Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và monacolin k của vi nấm monascus purpureus

HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Xuân Hồng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013... HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Xuân Hồng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ

ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM

MONASCUS PURPUREUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Xuân Hồng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ

ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM

MONASCUS PURPUREUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TS NGUYỄN HỮU PHÚC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy TS Nguyễn Hữu Phúc đã tận

tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy - Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư

Phạm Tp Hồ Chí Minh đã hết lòng chỉ bảo truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm của mình trong suốt thời gian theo học

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến, cô Thanh, anh Vinh, anh Dân

cùng các bạn trong Viện Sinh học Nhiệt đới đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành

các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp Cao học Vi sinh vật K22 -Trường Đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh cùng những người bạn thân đã luôn ở bên để động

viên, an ủi, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Con xin cảm ơn Gia đình thân yêu đã luôn khích lệ, dành tình cảm yêu thương

và chăm sóc cho con trong suốt những năm qua

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi có sự hỗ trợ từ

Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Phúc Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề

tài này trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu khoa học nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo Ngoài ra đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Xuân Hồng

M ỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN 2

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Khái quát về nấm MONASCUS 9

1.1.1 Lịch sử sử dụng gạo men đỏ 9

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Monascus 10

1.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất của nấm Monascus sp 12

1 2 Khái quát về sắc tố 12

1.2.1 Cấu tạo phân tử 13

1.2.2 Đặc tính sắc tố 14

1.2.3 Tình hình sử dụng màu thực phẩm 15

1.2.4 Các phương pháp lên men tạo sắc tố 16

1.3 Khái q uát về MONACOLIN K 23

1.3.1 Giới thiệu 23

1.3.2 Cấu tạo phân tử 24

1.3.3 Tính chất của Monacolin K 25

1.3.4 Tác dụng của Monacolin K trong chữa trị các bệnh tim mạch 25

1.3.5 Quá trình lên men sản xuất Monacolin K 26

1 4 Khái quát về CITRININ 27

1.4.1 Cấu trúc phân tử 27

1.4.2 Đặc tính sinh học 27

1.4.3 Đặc tính vật lý và hóa học của citrinin 28

1.4.4 Vấn đề an toàn sức khỏe khi sử dụng các sản phẩm từ nấm men đỏ 28

1.5 Khái quát về CHOLESTEROL 29

1.5.1 Giới thiệu 29

1.5.2 Quá trình sinh tổng hợp cholesterol 29

1.5.3 Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch 30

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước [5] 31

1.6.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 31

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 34

2.1.1 Giống vi sinh vật và nguyên liệu: 34

2.1.2 Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng 34

2.1.3 Hóa chất: 34

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ: 35

2.2 Nội dung thí nghiệm 35

2.3 Phương pháp thí nghiệm: 36

2.3.1 Quan sát hình thái nấm Monascus 36

2.3.2 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật 37

2.3.3 Xác định độ ẩm ban đầu của gạo và độ ẩm gạo sau lên men 38

2.3.4 Phương pháp lên men thu nhận chế phẩm 38

2.3.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K 39

2.3.6 Phương pháp trích ly sắc tố 41

2.3.7 Xác định hàm lượng Monacolin K 41

2.3.8 Đặc tính sinh học của chế phẩm gạo men đỏ: 42

2.3.9 Khảo sát độ bền của dịch màu 46

2.3.10 Phương pháp xác định độc tính aflatoxin, độ nhiễm khuẩn của bột gạo men đỏ 46

2.3.11 Phương pháp tách chiết citrinin 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48

3.1 Đặc điểm chủng MONASCUS PURPUREUS N.212 48

3.1.1 Hình dạng khuẩn lạc 48

3.1.2 Cấu trúc tế bào 49

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố 51

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 51

3.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu 52

3.2.3 Ảnh hưởng của số lượng giống 54

3.2.4 Ảnh hưởng của pH 56

3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0,5% 58

3.2.6 Ảnh hưởng của nguồn carbon 60

3.2.7 Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol 62

3.2.8 Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae 63

3.3 Đường chuẩn MONACOLIN K 64

3.4 K ết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp

MONACOLIN K 64

3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 64

3.4.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu 65

3.4.3 Ảnh hưởng của số lượng giống 67

3.4.4 Ảnh hưởng của pH 68

3.4.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0.5% 69

3.4.6 Ảnh hưởng của nguồn carbon 70

3.4.7 Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol 71

3.4.8 Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae 73

3.5 Đặc tính sinh học của chể phẩm gạo men đỏ 74

3.5.1 Định tính enzyme của chế phẩm 74

3.5.2 Định lượng hoạt tính enzyme của chế phẩm 75

3.6 Kết quả khảo sát độ bền sắc tố với ánh sáng theo thời gian 77

3.7 Đánh giá chất lượng sản phẩm 78

3.7.1 Độc tính aflatoxin [49] 78

3.7.2 Tổng vi khuẩn hiếu khí 78

3.8 H iệu suất của các phương pháp tách chiết CITRININ 78

3.8.1 Phần trăm Monacolin K còn lại: 78

3.8.2 Phần trăm citrinin còn lại: 79

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

PHỤ LỤC 89

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AU/g Đơn vị hấp thụ/ gam

HDL High- dendity lipoprotein

HDL – c High- dendity lipoprotein cholesterol

HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase KHV Kính hiển vi

KL Khuẩn lạc

LDL Low- dendity lipoprotein

LDL – c Low- dendity lipoprotein cholesterol

M purpureus Monascus purpureus

MSG Monosodium glutamate

MT Môi trường

MVA Mevinolinic

RYR Red Yeast Rice

sp Species

WHO World Health Organization

MỞ ĐẦU

Gạo men đỏ (Red yeast rice – Hồng khúc) - một sản phẩm truyền thống đã được sử dụng rộng rãi từ nhiều thế kỷ qua ở các nước Châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…)

và một số nước Đông Nam Á trong sản xuất thực phẩm nhằm làm chất bảo quản, chất tạo màu … cũng như trong y học cổ truyền [5], [13] Nó được xem là sản phẩm không độc hại,

có ích trong điều trị chứng đau bụng khó tiêu, chứng tiêu chảy, mụn nhọt, tan vết bầm, giải rượu, yếu sinh lý, làm tăng sự lưu thông máu và kích hoạt lá lách, dạ dày…

Mặc dù đã được sử dụng khá lâu nhưng gạo men đỏ vẫn không gây được sự chú ý của các nước phương Tây Mãi cho đến năm 1976, khi phát hiện của Giáo sư Akira Endo

(Nhật Bản) về Monacolin K (Lovastatin, Mevinolin) một sản phẩm trao đổi chất của chủng

Monascus purpureus Went, hoạt chất này có giá trị cao giúp giảm cholesterol thông qua

việc ức chế enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-CoA

reductase) trong cơ thể, góp phần vào việc ngăn chặn và đẩy lùi được các bệnh liên quan đến tim mạch [38]

Trong khi đó, bệnh tim mạch được xếp vào loại tử vong cao nhất ở hầu hết các quốc gia, các khu vực và các châu lục trên thế giới, không chỉ tập trung ở người già, ở các nước phát triển mà bệnh còn phổ biến trong giới trẻ và ngay cả những nước đang phát triển Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới bệnh tim mạch vẫn gây nên 17,5 triệu cái chết trong đó các nước đang phát triển chiếm 8-9 triệu (2006) Còn tại Việt Nam, chỉ tính riêng ở Viện Tim Mạch Việt Nam và Viện Tim Mạch TP HCM mỗi năm có hàng ngàn bệnh nhân đến khám và điều trị [37], [42]

Thông thường, để điều trị bệnh tim mạch nói trên người ta có thể dùng nhiều thuốc

khác nhau bán trên thị trường, phổ biến là thuốc statin được sản xuất từ Aspergillus tereus

[38] Việc sử dụng các thuốc này mắc phải nhược điểm là giá thành khá cao bên cạnh đó còn để lại nhiều phản ứng phụ như: nhiễm độc gan do thuốc, nguy cơ gây bệnh tiểu đường,

gây dị ứng… Chính vì vậy, chế phẩm Monascus rất được quan tâm sản xuất rộng rãi trên

thế giới để làm nên chất tạo màu hoặc chất bảo quản thay cho nitrat gây độc hại đồng thời làm nguyên liệu sản xuất thuốc làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất chống cao huyết áp… hạn chế và ngăn ngừa các bệnh tim mạch

Trên cơ sở đó, Chúng tôi tập trung nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG

TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS”

nhằm mục tiêu: Tìm hiểu một số điều kiện ảnh hưởng khả năng tạo sắc tố và hàm lượng

Monacolin K của chủng Monascus purpureus N.212 và tìm cách nâng cao hàm lượng Monacolin K trong sản phẩm sau lên men

Nghiên cứu gồm các nội dung sau đây:

Xác định một số đặc điểm phát triển của M purpureus N.212 trên môi trường PGA

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng sắc tố và hàm lượng Monacolin K tạo

thành của chủng M purpureus N.212 trên môi trường gạo Tài nguyên

Xác định phương pháp khử citrinin trong sản phẩm gạo men đỏ tạo thành

Xác định hoạt tính một số enzyme của chế phẩm gạo men đỏ

Đánh giá chất lượng sản phẩm về mặt sinh học và hóa lý

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 K hái quát về nấm MONASCUS

1.1.1 L ịch sử sử dụng gạo men đỏ

Gạo men đỏ là loại dược thảo và thực phẩm truyền thống Trung Quốc, được lên men

từ gạo hấp với nấm Monascus, chế phẩm này được sử dụng cách đây hàng ngàn năm [9], [40] Hiện nay trên thế giới, Monascus có nhiều tên gọi khác nhau như Red Yeast, Red yeast

rice, Red Mould Rice, Red Mould (USA), Beni-Koji, Red-Koji, Ang-Khak (Nhật Bản), Hung-Chu, Hong Qu, Angkak, Zhitai (Trung Quốc), Rotschimmelreis (Châu Âu)… Cách đây 600 năm, Lý Thời Trân nhà y dược cổ đại Trung Hoa đã giới thiệu gạo men đỏ trong Bổn Thảo Cương Mục và trong các quyển sách khác của mình Trong những tài liệu này, ông đã mô tả khá đầy đủ, chính xác về giá trị dược lý và chức năng của gạo men đỏ [40]

Năm 1884, Van Tieghem đã phân lập Monascus đầu tiên từ khoai tây và từ bánh hạt lanh và xác định là Monascus rubber Năm 1895, Went cũng phân lập được Monascus

purpureus từ gạo bị mốc đỏ lấy tại các chợ ở Java, Indonesia Sau đó hàng loạt các chủng

Monascus đã được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới [3]

Năm 1976, Giáo sư Akira Endo (Nhật Bản) đã tìm thấy Monacolin K từ các sản

phẩm trao đổi chất của chủng Monascus purpureus Went Hoạt chất này có thể làm giảm

cholesterol trong máu, phát hiện này đã gây sự chú ý trên toàn thế giới Công trình của Giáo

sư Endo đã cho thấy, Monacolin K có thể ức chế sự tổng hợp của cholesterol trong cơ thể

bằng cách ức chế cạnh tranh với enzyme HMG-CoA reductase Nhờ vậy nó được dùng để

ngăn ngừa và chữa trị các căn bệnh có liên quan đến hệ thống tim mạch và não bộ [12], [40]

Năm 1985, Giáo sư Goldstein và Brown (Mỹ) đã khám phá ra sự chuyển hóa của Monacolin K trong việc ức chế sự tổng hợp của cholesterol trong cơ thể Nhờ vào công trình, họ đã được trao giải Nobel Sinh lý và Y khoa Và sau đó, gạo nấm men đỏ trở nên nổi tiếng và phổ biến toàn cầu [3], [46]

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của Monacolin K [41]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Monascus

1.1.2.1 Phân loại học

Dựa theo khóa phân loại nấm mốc, Monascus được định danh như sau :

- Ngành: Ascomycota

- Lớp: Plectomycetes

- Bộ: Eurotiales

- Họ: Monascaceae

- Giống: Monascus

Theo Hawksworth và Pit (1983) Monascus được chia thành 3 loài gồm: M pilosus,

M ruber, M purpureus Theo Martinkova và Patakova (1999), Pattanagul và cộng sự

(2007) cho rằng Monascus được chia thành 6 loài: M pilosus, M ruber, M purpureus, M

floridanus, M pallens, M sanguineus. Ngoài ra, còn có một số loài mới được tìm thấy nhưng lại không có liên quan đến thực phẩm (Canno và cộng sự, 1995) [13]

1.1.2.1 Đặc điểm sinh học

 Hình dạng khuẩn lạc

- Đường kính khuẩn lạc: 40mm (sau một tuần nuôi trên môi trường PGA)

- Hình thái: phẳng, bẹt, tỏa tròn

- Bề mặt: Có tơ mỏng

- Màu sắc: từ đỏ cam chuyển thành đó tía

rồi thành màu đỏ nâu

- Mặt sau: màu đỏ tía

- Quan sát dưới kính hiển vi (ở 300

C)

+ Đặc tính nổi bật: những nang nấm có vách mỏng tồn tại nhiều, dạng tròn tồn tại những bào tử đính Chất màu được tạo thành tạo hệ sợi dưới dạng tinh thể hình chữ nhật, có kích thước tương đối đồng đều

+ Các nang nấm vách mỏng được sản sinh trên những sợi nấm ngắn giống cuống, các nang nấm trưởng thành chứa đầy các bào tử nang rời rạc, không gắn chặt nhưng các nang nấm vẫn có thể nhìn thấy rõ ràng khi còn non

+ Bào tử mang hình cầu có kích thước 5 - 6 µm x 3,5 – 4 µm, phẳng, không màu

1.1.2.2 Đặc tính sinh học

Theo Van Tieghem, M purpureus và M ruber thuộc cùng một loài Đây là loại nấm mốc hoại sinh phát triển trên tinh bột, thức ăn lên men trong các sản phẩm chế biến từ sữa

(Went và cộng sự, 1895; Julova và cộng sự, 1996) Chúng có khả năng tạo ra sự lên men

cellobiose, maltose, fructose và glucose nhưng không lên men đường saccharose (Ying và

cộng sự, 1987) M purpureus là loại nấm sợi, cơ quan sinh sản của chúng là nang bào tử

Các nang bào tử này thường có hình cầu (đường kính 5 µm) hoặc là hình trứng (đường kính 6x5 µm) Ở giai đoạn còn non hệ sợi nấm có màu trắng, tuy nhiên các hệ sợi này phát triển nhanh thành màu hồng đậm và sau cùng là màu vàng – cam Trong quá trình phát triển,

Monascus làm môi trường chuyển sang acid yếu và tạo ra dưới lớp môi trường một màu đỏ

thẫm khi nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Monascus là top = 300C-370C, nhiệt độ tối đa tmax = 450C, nhiệt độ hấp nhất tmin = 150C-180C

Hình 1.2 Khuẩn lạc M purpureus

1.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất của nấm Monascus sp

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Monascus tạo ra nhiều chất trao đổi sơ cấp

và thứ cấp được trình bày trong bảng 1.1 gồm có:

Bảng 1.1 Các sản phẩm trao đổi chất có giá trị của Monascus [5]

1 Enzyme thủy phân

ngoại bào Amylase, glucoamylase…

2 Sản phẩm trao đổi

sơ cấp

Rượu (Ethanol) Các acid ( acid citric, sucinic, gluconic, oxalic…) Hỗn hợp các ester

3 Các sản phẩm trao

đổi chất thứ cấp

Nhóm sắc tố (đỏ, vàng, cam) Monacolin

γ – amino –butyric acid (GABA) Chất chống oxi hóa tự nhiên (flavonoid,…) Citrinin

Chất làm giảm đường huyết và một số chất chưa định danh có hoạt tính sinh học

1.2 K hái quát về sắc tố

Màu tự nhiên đang có nhu cầu rất lớn đặc biệt để sử dụng trong thực phẩm và đồ uống Trong năm 2007, thị trường màu thực phẩm tự nhiên được có giá trị từ 465 triệu USD, tăng 4,6% so với năm 2004 (Mapari và cộng sự, 2010) Các chất màu tự nhiên và màu được chiết xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật Sản xuất bột màu sử dụng các vi sinh vật có lợi thế nhất định so với các nguồn khác như chúng có thể được phát triển nhanh chóng trong điều kiện kiểm soát cao Kết quả là năng suất cao của các sắc tố Ngoài

Monascus nhiều vi sinh vật khác có khả năng sản xuất sắc tố như các loài của chi

Paecilomyces, Serratia, Cordyceps, Streptomyces và Penicillium (Gunasekaran và

Poorniammal, 2008) Nhưng Monascus đã thu hút sự chú ý đặc biệt khi chúng tạo được

nhiều màu sắc khác nhau đặc biệt là sắc tố đỏ và vàng là những màu thực phẩm mong muốn [13]