Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 Khảo sát khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn đất canh tác chuyên canh lúa Phụng Hiệp-Hậu Giang Trương Quốc Tất1,*, Dương Minh Viễn1, Huỳnh Thị Cẩm My1, Dirk Springeal2 Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ Khoa Kỹ thuật Sinh học, Trường Đại học Leuven, Bỉ Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl (CE) điều kiện có khơng có bổ sung acid hữu hệ vi khuẩn (VK) kỵ khí đất chuyên trồng lúa Phụng Hiệp-Hậu Giang Thí nghiệm bố trí lọ thủy tinh loại 50 mL Mỗi lọ chứa 30 mL dung dịch khoáng tối thiểu, 10 g mẫu đất CE (35 ppm) 15 tháng điều kiện yếm khí Kết cho thấy tất nghiệm thức hai hệ VK ký hiệu PH01 PH02 có khả phân hủy tốt CE Sau tháng ủ, hàm lượng CE lại nghiệm thức dao động từ 3-82% so với hàm lượng thuốc ban đầu Sau bổ sung CE thời điểm 11 tháng, tốc độ phân hủy thuốc gia tăng Hàm lượng thuốc lại sau 11 tháng 20 ngày nghiệm thức biến động từ 4-57% so với hàm lượng thuốc ban đầu Hệ VK ký hiệu PH02 có tốc độ phân hủy CE cao hệ VK PH01 điều kiện có bổ sung acid hữu Trong tốc độ phân hủy hệ VK thử nghiệm điều kiện không bổ sung acid hữu Sản phẩm trung gian sinh tiến trình phân hủy CE hệ VK đất xác định là: O,O-dietyl-3, 6-dichlo-2 pyridil photphorothioat, 3,5,6 trichloro-2 pyridinol (TCP) O,O-diethyl-O (3,5,6-trichloro-2pyridyl) phosphate (Chlorpyrifos oxon) Kết thực phản ứng PCR điện di biến tính DGGE mẫu đất PH01 để phân tích gene 16S rRNA nhóm VK Chloroflexi cho thấy đa dạng cấu trúc hệ VK nghiệm thức bổ sung, không bổ sung acid hữu nghiệm thức đối chứng (khơng bổ sung CE) có độ tương đồng cao, khoảng 90-96% Từ khóa: Chlorpyrifos ethyl, Vi khuẩn kỵ khí, DGGE, sắc kí lỏng cao áp, sắc kí khí Mở đầu như: lấy hạt, ăn quả, rau màu,… Qua kết điều tra Đồng Sơng Cửu Long (ĐBSCL) dự án RIP (Chương trình VLIR) hợp tác Trường Đại học Cần Thơ Trường Đại học Leuven Bỉ cho biết trình canh tác, nơng dân thường xun phun rải Chlorpyrifos ethyl với liều lượng mức cho phép, có nơi sử dụng cao gấp 15 lần so với khuyến cáo Đây lại hoạt chất có tác động ức chế thần kinh cao, thuộc nhóm độc II theo Chlorpyrifos ethyl (O-diethyl-O (3,5,6trichloro-2-pyridyl) phosphorothioate) hoạt chất có tác dụng diệt trùng phổ rộng thuộc nhóm lân hữu cơ, sử dụng rộng rãi để phòng trị sâu nhiều đối tượng trồng _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-1228739392 Email: tqtat83@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4536 146 T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Chlorpyrifos ethyl có ảnh hưởng đến hệ thống sinh sản nam giới giảm cân nặng trẻ sơ sinh người mẹ có dấu hiệu ngộ độc [1] Trong đất, Chlorpyrifos ethyl phân giải chậm, DT50 khoảng 60-100 ngày [2] Độ hấp thu vào đất (Koc) dao động từ 652 l/kg đất chất hữu (1,35% chất hữu cơ) đến 30.381l/kg với đất giàu hữu (3,41% carbon hữu cơ) [3] 147 nguồn carbon khử chlor hơ hấp yếm khí có khơng bổ sung nguồn carbon hữu Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng Các hệ vi khuẩn kị khí có khả phân hủy chlorpyrifos ethyl đất phèn đất phù sa mơ hình chun lúa ĐBSCL 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp thu mẫu đất Hình Cơng thức cấu tạo Chlorpyrifos ethyl Công thức phân tử Chlorpyrifos ethyl đặc trưng gốc chlor gốc lân vòng pyridine Nếu gốc chlor gốc lân bị loại bỏ độc tính độ bền ban đầu Chlorpyrifos ethyl thay đổi đáng kể Trong mơi trường yếm khí hợp chất có chứa chlor bị khử thơng qua q trình hơ hấp số nhóm vi khuẩn khác Đã có nhiều nghiên cứu giới việc phân lập vi khuẩn kỵ khí phân hủy hợp chất có chứa chlor như: Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum Citrobacter freundii [4] Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, tình trạng ngập nước thường xun mơ hình thâm canh lúa điều kiện thuận lợi cho lồi vi khuẩn kỵ khí tham gia vào chu trình chuyển hóa phân hủy độc chất hữu đất nước ngầm Vì vậy, giả thuyết đặt Chlorpyrifos ethyl có khả bị phân hủy tốt độc chất hữu khác, có nguồn acid hữu bổ sung Đây chất cho điện tử mà vi khuẩn sử dụng để khử chlor phân tử Chlorpyrifos ethyl Do đó, nghiên cứu thực với mục tiêu khảo sát khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn từ đất phèn Phụng Hiệp-Hậu Giang mơ hình chun canh lúa Sự phân hủy sinh học Chlorpyrifos ethyl thực theo hai chế tạo điều kiện để tăng cường khả vi khuẩn tận dụng Chlorpyrifos ethyl Mẫu đất sử dụng bố trí thí nghiệm đất phèn thu Phụng Hiệp-Hậu Giang: Mẫu đất thu độ sâu - 20 cm ruộng chuyên trồng lúa, điều kiện ngập nước sau lúa thu hoạch, ruộng thu ngẫu nhiên điểm trộn thành mẫu Ruộng (kí hiệu PH01): lấy xã Hòa An, chuyên lúa vụ; Ruộng (kí hiệu PH02): lấy xã Hịa An, chuyên lúa vụ Kết phân tích mẫu đất sau: đất Phụng Hiệp thuộc loại đất phèn hoạt động trung bình, đốm Jarosite xuất khoảng 60 - 70 cm mặt đất Đất có sa cấu sét, hàm lượng hữu thuộc nhóm trung bình pH mức chua vừa Số liệu cụ thể trình Bảng 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl Thí nghiệm nhằm khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thực đất phèn (Phụng Hiệp-Hậu Giang) điều kiện có khơng có bổ sung nguồn acid hữu Hệ vi khuẩn mẫu đất nuôi ủ lọ thủy tinh thể tích 50 mL Mỗi lọ ủ bổ sung Chlorpyrifos ethyl hàm lượng 35 ppm, 10 g đất 30 mL dung dịch yếm khí Thành phần dung dịch yếm khí bao gồm khống đa lượng, khống vi lượng, vitamin thiết yếu để thúc đẩy hoạt động vi khuẩn khử - Cl yếm khí gồm: D-biotin, folic acid, riboflavin, pyrodoxin hydrochloride, vitamin B12, nicotiamide hỗn hợp acid hữu đóng vai trị chất 148 T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 cho điện tử (electron donor) gồm: pyruvic acid (pyruvate), acetic acid (acetate), butyric acid (butyrate), lactic acid (lactate) propionic acid (propionate) (250 µM chất) [5] Bảng Một số đặc tính lý hóa đất sử dụng thí nghiệm ni ủ yếm khí Sa cấu đất Sét (%) Thịt (%) Cát (%) Hàm lượng hữu (%) 73 27 0,2 4,90 Địa điểm Phụng Hiệp, Hậu Giang Các thành phần sau pha phải sục khí N2 30 phút hút chân khơng để loại bỏ hồn tồn O2 Dung dịch khống đa lượng (thể tích L) bổ sung khoáng vi lượng (1 mL), vitamin (0,1 mL) hỗn hợp acid hữu (4 mL) Kiểm tra mức độ yếm khí hỗn hợp dung dịch cách thêm vào mL thuốc thử yếm khí Resazurin Tổng thể tích đất dung dịch yếm khí 40 mL Trước cho đất vào lọ, Chlorpyrifos ethyl bổ sung cách hòa tan vào Acetone cấy sẵn lên g đất khô nghiền mịn Dung dịch yếm khí dùng cho nghiệm thức (NT) NT3, NT5 không bổ sung thêm nguồn hữu khác Chlorpyrifos ethyl nhằm thúc đẩy khả vi khuẩn tận dụng thuốc nguồn carbon Ở NT3 khơng bổ sung thêm thuốc mà có nguồn vi khuẩn nhằm làm đối chứng DNA cho NT5 Dung dịch yếm khí dùng cho nghiệm thức NT2, NT4 có đầy đủ vitamin thiết yếu hỗn hợp acid hữu pyruvic, propionic, acetic, butyric acid đóng vai trò chất cho điện tử cho hoạt động vi khuẩn khử chlor yếm khí Trong đó, NT2 khơng bổ sung thêm Chlorpyrifos ethyl mà có vi khuẩn để làm đối chứng DNA cho NT4 Hỗn hợp acid hữu cơ, loại hàm lượng 250 mM bổ sung tháng cho nghiệm thức khử chlor (NT2, NT4) Ngồi ra, thí nghiệm cịn bố trí thêm nghiệm thức đối chứng tiệt trùng (NT1) có Chlorpyrifos ethyl để khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl NT4 NT5 Để tạo môi trường yếm khí, lọ ủ sục với khí N2 20 phút hút chân khơng Thí nghiệm thực với hai mẫu đất PH01 PH02 Mỗi mẫu đất gồm NT, pH 5,06 NT có lần lặp lại sau: NT1: Đối chứng âm, sử dụng 10 g đất tiệt trùng, Chlorpyrifos ethyl (35ppm), vitamin hỗn hợp acid hữu cơ; NT2: Đối chứng dương, sử dụng 10g đất không tiệt trùng, không bổ sung Chlorpyrifos ethyl, bổ sung vitamin hỗn hợp acid hữu cơ; NT3: Đối chứng dương, sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, không bổ sung Chlorpyrifos ethyl, không bổ sung vitamin hỗn hợp acid hữu cơ; NT4: sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, bổ sung Chlorpyrifos ethyl (35 ppm), bổ sung vitamin hỗn hợp acid hữu cơ; NT5: sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, bổ sung Chlorpyrifos ethyl (35 ppm), không bổ sung vitamin hỗn hợp acid hữu Bổ sung thêm thuốc sau 11 tháng ủ: Sau 11 tháng ủ, hàm lượng chlorpyrifos ethyl nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cịn lại thấp, khơng đáng kể Do đó, lọ ủ bổ sung thêm thuốc để làm giàu mật số vi khuẩn Để thêm Chlorpyrifos ethyl với nồng độ 68 ppm 40 mL dung dịch ni yếm khí, dùng bơm tiêm y tế mL tiêm mL Chlorpyrifos ethyl nồng độ 2800 ppm vào 40 mL dung dịch nuôi cho NT1, NT4 NT5, không bổ sung thuốc cho nghiệm thức đối chứng dương (NT2, NT3) Chỉ tiêu theo dõi: Lấy mẫu thời điểm tháng, tháng, tháng, trước bổ sung thêm Chlorpyrifos ethyl, bổ sung thêm Chlorpyrifos ethyl, 20 ngày tháng sau thêm Chlorpyrifos ethyl để xác định hàm lượng Chlorpyrifos ethyl lại sản phẩm trung gian tạo q trình phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl Cách lấy mẫu: Lắc thật lọ ủ, dùng bơm tiêm y tế tiệt trùng lấy từ lọ ủ mL cào lọ huyết T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 10 mL Bơm tiêm phải thổi với khí nitơ để đẩy hết O2 trước lấy mẫu Phương pháp phân tích hóa học Chlorpyrifos ethyl: Quy trình trích mẫu thực qua lần trích Lần thứ lấy mL mẫu cần phân tích từ lọ 40 mL bố trí cho vào lọ huyết sau thêm mL hỗn hợp toluene: acetone (2:1), vortex phút đặt máy lắc ngang 24 h với tốc độ 250 vòng/phút Sau 24 h, vortex lọ pi phút li tâm với tốc độ 3.000 vòng phút 30 giây Dùng pipet thủy tinh hút hết phần dung môi bên có chứa Chlorpyrifos ethyl sang lọ huyết Lần trích thứ thực tương tự lần thứ sử dụng mL hỗn hợp dung mơi Lần thứ tương tự lần trích thứ sử dụng mL dung môi thực liền sau lần trích thứ Sau trích cho mẫu bay tự nhiên tủ hút đạt thể tích mL để tiếp tục quy trình lọc Chlorpyrifos ethyl dung dịch trích làm cách lọc qua cột alumina Trước lọc alumina bất hoạt cách nung 550 oC (ít 24 h) sau chuyển sang tủ sấy 250 oC 30 phút Tiếp tục chuyển sang bình hút ẩm để làm nguội sau bổ sung nước khử khoáng (3% lượng alumina) lắc mạnh 30 phút Na2SO4 gòn thủy tinh nung 250oC 2h Qui trình lọc chi tiết sau: nhồi gịn thủy tinh vào cột, lắp cột lên giá Dùng giấy nhôm cân g alumina cho vào cột, thêm khoảng 1-2 cm Na2SO4 lên bề mặt Gõ nhẹ cột để alumina chặt lại Rửa cột với 1,3 mL hỗn hợp DCM:Hexan (2:1) sau tiếp tục rửa 4mL Hexan mực dung môi cũ vừa chạm đến mặt lớp Na2SO4, tránh để khô cột Cho mẫu vào đầu cột, sau mẫu hết qua cột thu phần dung mơi có chứa Chlorpyrifos ethyl loại bỏ tạp chất Tráng lọ pi hai lần với Hexan, lần mL Để mẫu bay tự nhiên đến thể tích mL Hàm lượng thuốc xác định máy HPLC sản phẩm chuyển hóa xác đinh máy GCMS Phương pháp xác định Chlorpyrifos ethyl HPLC: Máy HPLC hãng Shimazu- 149 LC20A, sử dụng cột C18 với chiều dài 25 cm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm, tỷ lệ pha động Metanol: Nước 80:20, bước sóng 230 nm tốc độ dòng mL Phương pháp xác định sản phẩm trung gian GC/MS: sản phẩm trung gian Chlorpyrifos ethyl xác định cách scan máy GC/MS QP2010 plus hãng Shimazdu, sử dụng cột sắc ký Rxi 5SilMS 30 m x 0,32 mm; film 0,25 μm Nhiệt độ buồng bơm mẫu 2500C, điểm giao tiếp GC MS 250 0C, nguồn ion 200 0C Thể tích mẫu bơm μL với chế độ khơng chia dịng 2.2.3 Phương pháp phân tích sinh học Dựa vào kết phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl gần VK hai mẫu đất PH01 PH02 nên chọn mẫu đất hệ vi khuẩn kí hiệu PH01 thời điểm tháng ủ để phân tích đa dạng di truyền Theo kết nghiên cứu đa dạng di truyền nhóm vi khuẩn khử Clo yếm khí cho thấy có nhiều lồi thuộc nhóm Chloroflexi Nhóm vi khuẩn Chloroflexi – nhóm vi khuẩn tiềm khử Clo yếm khí hợp chất hữu chứa gốc Clo Các nhóm vi khuẩn khác thuộc ngành Chloroflexi phổ biến chiếm tỷ lệ cao số cộng đồng vi khuẩn chúng phân bố ưu khác tuỳ theo vị trí địa lý độ sâu [6] Một số nghiên cứu cho thấy Chloroflexi nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm tỷ lệ đến 80% nhóm vi khuẩn xác định phương pháp khuếch đại chuỗi DNA cuả gene 16S rRNA vi khuẩn từ mẫu trầm tích [7] chiếm tỷ lệ trung bình khoảng 17% tổng số trình tự gene 16S rRNA vi khuẩn định danh [6] Các dòng vi khuẩn ngành Chloroflexi đa dạng đặc tính sinh lý học [8] Trong mơi trường trầm tích biển, phương pháp PCR khuếch đại gene 16S rRNA phát nhóm tổ tiên ngành Chloroflexi Chloroflexi “subphylum I” (ví dụ, Anaerolineae Caldilineae) [9] Chloroflexi “subphylum II” (ví dụ, lớp Dehalococcoidia, trước gọi lớp “Dehalococcoidetes”) [10] Sự đa dạng cấu trúc hệ nhóm Chloroflexi phân tích có 150 T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 thể cho thấy đa dạng cấu trúc nhóm vi khuẩn khử Clo mẫu ủ Do đó, thí nghiệm thực tách chiết DNA vi khuẩn đất theo qui trình tách chiết DNA từ đất Mỹ thuộc hãng PowerSoil(R) Isolation Mẫu DNA thực phản ứng PCR kép, trước tiên với cặp mồi đặc hiệu 338F/1101R để khuếch đại gene 16S rRNA nhóm Chloroflexi Sau đó, sản phẩm PCR khuếch đại lần thứ hai mồi 341F-GC/534R để nhân đoạn gene ngắn Tiếp tục thực điện di biến tính tăng cấp (DGGE) nhằm phân tích đa dạng hệ vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl 2.2.4 Phương pháp thống kê xử lí số liệu Số liệu thí nghiệm tính tốn phần mềm Excel Thống kê phần mềm Minitab để kiểm định phân phối chuẩn, đồng phương sai, so sánh trung bình phân tích ANOVA Xử lí ảnh phần mềm Cluster Gel Compare để so sánh độ tương đồng hệ VK Kết thảo luận 3.1 Đánh giá khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl Khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn PH01 PH02 qua thời gian trình Hình Hình Khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl hệ PH01 (a) PH02 (b) Kết khảo sát dư lượng Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn PH01, PH02 cho thấy hoạt động phân hủy thuốc diễn mạnh Hàm lượng Chlorpyrifos ethyl sau tháng ủ 0,9-15,01 ppm (tương đương 3-45%) Riêng với nghiệm thức không bổ sung acid hữu hệ vi khuẩn PH02 chưa có khác biệt so với đối chứng, hàm lượng Chlorpyrifos ethyl đến 15,9 ppm (tương đương 82%) Sau 10 tháng ủ, hàm lượng Chlorpyrifos ethyl 0,7-3 ppm (tương đương 3-14%) Trong hệ vi khuẩn, tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức có acid hữu nhanh so với tốc độ phân huỷ Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức không bổ sung acid hữu tháng đầu nuôi ủ Sau làm giàu mật số vi khuẩn cách bổ sung Chlorpyrifos ethyl, kết phân tích tiêu theo dõi cho thấy hai hệ vi khuẩn có tốc độ phân hủy thuốc nhanh Hàm lượng Chlorpyrifos ethyl lại sau 20 ngày 6,9-10,3 ppm (11-15%) Riêng với hệ vi khuẩn kí hiệu PH02, nghiệm thức khơng có acid hữu cơ, thời điểm 11 tháng 20 ngày nồng Chlorpyrifos ethyl lọ ủ 29,1 ppm tương đương 57% khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với thời điểm 11 tháng Đến thời điểm 15 tháng, hàm lượng Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức cịn 0,4-8,3 ppm (1-16%) Tóm lại, sau q trình khảo sát cho thấy hệ vi khuẩn kí hiệu PH01 PH02 có khả phân hủy tốt Chlorpyrifos ethyl điều kiện yếm khí Tính đến thời điểm 20 ngày đầu T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 bố trí thí nghiệm, hệ vi khuẩn kí hiệu PH02 có tốc độ phân hủy thuốc nhanh nghiệm thức có bổ sung acid hữu Thời gian phân hủy sau thêm Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn rút ngắn so với lần đầu bố trí thí nghiệm, chứng tỏ có gia tăng mật số vi khuẩn tham gia phân hủy thuốc sung acid hữu (Hình 6) Mẫu thời điểm 11 tháng có sản phẩm phân hủy gốc chlor Kết phân tích khơng xác định sản phẩm phân cắt mạch carbon Chlorpyrifos ethyl Như vậy, nghiệm thức có hay khơng có acid hữu cơ, vi khuẩn sử dụng Chlorpyrifos ethyl với vai trò chất nhận điện tử q trình hơ hấp Riêng với nghiệm thức không bổ sung acid hữu từ kết phân tích khơng thể kết luận có hay khơng có khả vi khuẩn sử dụng Chlorpyrifos ethyl nguồn carbon Kết phân tích mẫu đối chứng cho thấy lưu tồn Chlorpyrifos ethyl mẫu đất sử dụng để thí nghiệm Trong đó, có 1/2 mẫu có hình thành TCP với hàm lượng thấp Dựa vào kết khảo sát hoạt động phân hủy Chlorpyrifos ethyl phân tích sản phẩm chuyển hóa cho thấy mơi trường tự nhiên có lồi vi khuẩn kỵ khí phân hủy Chlorpyrifos ethyl 3.2 Khảo sát chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl Bên cạnh q trình khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl, thí nghiệm quan tâm phân tích sản phẩm trung gian sinh trình phân hủy Chlorpyrifos ethyl Đối với nghiệm thức có bổ sung acid hữu nhằm thúc đẩy hoạt động phân hủy Chlorpyrifos ethyl khử Clo, có nhiều sản phẩm chuyển hóa như: sản phẩm phân hủy gốc Clo vị trí số vịng pyridine: O,O-dietyl-3,6dichlo-2 pyridil photphorothioat, sản phẩm phân hủy gốc lân: 3,5,6 trichloro-2 pyridinol (TCP) Ngồi ra, qua phân tích cịn dị tìm hình thành O,O-diethyl-O (3,5,6trichloro-2-pyridyl) phosphate (Chlorpyrifos oxon) Tuy nhiên, TCP Chlorpyrifos oxon phát với hàm lượng thấp, xu hướng phân hủy chủ đạo hình thành sản phẩm khử chlor Đối với nghiệm thức không bổ sung acid hữu cơ, hai mẫu hệ vi khuẩn kí hiệu PH01 phân tích, đó, mẫu thời điểm tháng có sản phẩm trung gian hoàn toàn giống với nghiệm thức có bổ 151 3.3 Đa dạng vi khuẩn kỵ khí phân hủy Chlorpyrifos ethyl đất Phân tích đa dạng di truyền hệ vi khuẩn thực với mẫu đất PH01 thời điểm 60 ngày Kết chạy điện di gel agarose kiểm tra sản phẩm PCR mồi 338F/1101R cho thấy tất mẫu có vạch sản phẩm PCR thu tương ứng vị trí 800 bp nhóm Chloroflexi M 10 800 bp Hình Điện di đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 338F/1101R Ghi chú: (M: thang chuẩn; 5: Đối chứng sống - bổ sung acid hữu cơ; 2, 6, 9: Bổ sung acid hữu cơ; 3, Đối chứng sống - không bổ sung acid hữu cơ; 4, 8: Không bổ sung acid hữu cơ; 10: đối chứng âm) Đối chứng âm 338F/1101R Đối chứng âm 341F-GC/ 534R Đối chứng dương Bổ sung acid hữu Không bổ sung acid hưuc Đối chứng khô-không bổ sung acid hữu Bổ sung acid hữu Đối chứng-bổ sung acid hữu Không bổ sung acid hữu Đối chứng -không bổ sung acid hữu Đối chứng-bổ sung acid hữu Bổ sung acid hữu T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 152 100 98 96 94 92 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) mẫu đất PH01 Đối chứng-bổ sung acid hữu Đối chứng- không bổ sung acid hữu Không bổ sung acid hữu Bổ sung acid hữu Hình Độ tương đồng hệ vi khuẩn thuộc nhóm Chloroflexi mẫu đất T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 Sản phẩm PCR mồi 338F/1101R tiếp tục sử dụng để thực phản ứng PCR với mồi tổng quát 341F-GC/534R Sản phẩm PCR chạy điện di biến tính (DGGE) để thấy đa dạng hệ vi khuẩn tham gia phân hủy thuốc Mỗi băng gel DGGE thể cho loài vi khuẩn khác Để xác định nhóm vi khuẩn khử chlor thí nghiệm, dựa vào vạch DNA xuất mẫu có bổ sung Chlorpyrifos ethyl so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung Chlorpyrifos ethyl Vì qua thời gian ủ, mật độ vi khuẩn khử chlor tăng dần dẫn đến hình thành băng nghiệm thức Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) trình bày Hình kết phân tích độ tương đồng hệ vi khuẩn trình bày Hình Kết điện di đồ cho thấy có nhiều băng DNA xuất làn, chứng tỏ mẫu ủ có nhiều lồi vi khuẩn khác thuộc nhóm Chloroflexi Các băng đánh dấu điện di đồ (Hình 4) băng xuất băng lồi vi khuẩn khử chlor thí nghiệm Tuy nhiên, vị trí băng điện di đồ cho thấy cấu trúc hệ vi khuẩn nghiệm thức gần (Hình 5) Sự khác biệt cấu trúc hệ vi khuẩn tất nghiệm thức không vượt 10% Cụ thể độ tương đồng cấu trúc hệ vi khuẩn nghiệm thức có bổ sung acid hữu (làn số 4), không bổ sung acid hữu (làn số 3) so với nghiệm thức đối chứng (làn số 2) đến 90% Ngoài ra, độ tương đồng hai nghiệm thức đối chứng có bổ sung khơng bổ sung acid hữu cao, đến 96% Kết phân tích đa dạng hệ vi khuẩn phù hợp với kết kiểm tra sản phẩm phụ GCMS Do đất có sẵn nguồn acid hữu nên nghiệm thức có bổ sung khơng bổ sung acid hữu cơ, sản phẩm phụ xác định Điều chứng tỏ, chế phân hủy thuốc hai nghiệm thức chưa có khác biệt Vì vậy, cấu trúc hệ vi khuẩn phân tích giống Ở NT2 NT3 có sản phẩm trung gian 153 phát (chỉ có TCP xuất 1/2 mẫu phân tích), hàm lượng q thấp nên khó dị tìm, có diện Chlorpyrifos ethyl Vì hoạt động khử chlor có khả xảy xảy hai nghiệm thức có khơng có nguồn acid hữu bổ sung, lí dẫn đến tương đồng tỷ lệ cao tất nghiệm thức với Kết luận Hai hệ vi khuẩn có khả phân hủy tốt Chlorpyrifos ethyl điều kiện kỵ khí Thời gian phân hủy thuốc rút ngắn sau lần bổ sung Chlorpyrifos ethyl thứ hai Đã có gia tăng mật độ vi khuẩn tham gia phân hủy thuốc Hoạt động phân hủy Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức bổ sung không bổ sung acid hữu diễn theo chế khử chlor hơ hấp yếm khí Ở nghiệm thức không bổ sung acid hữu cơ, kết luận có hay khơng khả hệ vi khuẩn tận dụng Chlorpyrifos ethyl làm nguồn carbon Sản phẩm chuyển hóa chủ yếu Chlorpyrifos ethyl O,O-dietyl-3, 6-dichlo-2 pyridil photphorothioat Ngồi cịn có diện 3,5,6 trichloro-2 pyridinol (TCP) O,O-diethyl-O (3,5,6-trichloro-2-pyridyl) phosphate (Chlorpyrifos oxon) Có lưu tồn Chlorpyrifos ethyl mẫu đất thí nghiệm Kết thực phản ứng PCR điện di biến tính DGGE mẫu đất ruộng PH01 để phân tích gene 16S rRNA nhóm vi khuẩn Chloroflexi cho thấy đa dạng cấu trúc hệ vi khuẩn nghiệm thức bổ sung, không bổ sung acid hữu nghiệm thức đối chứng (khơng bổ sung Chlopyrifos ethyl) có độ tương đồng cao, khoảng 90-96% Lời cảm ơn Tác giả báo xin chân thành cảm ơn nông dân huyện Phụng Hiệp- Tỉnh Hậu Giang giúp đỡ công tác thu mẫu đất Nghiên 154 T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 cứu hỗ trợ kinh phí từ dự án RIP hợp tác Trường Đại học Leuven- Bỉ Trường Đại học Cần Thơ [7] Tài liệu tham khảo [1] Tuli A., Use information and air monitoring recommendation for chlorpyrifos in California Enviromental hazard assessment program California 2013, 23 pp [2] Trần Quang Hùng Thuốc Bảo Vệ Thực Vật NXB Nông Nghiệp Hà Nội Hà Nội 1999, 348 trang [3] Gebremariam, S.Y, Mineralization, sorption and desorption of chlorpyrifos in aquatic sediments and soils Doctor of Philosophy, Washington State University United States 2011, 198 pp [4] Jagnow, G., K Haider, P.C.Ellwardt, Anaerobic dechlorination and degradation of hexachlorocyclohexane isomers by anaerobic and facultative anaerobic bacteria Archives of microbiology, 115 (3), 1977, pp 285-292 [5] Christoph, E.H., G.C.K Umlauf and G Bidoglio, 2004 "PCDD/Fs and Dioxin-like PCBs in Soils after the Flooding of River Elbe and Mulde in 2002" DIOXIN 2004-24th Intern Symposium on Halogenated Environmental Organic Pollutants and POPs, 6-10 September 2004 Berlin [6] Fry, J.C., R.J Parkes, B.A Cragg, A.J Weightman and G Webster, 2008 Prokaryotic [8] [9] [10] biodiversity and activity in the deep subseafloor biosphere FEMS Microbiol Ecol 66: 181- 196 Inagaki, F., T Nunoura, S Nakagawa, A Teske, M Lever and A Lauer, 2006 Biogeographical distribution and diversity of microbes in methane hydrate-bearing deep marine sediments on the Pacific Ocean Margin Proc Natl Acad Sci 103: 2815-2820 Kawaichi, S., N Ito, R Kamikawa, T Sugawara, T Yoshida and Y Sako, 2013 Ardenticatena maritime gen nov., sp nov., a ferric iron- and nitrate-reducing bacterium of the phylum Chloroflexi isolated from an iron-rich coastal hydrothermal field, and description of Ardenticatenia classis nov Int J Syst Evol Microbiol 63: 2992-3002 Blazejak, A., and A Schippers, 2010 High abundance of JS-1- and Chloroflexi-related Bacteria in deeply buried marine sediments revealed by quantitative, real-time PCR FEMS Microbiol Ecol 72: 198-207 Loffler, F.E., J Yan, K.M Ritalahti, L Adrian, E.A Edwards and K.T Konstantinidis, 2012 Dehalococcoides mccartyi gen.nov.,sp.nov., obligately organohalide-respiring anaerobic bacteria relevant to halogen cycling and bioremediation, belong to a novel bacterial class, Dehalococcoidia classis nov., order Dehalococcoidales ord nov and family Dehalococcoidaceae fam nov., within the phylum Chloroflexi Int J Syst Evol Microbiol 63: 625-635 Investigation of Chlorpyrifos Ethyl Degradation by Anaerobic Bacteria Communities from Paddy Soils in Hau Giang Province Truong Quoc Tat1, Duong Minh Vien1, Huynh Thi Cam My1, Dirk Springeal2 College of Agriculture and Apllied Biology, Can Tho University Faculty of Bioscience Engineering, Katholic University of Leuven, Belgium Abstract: The objective of this study was to estimate the ability Chlorpyrifos ethyl (CE) decomposition with and without supplementation of organic acids in anaerobic conditions by soil bacteria on intensive rice fields in the the Hau Giang provinces The experiment was set up in microcosms containing mineral minimum (30 ml), soils (10 g) and CE (35ppm) in 15 months days at anaerobic conditions The results showed that all treatments were well biodegradable for CE After months of incubation, the concentration of CE rest of the treatments ranged from 3-82% of the initial T.Q Tất nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 146-155 155 concentration CE decomposition rate was increased after supplementation CE After 11,6 months of incubation, CE concentrations rest of the treatments ranged from 4-57% of the initial concentration Bacterial communities (PH02) have higher CE decomposition rate than other bacterial communities under the same conditions supplemented with organic acid Meanwhile decay rate among the microbial communities in the absence of additional organic acids is the same Intermediate products generated during the decomposition of CE by soil bacterial communities were determined to include O,O-dietyl-3, 6-dichlo-2 pyridil photphorothioat, 3,5,6 trichloro-2 pyridinol (TCP) O,O-diethyl-O (3,5,6-trichloro-2-pyridyl) phosphate (Chlorpyrifos oxon) PCR-DGGE results showed that the structure of bacterial community (PH01) diversity among treatments complements, does not supplement the organic acid and the control treatment (no additional Chlorpyrifos ethyl) has a high degree of similarity, 90 -96% Keywords: Chlorpyrifos ethyl, Anaerobic Bacteria, chromatography, Gas Chromatography Mass Spectometry DGGE, high performance liquid ... nghiệm khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl Thí nghiệm nhằm khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thực đất phèn (Phụng Hiệp- Hậu Giang) điều kiện có khơng có bổ sung nguồn acid hữu Hệ vi khuẩn. .. tử mà vi khuẩn sử dụng để khử chlor phân tử Chlorpyrifos ethyl Do đó, nghiên cứu thực với mục tiêu khảo sát khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn từ đất phèn Phụng Hiệp- Hậu Giang. .. vào kết khảo sát hoạt động phân hủy Chlorpyrifos ethyl phân tích sản phẩm chuyển hóa cho thấy mơi trường tự nhiên có lồi vi khuẩn kỵ khí phân hủy Chlorpyrifos ethyl 3.2 Khảo sát chuyển hóa Chlorpyrifos