Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 (2007) 238-244 Khảo sát khả tạo săc tô, Lovastatin độc tô Citrinin hai chủng nấm mốc đỏ Monascus purpureus Lê Đức Mạnh* Viện Công nghiệp Thực phẩm, 30] Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam N hận ngày tháng năm 2007 Tóm tát Monascus purpureus sử dụng rộng rãi Trung Quốc, Hàn Quổc Nhật Bàn từ h àng trăm năm sản xuất thực p hẩm y học cổ truyền G ần đ ây M o n a s c u s p h át h iện cỏ khả năn g sinh tổ n g hợp lovastatin, m ột dược chất quan trọ n g tro n g điều trị bệnh tim mạch Nghiên cứu đề cập tới khả ứng dụng cơng nghệ chủng nấm Monascus có mặt sưu tập giống Viện Công nghiệp Thực phẩm M purpureus MD M purpureus 3403 K ết đánh g iá ch o thấy hai chùn g có khác biệt rỗ rệt k n ăn g dạn g sắc tố tạo Trong chủng khảo sát, M purpureus 3403 có khả sinh tổng hợp lovastatin có tiềm ứng dụng sản xuất thực phẩm chức n ăn g Cả hai chủng khảo sát có khả sinh citrinin, loại độc tố nấm Mặc dù khơng sản sinh mức độ cao, có mặt citrinin điều đáng quan tâm ứng dụng Monascus sản xuất M ỡ đầu Monascus purpureus thuộc ngành Ascomycota, lớp Ascomycetes, phân lớp Eurotiomycetidae họ Monascaceae Monascus sử dụng rộng rãi sàn xuất thực phẩm Trung Quốc, Hàn Quốc Nhật Bản từ hàng trăm năm [1] Ngồi ứng dụng thơng thường làm phẩm mầu thực phẩm, Monascus loại dược liệu cổ truyền quốc gia Gạo lên men với Monascus gọi "Ang Khak" "Hong Qu" theo tiếng Trung Quốc, “Ben-Koji" theo tiếng Nhật “Red Rice Yeast” theo tiếng Anh Gần đây, nấm Monascus phát có chứa hoạt chất có lợi cho hoạt động cùa tim mạch Chúng có khả làm giảm cholesterol * ĐT: 84-4-8584481 E-maiI: m anh@ firi.ac.vn tổng số, táng HDL, giảm LDL triglyceride Hoạt chất điều khiển q trình lovastatin (monacolin K, mevinolin) Do có khả làm giảm lượng cholesterol máu, Monascus có tác dụng phịng ngừa bệnh tim mạch số dạng biến chứng [2,3] Hiện chế phẩm từ M purpureus sản xuất rộng rãi giới Các chế phẩm bao gồm M purpureus dạng thô, dịch chiết M purpureus, chất tinh chế từ chúng Sản phẩm dạng thực phẩm chức thường chứa hàm lượng lovastatin từ 90 mg -10.000 mg/kg Các chế phẩm áp dụng dạng viên nén, nhộng, dạng kem dạng bổ sung cho thực phẩm Chế phẩm M purpureus tồn dạng thực phẩm chức dược liệu Solaray (Mỹ), InVite Health (Mỹ), M oming Star Health (Mỹ), TerraVita (Balan), AllOk GmbH (Đức), Hangzhou Gosun Technologies Co., Ltd (Trung Quốc), YBS L D M n h / T p c h í K hoa học Đ H Q G H N , K h o a h ọ c T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ (2 0 ) -2 4 (Nhật) số nhiều công ty cung cấp thực phẩm chức dược liệu từ M purpureus Một vấn đề quan ngại ứng dụng Monascus khả sinh độc tố citrinin Citrinin độc tổ nấm điển hình, phát Peniciỉlum, sau Aspergillus Monascus Nó coi độc tố mạnh không bền nhiệt dễ bị phân huỷ trinh chế biến [4] Citrinin sản phẩm trao đôi thứ cấp Monascus purpureus với nồng độ nhỏ chấp nhận gạo lên men với Monascus Mục tiêu cùa nghiên cứu đánh giá khả tạo sắc tố, sinh tổng hợp lovastatin citrinin chủng nấm M purpureus lưu giữ Sưu tập giống vi sinh vật, Viện Công nghiệp Thực phẩm nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển chế phẩm thực phẩm chức từ Monascus Nguyên vật liệu phương pháp Chùng giống, môi trường nuôi cấy phân tích hàm lượng chất mầu Các chùng M purpureus MD M purpureus 3403 phục vụ nghiên cứu lấy từ Sưu tập giống Vi sinh vật, Viện Công nghiệp Thực phẩm Giống bảo quản ống thạch nghiêng với thành phần malt 1%, glucose 1%, agar 2% Khảo sát khả tạo sắc tố, lovastatin, citrinin thực môi trường gạo hấp Chất mầu trích ly từ sinh khối Monascus giá thể cồn 70% (v/v) Hàm lượng sắc tố đánh giá thơng qua mật độ quang bước sóng 410 nm Phổ mầu chủng phân tích sắc ký mỏng (silica gel 60, Merck) với dung mơi ethylacetate [5] Phăn tích lovastatin Để tạo dung dịch chất chuẩn, lovastatin Molekula (Dorset, Anh) chuyển hóa thành 239 dạng axit cách pha dung dịch NaOH 0,lM :acetonitril (6:4 v/v) Lovastatin từ nấm Monascus tách chiết cách đông khô sinh khối giá thể nấm môi trường gạo hấp Hỗn hợp nghiền mịn chuyển 0,1 g vào ống Eppendorf chứa 0,5 ml H2SO 0,1M Các ống ù qua đêm nhiệt độ 55°c điều kiện lẳc 1000 vịng/phút máy Thermocomíbrt (Eppendorí) Sau 0,75 ml toluene bổ sung vào ống, lắc tổc độ 1400 vòng/phút nhiệt độ 55°c 10 phút sau ly tâm 13000 vịng/phút phút nhiệt độ phịng Tồn phần dịch chuyển sang ống trung hòa cách bổ sung 0,5 ml Na 2C 5%, lấc mạnh phút máy Vortex Hỗn hợp ly tâm 13000 vòng/phút phút loại bỏ toàn lớp Dịch chiết tiếp tục rửa cách bổ sung 0,5 ml nước cất, lắc mạnh phút ly tâm 13000 vịng/phút phút Dung mơi toluene loại bỏ cách chuyển 100)0.1 sang ống làm khô dịng khí nitơ Phần đọng lại hịa tan 200 p.1 hỗn hợp dung môi acetonitril: H 3PO 40.1% (60:40, v/v) Hỗn hợp sau ly tâm 13000 vòng/phút sử dụng 5|il dịch để phân tích HPLC với cột hỗn hợp C2-C18 (5RPC nRPC, Pharmacia Biotech, Mỹ), pha động acetonitrile: H 3PO 0.1% (60:40) (Merck, Đức), tốc độ dòng 0,6 ml/phút Tín hiệu ghi nhận detector * SPD 6AV (Shimadzu, Nhật) bước sóng 238 nm phân tích intergrator C-R5A (Shimadzu, Nhật) Phân tích citrinin Chất chuẩn citrinin Molekula (Dorset, Anh) pha dung môi acetonitrile Citrinin tách chiết từ sinh khối giá thể nấm môi trường cám gạo cồn 67% (v/v) Các mẫu pha loãng đến nồng độ cần thiết sử dụng cồn 67% sau phân tích HPLC với điều kiện phân tích lovastatin 240 L Đ M n h / T p c h í K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K hoa học T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ ( 0 ) -2 4 Kết bàn luận Đặc điếm động học cùa trình sinh sắc tố Hai chủng M purpureus MD M purpureus 3403 nuôi cấy môi trường gạo hấp 30 °c thời gian 16 ngày Tốc độ phát triển tạo sẳc tố đánh giá suốt q trình ni cấy Ket cho thấy chủng M purpureus MD phát triển nhanh tạo sấc tổ sớm chủng M purpureus 3403, nhiên cường độ màu cùa chùng M purpureus 3403 lại cao so với chủng M purpureus MD Đối với chủng giống, hàm lượng sắc tố tích tụ tăng mạnh 12 ngày đầu sau ổn định cuối thời gian khảo sát (16 ngày) (Hình 1) MD Ỉ4 Thời gian ni cáy (ngày) Hình Động học trinh sinh sắc tố Monascus ữên môi trường gạo hấp thành phần sẳc tố, dịch chiết sắc tố chủng M purpureus MD M purpureus 3403 phân tích phương pháp sắc ký mỏng với dung môi tách chiết ethyl acetat (Hình 2) Chùng M purpureus 3403 có xu hướng sinh sắc tố vàng nhiều (gạo cỏ màu đỏ sậm), chủng M purpureus MD có xu hướng sinh sắc tố đỏ nhiều (gạo có màu đỏ tươi) Khi trích ly đung mơi ethanol, chùng M purpureus 3403 cho dịch chiết có mẫu đỏ sẫm chủng M purpureus MD cho dịch chiết mầu đỏ nhạt hom Dựa quang phổ quét từ bước sóng \ 300 đến 800 nm ta thấy khả sinh tổng hợp sắc ỉố hai chủng khác Phân tích phể màu sắc ký mỏng cho thấy chùng M purpureus 3403 có khả sinh tổng hợp nhỏm sắc tố chù yếu Monascus purpureus màu màu vàng, màu đỏ màu da cam chủng M onascus purpureus MD lại chi tổng hợp chủ yếu nhóm săc tố đỏ tía Như vậy, tùy thuộc vào mục đính sử dụng mà ta lựa chọn m ột chùng Monascus sắc tố chủng M purpureus MD phù hợp sản phẩm rượu, chùng M purpureus 3403 sỗ cỏ giá trị sản phẩm thịt L Đ M n h / T p c h í K h o a học Đ H Q G H N , K hoa h ọ c T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ (2 0 ) -2 4 H ình Sắc ký m ỏ n g sẳc tố củ a chủng M p u rp u reu s M D M p u rp u reu s 3403 Đảnh giá khả sinh Lovastatin Lovastatin dược phẩm thuộc nhóm statin cịn gọi mevinolin Tuy nhiên tên gọi đầu (lovastatin) sử dụng phổ 241 biến Theo nhiều tài liệu nghiên cứu lovastatin tạo bời Monascus cà hai dạng axit lacton, chúng có khả chuyển hóa từ dạng sang dạng khác Trong tự nhiên, ti lệ tạo thành hai dạng tùy thuộc vào chủng vi sinh vật giống điều kiện nuôi cấy, lovastatin chủ yếu tồn dạng axit Việc chuyển hóa hai dạng với phụ thuộc phần lớn vào điều kiện môi trường nuôi cấy Mầu chất chuẩn lovastatin hịa tan ữong acetonitrile có chứa dạng lactone dạng axit Trong điều kiện phân tích chúng tôi, sấc ký đồ lovastatin dạng axit xuất phút 12,8 dạng lactone phút 22,1 (Hình 3) Sự có mặt hai dạng gây khó khăn cho việc đánh giá định lượng chúng tơi định chuyển hóa chúng thành dạng axit Sau xử lý dung dịch NaOH 0,lM :acetonitril ti lệ 6:4, toàn lovastatin dạng lactone chuyển hóa thành dạng axit Lúc sắc ký đồ chi xuất peak phút 12,8 Hình Kết phân tích HPLC chuyển hóa Lovastatin Chất chuẩn Lovastatin 0,01% qua xử lý NaOH 0,1M: ACN (6:4) a) Chất chuẩn Lovastatin dạng lacton axit trước xử lý băng NaOH; b) Chất chuẩn Lovastatin dạng axit sau xừ lý bàng NaOH 242 L Đ M n h / T p c h í K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K hoa h ọ c T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ ( 0 ) -2 4 Việc phân tích lovastatin tiên hành hai chủng Monascus purpureu MD chủng Monascus purpureu 3403 Mỗi chùng nuôi cấy với điều kiện khác nhằm khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lovastatin Kết tách chiết phân tích lovastatin chùng Monascus cho thấy khơng có chùng tạo lovastatin dạng lactone điều kiện nuôi cấy môi trường gạo hấp Chủng M purpureus MD chi tạo lovastatin dạng axit hàm lượng vết khơng thể định lượng xác Kết phân tích HPLC chủng M purpureus 3403, lovastatin tạo dạng axit hàm lượng lovastatin ữong mẫu sản phẩm đông khô giá thể đạt mức 60 ng/g (Hình 4) So với chế phẩm Monascus thị trường với nồng độ lovastatin khoảng 90-10000 ng/g nồng độ khơng cao để tạo chế phẩm tương tự, việc chiết tách làm giàu lovastatin cần thiết Hình Kết phân tích HPLC phát lovastatin mẫu tách chiết từ chủng M purpureus 3403 Đánh giá khà sinh citrinin Việc phân tích citrinin tiến hành cho chùng khảo sát phân tích HPLC cho thấy hai chùng Monascus Viện Công nghiệp Thực phẩm sinh citrinin môi trường gạo hấp (Hình 5) Nồng độ citrinin cao 105 ng/g Mặc đù mức độ tổng hợp citrinin cao so với hàm lượng công bố sản phẩm thương mại, có mặt cùa citrinin điều đáng quan tâm việc đưa giải pháp nhằm khống chế sinh tổng hợp citrinin điều cần thiết Điều đặc biệt lả khảo cứu cùa chúng tôi, citrinin không phát chùng nuôi cấy môi trường maltglucose agar Điều nảy cho thấy việc tối ưu hóa điều kiện nhằm giảm thiểu citrinin khả thi L Đ M n h / T p c h í K hoa h ọ c Đ H Q G H N , K hoa học T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ (2 0 ) -2 4 243 Citrinin Citrinii J Ỉ L a Hình Kết quà phân tích HPLC phát citrinin a) Mẫu tách chiết từ chủng M purpureus MD; b) Mẫu tách chiết từ chùng M purpureus 3403 K ết luận Hai chùng nấm M purpureus MD M purpureus 3403 có khác biệt rõ rệt dạng cường độ sắc tố tạo Chủng M purpureus 3403 có khả sinh tổng hợp lovastatin, dược chất quan trọng điều trị bệnh tim mạch Mặc dù không sản sinh mức độ cao, cỏ mặt citrinin hai chủng giống điều đáng quan tâm ứng dụng chúng sản xuất phẩm mầu thực phẩm chức Lời cảm ơn: Nghiên cứu nhận tài trợ cùa Bộ Khoa học Công nghệ, Bộ Công nghiệp thông qua để tài “Bảo tồn vá khai thác nguồn gen vi sinh vật cổng nghiệp thực p h ẩ m ” Tác già xin cám ơn ThS Đinh M ỹ Hằng, ThS Lê Thùy Mai, CN Đào Anh Hải (Viện Công nghiệp Thực phẩm) vỉ đóng góp q trình thực T ài liệu th am khảo [1] J Wang, z Lu, J Chi, Multicenter clinical trial of the scrum lipid-]owcring effects of a Monascus purpureus (Red Ycast) rice preparation from traditional Chinese medicine Currení Therapeuíic Research 58 (1997) 964 [2] D Heber, I Yip, J.M Ashley, D.A Elashoff, R.M Elashoff, V.L Go, Cholesterol-lovvering eíĩects of a proprietary Chinese red yeast rice đietary supplement, Am J Cỉin Nutr 69 (1999) 231 [3] c Li, Y Zhu, Y Wang, Monascus purpurcusfermented rice (red yeast rice): a natural food 244 L Đ M n h / T p c h í K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K h o a học T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ 23 ( 0 ) -2 4 product that low ers blood cholesterol in animal condition o f M onascus purpureus NTU 601, J m odels o f hypcrcholesterolem ia, N uír Res 18 (1 9 )7 Ind M icrobiol B io tech n o ỉ 30 (2003) 669 [5] c [4] J W ang, Lee, T Pan, Im provement o f m onacolin K, am inobutyric acid and citrinin production ratio as a ĩunction o f environm ent H.c Wong, P.E Koehler, Production and isolation o f an antibiotic from M onascus purpureus and its relationship to pigmcnt production, J F o o d Sci 46 (1981) 589 Production of pigments, Lovastatin and mycotoxin Citrinin by two Monascus purpureus strains Le Duc Manh Food Industries Research Institute, 301 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Monascus purpureus has been used in China, Korea, and Japan as food colorant and traditional medicine for centuries Recently it was discovered that Monascus produced lovastatin, an important drug for preventing cardiovascular diseases This study was íocused on technological characterization o f two Monascus strains at the Culture Collection of Food Industries Research Institute It was shown that the two strains diíĩered signiíìcantly in pigment production and pigmcnt composition It was confirmed ứiat M purpureus 3403 capable o f producing lovastatin, a chloresterol lowering agent It was noted that although citrinin presented at low concenữations, measures should be taken before commercial realization o f the sữains ... thấy khả sinh tổng hợp sắc ỉố hai chủng khác Phân tích phể màu sắc ký mỏng cho thấy chùng M purpureus 3403 có khả sinh tổng hợp nhỏm sắc tố chù yếu Monascus purpureus màu màu vàng, màu đỏ màu... gian khảo sát (16 ngày) (Hình 1) MD Ỉ4 Thời gian ni cáy (ngày) Hình Động học trinh sinh sắc tố Monascus ữên môi trường gạo hấp thành phần sẳc tố, dịch chiết sắc tố chủng M purpureus MD M purpureus. .. chức dược liệu từ M purpureus Một vấn đề quan ngại ứng dụng Monascus khả sinh độc tố citrinin Citrinin độc tổ nấm điển hình, phát Peniciỉlum, sau Aspergillus Monascus Nó coi độc tố mạnh không bền