Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và monacolin k của vi nấm monascus purpureus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Xuân Hồng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Xuân Hồng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Nguyễn Hữu Phúc tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, động viên suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy - Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh hết lòng bảo truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm suốt thời gian theo học Tôi xin gởi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến, cô Thanh, anh Vinh, anh Dân bạn Viện Sinh học Nhiệt đới tận tình giúp đỡ, hỗ trợ hoàn thành thí nghiệm đề tài Tôi xin cảm ơn tất thành viên lớp Cao học Vi sinh vật K22 -Trường Đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh người bạn thân bên để động viên, an ủi, giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài Con xin cảm ơn Gia đình thân yêu khích lệ, dành tình cảm yêu thương chăm sóc cho suốt năm qua LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học có hỗ trợ từ Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Phúc Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố nghiên cứu khoa học trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi phần tài liệu tham khảo Ngoài đề tài sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả, quan tổ chức khác thể phần tài liệu tham khảo Tác giả luận văn Nguyễn Thị Xuân Hồng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát nấm MONASCUS 1.1.1 Lịch sử sử dụng gạo men đỏ 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Monascus 10 1.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất nấm Monascus sp 12 1.2 Khái quát sắc tố .12 1.2.1 Cấu tạo phân tử 13 1.2.2 Đặc tính sắc tố .14 1.2.3 Tình hình sử dụng màu thực phẩm 15 1.2.4 Các phương pháp lên men tạo sắc tố .16 1.3 Khái quát MONACOLIN K 23 1.3.1 Giới thiệu .23 1.3.2 Cấu tạo phân tử 24 1.3.3 Tính chất Monacolin K 25 1.3.4 Tác dụng Monacolin K chữa trị bệnh tim mạch .25 1.3.5 Quá trình lên men sản xuất Monacolin K .26 1.4 Khái quát CITRININ 27 1.4.1 Cấu trúc phân tử 27 1.4.2 Đặc tính sinh học 27 1.4.3 Đặc tính vật lý hóa học citrinin 28 1.4.4 Vấn đề an toàn sức khỏe sử dụng sản phẩm từ nấm men đỏ 28 1.5 Khái quát CHOLESTEROL 29 1.5.1 Giới thiệu .29 1.5.2 Quá trình sinh tổng hợp cholesterol 29 1.5.3 Ảnh hưởng cholesterol bệnh tim mạch .30 1.6 Tình hình nghiên cứu nước [5] 31 1.6.1 Tình hình nghiên cứu nước 31 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 34 2.1.1 Giống vi sinh vật nguyên liệu: 34 2.1.2 Các môi trường nghiên cứu sử dụng 34 2.1.3 Hóa chất: .34 2.1.4 Thiết bị dụng cụ: .35 2.2 Nội dung thí nghiệm 35 2.3 Phương pháp thí nghiệm: 36 2.3.1 Quan sát hình thái nấm Monascus .36 2.3.2 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật .37 2.3.3 Xác định độ ẩm ban đầu gạo độ ẩm gạo sau lên men 38 2.3.4 Phương pháp lên men thu nhận chế phẩm 38 2.3.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp sắc tố Monacolin K 39 2.3.6 Phương pháp trích ly sắc tố 41 2.3.7 Xác định hàm lượng Monacolin K 41 2.3.8 Đặc tính sinh học chế phẩm gạo men đỏ: .42 2.3.9 Khảo sát độ bền dịch màu .46 2.3.10 Phương pháp xác định độc tính aflatoxin, độ nhiễm khuẩn bột gạo men đỏ .46 2.3.11 Phương pháp tách chiết citrinin 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 3.1 Đặc điểm chủng MONASCUS PURPUREUS N.212 .48 3.1.1 Hình dạng khuẩn lạc 48 3.1.2 Cấu trúc tế bào .49 3.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp sắc tố .51 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 51 3.2.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu 52 3.2.3 Ảnh hưởng số lượng giống .54 3.2.4 Ảnh hưởng pH 56 3.2.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ 0,5% 58 3.2.6 Ảnh hưởng nguồn carbon .60 3.2.7 Ảnh hưởng việc bổ sung glycerol 62 3.2.8 Ảnh hưởng việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae 63 3.3 Đường chuẩn MONACOLIN K .64 3.4 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp MONACOLIN K .64 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 64 3.4.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu 65 3.4.3 Ảnh hưởng số lượng giống .67 3.4.4 Ảnh hưởng pH 68 3.4.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ 0.5% 69 3.4.6 Ảnh hưởng nguồn carbon .70 3.4.7 Ảnh hưởng việc bổ sung glycerol 71 3.4.8 Ảnh hưởng việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae 73 3.5 Đặc tính sinh học chể phẩm gạo men đỏ 74 3.5.1 Định tính enzyme chế phẩm 74 3.5.2 Định lượng hoạt tính enzyme chế phẩm 75 3.6 Kết khảo sát độ bền sắc tố với ánh sáng theo thời gian 77 3.7 Đánh giá chất lượng sản phẩm 78 3.7.1 Độc tính aflatoxin [49] .78 3.7.2 Tổng vi khuẩn hiếu khí 78 3.8 Hiệu suất phương pháp tách chiết CITRININ 78 3.8.1 Phần trăm Monacolin K lại: 78 3.8.2 Phần trăm citrinin lại: .79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC 89 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT AU/g Đơn vị hấp thụ/ gam HDL High- dendity lipoprotein HDL – c High- dendity lipoprotein cholesterol HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc LDL Low- dendity lipoprotein LDL – c Low- dendity lipoprotein cholesterol M purpureus Monascus purpureus MSG Monosodium glutamate MT Môi trường MVA Mevinolinic RYR Red Yeast Rice sp Species WHO World Health Organization MỞ ĐẦU Gạo men đỏ (Red yeast rice – Hồng khúc) - sản phẩm truyền thống sử dụng rộng rãi từ nhiều kỷ qua nước Châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…) số nước Đông Nam Á sản xuất thực phẩm nhằm làm chất bảo quản, chất tạo màu … y học cổ truyền [5], [13] Nó xem sản phẩm không độc hại, có ích điều trị chứng đau bụng khó tiêu, chứng tiêu chảy, mụn nhọt, tan vết bầm, giải rượu, yếu sinh lý, làm tăng lưu thông máu kích hoạt lách, dày… Mặc dù sử dụng lâu gạo men đỏ không gây ý nước phương Tây Mãi năm 1976, phát Giáo sư Akira Endo (Nhật Bản) Monacolin K (Lovastatin, Mevinolin) sản phẩm trao đổi chất chủng Monascus purpureus Went, hoạt chất có giá trị cao giúp giảm cholesterol thông qua việc ức chế enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase) thể, góp phần vào việc ngăn chặn đẩy lùi bệnh liên quan đến tim mạch [38] Trong đó, bệnh tim mạch xếp vào loại tử vong cao hầu hết quốc gia, khu vực châu lục giới, không tập trung người già, nước phát triển mà bệnh phổ biến giới trẻ nước phát triển Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hàng năm giới bệnh tim mạch gây nên 17,5 triệu chết nước phát triển chiếm 8-9 triệu (2006) Còn Việt Nam, tính riêng Viện Tim Mạch Việt Nam Viện Tim Mạch TP HCM năm có hàng ngàn bệnh nhân đến khám điều trị [37], [42] Thông thường, để điều trị bệnh tim mạch nói người ta dùng nhiều thuốc khác bán thị trường, phổ biến thuốc statin sản xuất từ Aspergillus tereus [38] Việc sử dụng thuốc mắc phải nhược điểm giá thành cao bên cạnh để lại nhiều phản ứng phụ như: nhiễm độc gan thuốc, nguy gây bệnh tiểu đường, gây dị ứng… Chính vậy, chế phẩm Monascus quan tâm sản xuất rộng rãi giới để làm nên chất tạo màu chất bảo quản thay cho nitrat gây độc hại đồng thời làm nguyên liệu sản xuất thuốc làm giảm lượng cholesterol máu, chất chống cao huyết áp… hạn chế ngăn ngừa bệnh tim mạch Trên sở đó, Chúng tập trung nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS” nhằm mục tiêu: Tìm hiểu số điều kiện ảnh hưởng khả tạo sắc tố hàm lượng Monacolin K chủng Monascus purpureus N.212 tìm cách nâng cao hàm lượng Monacolin K sản phẩm sau lên men Nghiên cứu gồm nội dung sau đây: Xác định số đặc điểm phát triển M purpureus N.212 môi trường PGA Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến lượng sắc tố hàm lượng Monacolin K tạo thành chủng M purpureus N.212 môi trường gạo Tài nguyên Xác định phương pháp khử citrinin sản phẩm gạo men đỏ tạo thành Xác định hoạt tính số enzyme chế phẩm gạo men đỏ Đánh giá chất lượng sản phẩm mặt sinh học hóa lý CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát nấm MONASCUS 1.1.1 Lịch sử sử dụng gạo men đỏ Gạo men đỏ loại dược thảo thực phẩm truyền thống Trung Quốc, lên men từ gạo hấp với nấm Monascus, chế phẩm sử dụng cách hàng ngàn năm [9], [40] Hiện giới, Monascus có nhiều tên gọi khác Red Yeast, Red yeast rice, Red Mould Rice, Red Mould (USA), Beni-Koji, Red-Koji, Ang-Khak (Nhật Bản), Hung-Chu, Hong Qu, Angkak, Zhitai (Trung Quốc), Rotschimmelreis (Châu Âu)… Cách 600 năm, Lý Thời Trân nhà y dược cổ đại Trung Hoa giới thiệu gạo men đỏ Bổn Thảo Cương Mục sách khác Trong tài liệu này, ông mô tả đầy đủ, xác giá trị dược lý chức gạo men đỏ [40] Năm 1884, Van Tieghem phân lập Monascus từ khoai tây từ bánh hạt lanh xác định Monascus rubber Năm 1895, Went phân lập Monascus purpureus từ gạo bị mốc đỏ lấy chợ Java, Indonesia Sau hàng loạt chủng Monascus phát nhiều nước giới [3] Năm 1976, Giáo sư Akira Endo (Nhật Bản) tìm thấy Monacolin K từ sản phẩm trao đổi chất chủng Monascus purpureus Went Hoạt chất làm giảm cholesterol máu, phát gây ý toàn giới Công trình Giáo sư Endo cho thấy, Monacolin K ức chế tổng hợp cholesterol thể cách ức chế cạnh tranh với enzyme HMG-CoA reductase Nhờ dùng để ngăn ngừa chữa trị bệnh có liên quan đến hệ thống tim mạch não [12], [40] Năm 1985, Giáo sư Goldstein Brown (Mỹ) khám phá chuyển hóa Monacolin K việc ức chế tổng hợp cholesterol thể Nhờ vào công trình, họ trao giải Nobel Sinh lý Y khoa Và sau đó, gạo nấm men đỏ trở nên tiếng phổ biến toàn cầu [3], [46] Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Monacolin K [41] 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Monascus 1.1.2.1 Phân loại học Dựa theo khóa phân loại nấm mốc, Monascus định danh sau : - Ngành: Ascomycota - Lớp: Plectomycetes - Bộ: Eurotiales - Họ: Monascaceae - Giống: Monascus Theo Hawksworth Pit (1983) Monascus chia thành loài gồm: M pilosus, M ruber, M purpureus Theo Martinkova Patakova (1999), Pattanagul cộng (2007) cho Monascus chia thành loài: M pilosus, M ruber, M purpureus, M floridanus, M pallens, M sanguineus Ngoài ra, có số loài tìm thấy lại liên quan đến thực phẩm (Canno cộng sự, 1995) [13] 1.1.2.1 Đặc điểm sinh học  Hình dạng khuẩn lạc - Đường kính khuẩn lạc: 40mm (sau tuần nuôi môi trường PGA) 10 - Hình thái: phẳng, bẹt, tỏa tròn - Bề mặt: Có tơ mỏng - Màu sắc: từ đỏ cam chuyển thành tía thành màu đỏ nâu - Mặt sau: màu đỏ tía - Quan sát kính hiển vi (ở 300C) Hình 1.2 Khuẩn lạc M purpureus + Đặc tính bật: nang nấm có vách mỏng tồn nhiều, dạng tròn tồn bào tử đính Chất màu tạo thành tạo hệ sợi dạng tinh thể hình chữ nhật, có kích thước tương đối đồng + Các nang nấm vách mỏng sản sinh sợi nấm ngắn giống cuống, nang nấm trưởng thành chứa đầy bào tử nang rời rạc, không gắn chặt nang nấm nhìn thấy rõ ràng non + Bào tử mang hình cầu có kích thước - µm x 3,5 – µm, phẳng, không màu 1.1.2.2 Đặc tính sinh học Theo Van Tieghem, M purpureus M ruber thuộc loài Đây loại nấm mốc hoại sinh phát triển tinh bột, thức ăn lên men sản phẩm chế biến từ sữa (Went cộng sự, 1895; Julova cộng sự, 1996) Chúng có khả tạo lên men cellobiose, maltose, fructose glucose không lên men đường saccharose (Ying cộng sự, 1987) M purpureus loại nấm sợi, quan sinh sản chúng nang bào tử Các nang bào tử thường có hình cầu (đường kính µm) hình trứng (đường kính 6x5 µm) Ở giai đoạn non hệ sợi nấm có màu trắng, nhiên hệ sợi phát triển nhanh thành màu hồng đậm sau màu vàng – cam Trong trình phát triển, Monascus làm môi trường chuyển sang acid yếu tạo lớp môi trường màu đỏ thẫm nuôi cấy nhiệt độ thích hợp cho phát triển Monascus top = 300C-370C, nhiệt độ tối đa tmax = 450C, nhiệt độ hấp tmin = 150C-180C 11 1.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất nấm Monascus sp Trong trình sinh trưởng phát triển Monascus tạo nhiều chất trao đổi sơ cấp thứ cấp trình bày bảng 1.1 gồm có: Bảng 1.1 Các sản phẩm trao đổi chất có giá trị Monascus [5] Enzyme thủy phân ngoại bào Amylase, glucoamylase… Rượu (Ethanol) Sản phẩm trao đổi sơ cấp Các acid ( acid citric, sucinic, gluconic, oxalic…) Hỗn hợp ester Nhóm sắc tố (đỏ, vàng, cam) Monacolin Các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp γ – amino –butyric acid (GABA) Chất chống oxi hóa tự nhiên (flavonoid,…) Citrinin Chất làm giảm đường huyết số chất chưa định danh có hoạt tính sinh học 1.2 Khái quát sắc tố Màu tự nhiên có nhu cầu lớn đặc biệt để sử dụng thực phẩm đồ uống Trong năm 2007, thị trường màu thực phẩm tự nhiên có giá trị từ 465 triệu USD, tăng 4,6% so với năm 2004 (Mapari cộng sự, 2010) Các chất màu tự nhiên màu chiết xuất từ thực vật, động vật vi sinh vật Sản xuất bột màu sử dụng vi sinh vật có lợi định so với nguồn khác chúng phát triển nhanh chóng điều kiện kiểm soát cao Kết suất cao sắc tố Ngoài Monascus nhiều vi sinh vật khác có khả sản xuất sắc tố loài chi Paecilomyces, Serratia, Cordyceps, Streptomyces Penicillium (Gunasekaran Poorniammal, 2008) Nhưng Monascus thu hút ý đặc biệt chúng tạo nhiều màu sắc khác đặc biệt sắc tố đỏ vàng màu thực phẩm mong muốn [13] 12 Màu Monascus tách chiết ethanol từ gạo lên men với nấm Monascus sau thu nhận tinh để sử dụng phổ biến việc nhuộm màu thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Theo nhiều tác giả, có 10 sắc tố tạo từ Monascus chưa có giải thích rõ ràng chúng (Shin cộng sự, 1998) [48] Trong nhiều năm nhà khoa học chứng minh sắc tố Monascus phân thành nhóm sắc tố: vàng - da cam - đỏ, sắc tố đỏ quan trọng sử dụng chất màu thực phẩm chất thay nitrate bảo quản 1.2.1 Cấu tạo phân tử Sắc tố Monascus tạo từ nhiều thành phần liên kết với chia làm nhóm sắc tố chính: - Rubropunctanin (C21H22O5) Monascorubrin (C23H26O5) cho màu cam - Ankaflavin (C23H30O5) Monascin (C21H26O5) cho màu vàng - Rubropunctamine (C21H23NO4) Monoscorubramine (C23H27NO4) cho màu đỏ thẫm Một màu có cấu trúc phân tử khác chiều dài mạch hợp chất béo Các sắc tố sinh môi trường chìm hay bán rắn lượng sắc tố tạo phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy chúng 1.2.1.1 Màu cam:  Rubropunctatin (C21H22O5) R= C5H11  Monascotubrine (C23H26O5) R= C7H15 1.2.1.2 Màu vàng 13  Ankaflavin (C23H30O5) – R= C7H15  Monascin (C21H26O5) - R= C5H11 1.2.1.3 Màu đỏ  Rubropunctamine(C21H23NO4)  Monascorubramine (C23H27NO4) R= C7H15 R= C5H11 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử sắc tố Monascus sp (theo Sweeny (1993) Sự ổn định màu ảnh hưởng điều kiện: acid, nhiệt độ, ánh sáng, oxygen, độ ẩm thời gian Các sắc tố thêm vào xúc xích, bánh nướng giữ ổn định 92-95% suốt tháng với nhiệt độ 40C (Fabre cộng sự, 1993) [21] Mặt khác có hai cách để giữ cho màu ổn định là: màu hòa tan cồn, màu hòa tan dầu [13] 1.2.2 Đặc tính sắc tố Ứng dụng Monascus mục đích nhuộm màu có từ lâu đời Trung Quốc Monascus an toàn không gây độc tố, ảnh hưởng đáng kể đến việc gia tăng tuần hoàn máu, giúp cải thiện chức lách giảm mức độ mỡ thể Màu Monascus thu nhận từ trình lên men gạo, đậu nành thông qua trình tách chiết Đó màu thực phẩm tự nhiên có chất lượng tốt với đặc tính cụ thể: - Màu Monascus có nguồn gốc tự nhiên, tốt cho sức khỏe 14 - Dãy pH rộng từ - 11 - Màu bền ánh sáng thường, chống lại nhiệt độ cao, tan nước tan hoàn toàn cồn, chất béo - Không bị ảnh hưởng ion kim loại như: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+ không bị ảnh hưởng oxy hóa khử - Màu thích hợp với sản phẩm thịt, sữa, kem, nước trái cây, thức ăn biển… 1.2.3 Tình hình sử dụng màu thực phẩm 1.2.3.1 Các nước phát triển Ở nước phát triển việc sử dụng chất màu vào thực phẩm quy định chặt chẽ Người ta sớm nhận biết nhược điểm sử dụng màu tổng hợp nên việc sử dụng hạn chế quy định chất màu rõ rệt nằm danh mục chất màu cho phép, bên cạnh họ đầu tư cho việc nghiên cứu phát triển chất màu có nguồn gốc tự nhiên: thực vật, vi sinh vật… 1.2.3.1 Ở Việt Nam Nước ta đầu tư mạnh vào việc phát triển công nghiệp thực phẩm, danh sách mặt hàng thực phẩm ngày nhiều, phong phú đa dạng mẫu mã đặc biệt màu sắc đẹp phù hợp, dễ dàng gây ý người tiêu dùng bên cạnh đồng thời nâng cao chất lượng giá trị sản phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho người tiêu dùng Tuy vậy, tình hình sử dụng màu thực phẩm nước chưa kiểm soát chặt chẽ có danh mục tiêu quy định màu dùng cho thực phẩm, điều ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người kinh tế nhà nước Ngày 04/4/1998 Bộ Y tế ban hành định QĐ 867/1998/QĐ-BYT “Danh mục phẩm màu phép sử dụng thực phẩm” có mười chất tự nhiên mười chất màu tổng hợp phép sử dụng giới hạn tối đa cho phép thực phẩm Tuy nhiên, nhiều nhà sản xuất sử dụng màu không nằm danh mục quy định, chí biết độc hại lợi nhuận họ coi thường sức khỏe người tiêu dùng Theo điều tra Viện dinh dưỡng phẩm màu không đạt tiêu chuẩn cao Hiện doanh nghiệp, xí nghiệp nhỏ lẻ, cá thể, thủ công đặc biệt quán hàng rong tỷ lệ 15 sử dụng màu danh mục cao Chính điều nên hàng năm tồn nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hàng ngàn người phải điều trị bệnh chúng gây nên 1.2.4 Các phương pháp lên men tạo sắc tố 1.2.4.1 Sản xuất sắc tố đỏ Monascus phương pháp lên men bán rắn Lên men bán rắn phương pháp lên men truyền thống, dùng thực phẩm cổ truyền phương Đông từ nhiều kỷ qua (Pandey, 1992; Pandey cộng sự, 2001) Tuy nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng lên men bán rắn tạo sắc tố nấm Monascus purpureus sp [4] a Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp thay đổi từ 25 - 370C (Lin, 1991) Trong trường hợp M purpureus CBS 109.7, nhiệt độ tối thích, cao thấp cho phát triển là: 340C, 460C 180C (Rasheva,1998) Trong hình thành sắc tố nhiệt độ cao thích hợp so với nhiệt độ thấp [26], [28] b Độ ẩm: [13], [28] Độ ẩm thông số quan trọng, Lotong Suwanarit (1990) sản xuất gạo đỏ chứa túi nhựa plastic, sắc tố tạo độ ẩm ban đầu thấp 26-32% Nếu lượng độ ẩm ban đầu cao làm tăng hoạt tính enzyme glucoamylase glucose nhanh chóng tạo ra, nồng độ glucose cao đến 120g/l trình tạo sắc tố bị ức chế Từ trình lên men rượu từ đường xảy Năm 1991, nuôi cấy môi trường gạo hấp, Johns Stuart (1993) nhận thấy lượng độ ẩm ban đầu tốt cho trình tạo sắc tố 56% Theo báo cáo Aporn Wongwicharn hội nghị Kỹ Thuật Sinh học lần thứ 13 Thái Lan (2000) cho nuôi cấy Monascus môi trường bã khoai mì độ ẩm ban đầu tốt cho trình tạo sắc tố 60% Một nghiên cứu Vũ Thanh Thảo cộng (2012) cho nhiệt độ thích hợp 65% [4] c Nhu cầu Oxy [13] 16 Năm 1992, Han Mudgett nhận thấy mức cân khí oxy (O2) khí carbonic (CO2) không khí có ý nghĩa lớn đến tạo thành sắc tố nhiều ảnh hưởng đến tăng trưởng nấm lên men bán rắn Giống Monascus sống điều kiện kỵ khí sử dụng glucose chất, nhiên sống điều kiện O2 thấp Trong điều kiện thiếu O2, có tạo thành nhiều ethanol, khí CO2 hàm lượng sắc tố tạo Với Monascus purpureus nuôi gạo sắc tố thu cao áp suất riêng O2 0,5atm Tuy nhiên, áp suất riêng CO2 cao ức chế trình tạo sắc tố ức chế hoàn toàn 1atm Trong hệ thống bình lên men kín, nuôi cấy hiếu khí áp suất riêng CO2 0,02atm, áp suất riêng O2 phải nằm khoảng 0,05 – 0,5atm Như vậy, áp suất riêng O2 0,5atm áp suất riêng CO2 0,02 atm sắc tố tạo cao Lượng O2 hấp thu cao từ 70-90 lên men, ngược lại lượng CO2 thải cao từ 60-80 Tùy thuộc vào môi trường không khí, giới hạn hệ số hô hấp 1, ngoại trừ áp suất O2 0,05atm áp suất CO2 0,02atm d Độ pH ban đầu [13], [30] Monascus sinh trưởng pH từ 2,5-8 thích hợp từ 4-7 (Yongsmith, 1993) Trong khoảng pH có biến đổi sinh trưởng Monascus phát triển tốt pH so với pH khác (Lin, 1991; Chen, 1993) Dẫu sinh trưởng tốt pH 4, lượng sinh khối tạo nhiều pH 6,5 (Chen, 1993) Theo Lin (1992), tạo thành sinh khối tế bào cao đạt với pH sắc tố tích lũy sợi nấm, khó hòa tan vào môi trường Sự hình thành sắc tố bị ảnh hưởng theo nhiều giá trị khác nhau, pH thấp sắc tố vàng chiếm ưu pH cao sắc tố đỏ chiếm ưu Tại pH 2,5 tạo phần lớn màu đỏ sáng (Yongsmith, 1993), pH có kích thích tổng hợp ankaflavin (sắc tố vàng) tổng lượng sắc tố hình thành tăng dần gia tăng pH đến 5,5 Vượt giá trị này, sắc tố tạo giảm (Lin, 1991) Trái lại với ý kiến trên, báo cáo Aporn Wongwicharn (Hội nghị Kỹ thuật Sinh học lần thứ 13 Thái Lan) ghi nhận môi trường lên men bán rắn sử dụng bã khoai mì chất độ pH thích hợp cho hình thành sắc tố Ở giá trị pH 7, sắc tố vàng không hình thành (Yongsmith, 1993) 17 e Thành phần môi trường: Theo Wong cộng (1981), tỷ lệ C/N quan trọng, để phát triển tỷ lệ C/N 50g/g, để tạo sắc tố tỷ lệ C/N 7-9g/g Theo Aporn Wongwicharn (Hội nghị Kỹ Thuật Sinh Học lần thứ 13 Thái Lan) tỷ lệ C/N cho lượng sắc tố cao sử dụng bã khoai mì làm chất 150 – 200g/l Kayuma Mutuwong, Sivawan Phoolphundh, Aporn Wongwicharn kết luận tỷ lệ C/N thích hợp 150 – 300g/l Nguồn carbon [13] Vài hydrat carbon dùng nguồn carbon lượng cho hình thành sắc tố Monascus, nồng độ Carbon sử dụng môi trường lên men bán rắn 0,14,0%, hydrat carbon tinh bột, disaccharide lactose sucrose, monosaccharide glucose fructose Năm 1982, Lin Lizuka nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khác đến lượng sắc tố tạo thành (bảng 1.2) Kết cho thấy môi trường sử dụng bột mì lên men nấm men cho sắc tố nhiều Bảng 1.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sản lượng sắc tố Môi trường ngũ cốc Lượng sắc tố 400 nm 500 nm Gạo trắng 1500 1700 Gạo lức 1570 1850 Bánh mì 3500 4000 Cám 2300 2900 Bắp 2300 2700 Mantou() 5100 5430 Lúa mì 3100 3600 Nguồn: Lin Lizuka (1982) - Ghi chú: Mantou: bột mì lên men nấm men Khi nuôi môi trường bán rắn gạo, Rosenblit cộng (2000), thấy vào giai đoạn cuối 240 lên men cân carbon sau: 23% carbon chuyển thành sinh khối, 35% thành CO2, 15% thành ethanol, 1% thành acid acetic 17% giữ lại chưa 18 [...]... thành sắc tố bị ảnh hưởng theo nhiều giá trị khác nhau, tại pH thấp sắc tố vàng chiếm ưu thế và pH cao hơn sắc tố đỏ chiếm ưu thế Tại pH 2,5 tạo ra phần lớn là màu đỏ sáng (Yongsmith, 1993), tại pH 4 có sự k ch thích tổng hợp ankaflavin (sắc tố vàng) và tổng lượng sắc tố hình thành tăng dần khi gia tăng pH đến 5,5 Vượt quá giá trị này, sắc tố tạo ra sẽ giảm (Lin, 1991) Trái lại với các ý kiến trên,... và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của khí oxy (O2) và khí carbonic (CO2) trong không khí có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ít nhiều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm khi lên men bán rắn Giống Monascus không thể sống trong điều kiện k khí khi sử dụng glucose như cơ chất, tuy nhiên có thể sống trong điều kiện O2 thấp Trong điều kiện thiếu O2, có sự tạo thành nhiều ethanol, khí... hơn 10 sắc tố tạo ra từ Monascus nhưng vẫn chưa có sự giải thích rõ ràng về chúng (Shin và cộng sự, 1998) [48] Trong nhiều năm các nhà khoa học đã chứng minh sắc tố của Monascus phân thành 3 nhóm sắc tố: vàng - da cam - đỏ, trong đó sắc tố đỏ là quan trọng nhất do nó được sử dụng như chất màu thực phẩm và là chất thay thế nitrate trong bảo quản 1.2.1 Cấu tạo phân tử Sắc tố của Monascus được tạo ra... 2004 (Mapari và cộng sự, 2010) Các chất màu tự nhiên và màu được chiết xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật Sản xuất bột màu sử dụng các vi sinh vật có lợi thế nhất định so với các nguồn khác như chúng có thể được phát triển nhanh chóng trong điều kiện kiểm soát cao K t quả là năng suất cao của các sắc tố Ngoài Monascus nhiều vi sinh vật khác có khả năng sản xuất sắc tố như các loài của chi Paecilomyces,... CO2 và hàm lượng sắc tố tạo ra ít hơn Với Monascus purpureus nuôi trên gạo thì sắc tố thu được cao nhất khi áp suất riêng của O2 là 0,5atm Tuy nhiên, áp suất riêng của CO2 cao sẽ ức chế quá trình tạo sắc tố và sẽ ức chế hoàn toàn tại 1atm Trong hệ thống bình lên men k n, nuôi cấy hiếu khí thì áp suất riêng của CO2 là 0,02atm, còn áp suất riêng của O2 phải nằm trong khoảng 0,05 – 0,5atm Như vậy, khi... Streptomyces và Penicillium (Gunasekaran và Poorniammal, 2008) Nhưng Monascus đã thu hút sự chú ý đặc biệt khi chúng tạo được nhiều màu sắc khác nhau đặc biệt là sắc tố đỏ và vàng là những màu thực phẩm mong muốn [13] 12 Màu của Monascus được tách chiết bằng ethanol từ gạo lên men với nấm Monascus sau đó được thu nhận và tinh sạch để sử dụng phổ biến trong vi c nhuộm màu thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm... môi trường gạo hấp, Johns và Stuart (1993) nhận thấy rằng lượng độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo sắc tố là 56% Theo báo cáo của Aporn Wongwicharn tại hội nghị K Thuật Sinh học lần thứ 13 ở Thái Lan (2000) cho rằng khi nuôi cấy Monascus trên môi trường bã khoai mì thì độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo sắc tố là 60% Một nghiên cứu mới nhất của Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012) cũng cho... vào công trình, họ đã được trao giải Nobel Sinh lý và Y khoa Và sau đó, gạo nấm men đỏ trở nên nổi tiếng và phổ biến toàn cầu [3], [46] 9 Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của Monacolin K [41] 1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Monascus 1.1.2.1 Phân loại học Dựa theo khóa phân loại nấm mốc, Monascus được định danh như sau : - Ngành: Ascomycota - Lớp: Plectomycetes - Bộ: Eurotiales - Họ: Monascaceae - Giống: Monascus. .. sucrose, monosaccharide như glucose hoặc fructose Năm 1982, Lin và Lizuka đã nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến lượng sắc tố tạo thành (bảng 1.2) K t quả cho thấy môi trường sử dụng bột mì đã lên men nấm men cho sắc tố nhiều nhất Bảng 1.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sản lượng sắc tố Môi trường ngũ cốc Lượng sắc tố 400 nm 500 nm Gạo trắng 1500 1700 Gạo lức 1570 1850 Bánh mì... Trung Quốc Monascus an toàn và không gây độc tố, nó ảnh hưởng đáng k đến vi c gia tăng tuần hoàn máu, giúp cải thiện chức năng lá lách và giảm mức độ mỡ trong cơ thể Màu của Monascus được thu nhận từ quá trình lên men gạo, đậu nành thông qua quá trình tách chiết Đó là màu thực phẩm tự nhiên và có chất lượng tốt với các đặc tính cụ thể: - Màu của Monascus có nguồn gốc tự nhiên, tốt cho sức khỏe 14 -