch khỏe, các vi khuẩn này thường có thể tồn tại ôn hòa trên hoặc trong cơ thể;nhưng ở những người bị tổn thương hệ thống miễn dịch, họ có thể bị nguy hiểm. Tuy vậy, loài Pseudomonas fluorescens lại có khả năng tạo ra nhiều loại kháng sinh đặc biệt như Mupirocin, đã được chứng minh là hiệu quả trong điều trị một số lọai bệnh về da, tai, và các rối loạn mắt. Ngoài ra, Pseudomonas fluorescens còn đuợc ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sinh học. Nghiên cứu thực hiện trên Pseudmonas fluorescens đã cho thấy loại vi khuẩn này có lợi trong xử lý sinh học chống lại một số chủng gây bệnh ở thực vật. Pseudomonas fluorescens ức chế việc sản sinh bào tử của lòai nấm gây bệnh thực vật. Nấm như Alternaria cajani và Curvularia lunata phát triển trên bề mặt thực vật đã gây ra bệnh và làm chết cây. Cây đuợc xử lý với Pseudomonas fluorescens có thể ngăn ngừa các loại nấm phát triển và sản sinh bào tử. 4 CHUƠNG I. TỔNG QUAN TÁC NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC PSEUDOMONAS FLOURESCENS 1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN  Tên gọi: - Từ Pseudomonas có nghĩa là “đơn vị giả” , đuợc chuyển từ tiếng Hy Lạp pseudo( Tiếng Hy Lạp:ψευδο có nghĩa là sai) và monas (Latin:monas, Hy Lạp: μονάς/μονάδα là một đơn vị duy nhất). Từ này đã đuợc sớm sử dụng trong lịch sử vi sinh vật học quy vào vi sinh vật. Thuật ngữ "đơn nguyên" đã được sử dụng trong lịch sử đầu tiên của vi sinh vật học để chỉ các sinh vật đơn bào. Tên fluorescens vì trong vi khuẩn này có chứa sắc tố hùynh quang (fluorescent) đuợc gọi là pyoverdin (cách gọi truớc đây là fluorescein), là một loại siderophore (tiếng Hy Lạp có nghĩa là vận chuyển sắt).  Lịch sử phát hiện và nghiên cứu - Năm 1786, Otto Friedrich Müller, từ Copenhagen, đã phân loại vi khuẩn này và đặt tên là pseudomonads. - 1895 Migula phát hiện loài P.flourescens - Những chủng P.fIuorescens thuờng đuợc tìm thấy trên bề mặt cây trồng, thực vật phân rã, trong đất và nuớc (Bradbury, 1986). - P.flourescens đuợc sử dụng trong những năm gần đây đuợc áp dụng trong công nghiệp rất đa dạng, bao gồm cấu tạo đá hạt nhân (tạo tuyết và giảm tối thiểu sự đóng suơng gây hại cho cây trồng) (Warren, 1987; Lindlow và Panopoulos, 1988; Wilson và Lindlow, 1993), và trong việc chống lại những bệnh gây hại cho cây trồng(Wilson and Lindlow, 1993). - Ternstrom và cộng sự (1993) đã tiến hành nghiên cứu và thấy rằng P.fluorescens chiếm 55.6% trong tống các vi khuẩn đuợc phân lập ờ trong sữa thô. Gennarl và Dragotto (1992) tìm thấy có 84% P.fluorescens hiện diện trong các mẫu sữa thô. - Hầu hết những chủng của lòai P.flourescens không có khả năng phát triển trong nhiệt độ cơ thể nguời(Palleroni, 1992) và đều hạn chế trong việc xâm lấn và gây bệnh trên sinh 5 vật. P.flourescens cũng gây bệnh cơ hội trên những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu, nhưng nó chỉ liên quan nhỏ đến khả năng miễn dịch riêng. (Chamberland và cộng sự, 1992; OECD, 1997). - Năm 1999 và 2000, George và cộng sự có vài nghiên cứu đánh giá yếu tố gây bệnh và độc tố của P. fIuorescens trên chuột, không có dấu hiệu gây bệnh và sinh độc tố. Những nghiện cứu này cho thấy P. fIuorescens không gây nhiễm nguy hại đến con nguời và là nguồn sản xuất enzyme an tòan trong thực phẩm. 1.2. PHÂN LOẠI - Giới: Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gamma Proteobacteria - Bộ: Pseudomonadales - Họ: Pseudomonadaceae - Giống: Pseudomonas - Lòai: Pseudomonas fluorescens - Các lọai chủng: + ATCC 13525 + CCUG 1253 + CCEB 546 + CFBP 2102 + CIP 69.13 + DSM 50090 + JCM 5963 + LMG 1794 + NBRC 14160 + NCCB 76040 + NCIMB 9046 + NCTC 10038 + NRRL B-14678 + VKM B-894 6 Hình 1.1. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.3. ĐẶC ĐIỂM 1.3.1. Đặc điểm chung - Pseudomonas fluorescens là một vi khuẩn gram âm hình que,môt loại vi khuẩn thường thấy trong vật chất hữu cơ phân rã như lá mục nát và đất. P. fluorescens có một hay nhiều cực tiên mao- một cấu trúc giống như sợi tóc nhỏ được sử dụng để di động. Như tên gọi của nó, chúng có chứa sắc tố huỳnh quang màu vàng xanh. Nó có sự chuyển hóa vô cùng linh họat. Nó là loại vi khuẩn kỵ khí, nhưng nhiều chủng có khả năng sử dụng Nitrate thay cho oxy như là chất nhận điện tử cuối cùng trong suốt quá trình hô hấp của tế bào. - Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là từ 25-30 0 C. cũng có thể tồn tại ở nhiệt độ thấp tới 0 0 C.Nó có khả năng oxy hóa, không lên men đuờng. - Lee et al. phát triển một cảm biến sinh học sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764. Các chủng P. fluorescens có thể sử dụng xyanua là nguồn nitơ duy nhất của nó. Khi phân hủy sinh học biến dạng xyanua nó tạo xyanat, mà sau đó được chia nhỏ tạo thành ammonia và carbon dioxide. Đo các cảm biến sinh học của Lee dựa theo các sản phẩm phụ của các phản ứng này có liên quan với sự phân hủy của xyanua. Trong khi phương pháp này có tính chọn lọc hơn so với các phương pháp trước đây, vẫn còn một phương pháp đo gián tiếp của hợp chất này độc hại. 7 - Những vi khuẩn này là những nguồn phổ biến gây hư hỏng thực phẩm và chúng có một số ứng dụng tiềm năng đang đuợc quan tâm nghiên cứu trong môi trường phòng thí nghiệm. - Pseudomonas fluorescens và những chủng Pseudomonas khác tuơng tự sản xuất enzym có khả năng làm nóng lipit and protein. Enzym này là nguyên nhân làm sữa bị hư tạo ra vị đắng, làm vỡ casein, đặc quánh lại thành sợi làm cho sản phẩm bị nhớt và protein đông lại. - Loài Pseudomonas có hiệu quả chống nấm mốc gây bệnh như ở táo và lê. Cần có những nghiên cứu xa hơn nữa về Pseudomonas fluorescens để xác định tính hiệu quả của nó nhằm thay thế cho thuốc diệt nấm hoá học. 1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc - Khuẩn lạc P.fluorescens có 3 dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng hoang dại phân lập từ đất,nuớc; (2) khuẩn lạc to, tròn, trơn, rìa phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có dạng nhầy. - Trong điều kiện in-vtro, ở môi truờng broth, các vi khuẩn này sắp xếp một cách ngẫu nhiên; ở môi truờng agar thì kết lại thành một mạng luới thô, các vi khuẩn này có tiết ra một chất nhầy để liên kết các vi khuẩn lại với nhau. - Khuẩn lạc trong môi truờng YE agar có màu trắng kem, có mùi cá do tạo ra trimethylamine. Khuẩn lạc tạo ra chất pyoverdine làm cho môi truờng dần chuyển sang màu vàng nâu. Trong môi truờng XLD, khuẩn lạc có màu đỏ không có tâm đen. Hình 1.2. Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi truờng YE agar 8 1.3.3. Đặc điểm sinh hóa - Một số đặc điểm sinh hóa chính: không lên men glucose; có khả năng thủy giải gelatin; khử nitrate (+); oxidase (+); khử nitare (+); sản xuất hydrogen sulphide từ thiosulphate; sản xuất 2-keto-D-gluconate acid từ D-gluconate; sử dụng glycerol, succinate, L-arabinose,formate, acetate, lactose, xylose, mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose. 9 Hình 1.3. Biểu đồ minh họa các đặc điểm khác nhau của khỏang 10.0% các thể phân lập này của loài Peudomonas với thí nghiệm test 43 đặc điểm khác nhau. Thể 10 [...]... RNA và 5736 protein Các trình tự bộ gen của P fluorescens SBW25 vẫn đang trong tiến trình xác định Hình 1.10 Cấu trúc phân tử của Pseudomonas Fluorescens 16 1.5 YẾU TỐ ĐỘC LỰC  Mosquitocidal exotoxin: - Exotoxin của vi sinh vật bao gồm loài Pseudomonas đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi cũng như lòai sâu bọ cánh phấn P fluorescens gây chết lòai muỗi ở giai đọan ấu trùng, nhộng, và theo... nghiệm tạo sắc tố pyvertine và pyocianine a Phuơng pháp tiến hành 26 - Cấy ria khuẩn lạc thử nghiệm lên hai đĩa Petri môi truờng thạch Pseudomonas Agar F và Pseudomonas Agar P Ủ ở 250C ít nhất là 3 ngày Soi dĩa môi truờng Pseudomonas Agar F duới tia UV (260nm) - Bẻ vỡ một mảnh môi truờng Pseudomonas Agar P bằng que thủy tinh, cho vào ống nghiệm chứa nuớc cất, lắc mạnh bằng vortex để hòa đều sắc tố Lọc... vật chalcone synthases và đuợc bắt đầu từ sự chuyển gen theo chiều ngang Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp 2,4-DAPG Hình 1.5 Cơ chế kháng nấm bệnh gây hại của 2,4-DAPG 12 Hình 1.6 Một số kháng sinh do Pseudomonas Fluorescens sản xuất - Bằng cách tác động vào cấu trúc gen mã hóa, một số dòng vi khuẩn đột biến có khả năng gia tăng luợng kháng sinh sinh học vào môi truờng tăng khả năng ức chế sự phát triển... fluorescens gây chết lòai muỗi ở giai đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố như của P aeruginosa Migula đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat động trên protein tan huyết Exotoxin này của P.fluorescens cũng hoạt động tuơng tự trên họ nhà bay - Dịch formulation... hoi, các vi khuẩn này nhiễm vào các mạch máu, gây nhiễm khuẩn ,tạo điều kiện dẫn đến các biến chứng như sốc 1.7 BỆNH VÀ CÁC TRIỆU CHỨNG BỆNH 1.7.1 Đối với người - Gây sốt và ớn lạnh, P fluorescens là gây nhiều bệnh lạ ở nguời và làm tổn thuơng hệ miễn dịch của bệnh nhân (chẳng hạn nạn nhân ung thư) - Mặc dù Pseudomonas fluorescens thường có một mức độ độc tính thấp, nhưng vào năm 1997 có bốn bệnh nhân... hai chủng Pf-5 và PfO-1 của Pseudomonas fluorescens đã đuợc xác định hòan tòan bộ gen của chúng - Bộ gen P fluorescens Pf-5 (2005) có chứa một nhiễm sắc thể tròn có 7,074,893 bp và chứa 63,3% GC Nó chứa 87 RNA và 6137 protein 5,7% của bộ gen của nó góp phần vào sự trao đổi chất thứ cấp lớn nhất của Pseudomonas Các bộ gen của Pseudomonas fluorescens PfO-1 có một nhiễm sắc thể dài 43841 Mbp và chứa 60,5%... thêm vào ống 5-10ml chloroform Hút lớp chloroform vào một ống nghiệm khác và bổ sung 3ml nuớc cất Nhỏ một giọt NH2SO4 Quan sát phản ứng màu b Đọc kết quả - Soi dĩa môi truờng Pseudomonas Agar F duới tia UV (260nm).P.fluorescens tiết sắc tố pyoverdine phát hùynh quang khuếch tán trong agar dọc theo đuờng cấy - Nhưng khi cấy P.fluorescens vào môi truờng Pseudomonas Agar P, P.fluorescens không tiết sắc tố. .. Enteric agar và XLD agar để phân lập họ Enterobacteriaceae và giống Pseudomonas, ủ 37 0C, 24h Các môi truờng này là môi truờng chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, nhưng các giống khác nhau có khuẩn lạc có hình thái đặc trưng khác nhau trên môi truờng này Ví dụ, trên môi truờng XLD, E.coli có khuẩn lạc dẹt, màu vàng, một vài chủng còn không mọc đuợc Salmonella cho khuẩn lạc màu đỏ tâm đen Shigella và Pseudomonas. .. là (-) khi giấy lọc không đổi màu Pseudomonas spp có phản ứng oxidase (+) Hình 2.2 P.fluorescens cho kết quả (+), giấy lọc có màu đỏ tía 2.1.3 Thử nghiệm KIA/TSI a Nguyên tắc - Môi truờng KIA (Kligler Iron Agar) và môi truờng TSI (Triple Sugar Iron Agar) đuợc sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S của chủng VSV -Về nguồn... nghiệm khả năng sinh H2S đuợc thực hiện đồng thời do thành phần môi truờng có chứa sodium thiosulphate VSV khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H 2S Khí H2S tạo ra sẽ đuợc phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H 2S và ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate hiện diện trong môi trừơng b Phuơng pháp tiến hành 25 - Môi truờng TSI hay KIA đuợc pha chế, hấp khử trùng và chuyển . DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  SEMINAR PSEUDOMONAS FLOURESCENS VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘC TỐ MOSQUITOCIDAL. và 2000, George và cộng sự có vài nghiên cứu đánh giá yếu tố gây bệnh và độc tố của P. fIuorescens trên chuột, không có dấu hiệu gây bệnh và sinh độc tố.