Phương pháp nghiên cứu enzyme. PGS. TS. Đỗ Quý Hai

Phương pháp nghiên cứu enzyme Phương pháp nghiên cứu enzyme Bởi: PGS TS Đỗ Quý Hai Qua hàng loạt điểm riêng biệt nhận xây dựng đường biểu diễn bước phản ứng Phương pháp khác tiến hành quan sát thân hỗn hợp phản ứng theo tiến trình xảy xây dựng số lớn thay đổi, dựa vào phương pháp tự động để ghi lại Chúng ta nhận đường biểu diễn liên tục bước phát triển phản ứng enzyme Ở phương pháp đầu, người ta thường đo nồng độ chất nồng độ sản phẩm phản ứng Nếu phản ứng tăng thi hai cách vừa nêu sử dụng để đo hoạt động enzyme Trong trường hợp xác định tốc độ, người ta phải nhận điểm: điểm thời điểm không, điểm thứ hai khoảng thời gian định trôi qua, điểm thứ khoảng thời gian lớn gấp hai lần khoảng trước Từ kiểm tra đắn phản ứng enzyme khoảng thời gian quan sát Nói chung, phần lớn phương pháp sử dụng để nghiên cứu phản ứng enzyme loại phương pháp nghiên cứu liên tục người ưa dùng Những nguyên tắc chung nghiên cứu enzyme Như phần đầu nói đến, enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein không ổn định Trong điều kiện bất lợi, chúng khơng bền, dễ dàng bị biến tính (denaturation) bị hoạt độ Do đó, làm việc với enzyme, phải luôn ý tránh điều kiện dễ làm hoạt độ Thơng thường phần lớn enzyme hoạt động vùng pH trung tính gần trung tính (pH = ± 2) Vì yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme Những ion kim loại nặng chì, đồng, thủy ngân điều kiện nhiệt độ cao thường làm hoạt độ enzyme Đặc biệt tách làm enzyme, cần tiến hành nhiệt độ thấp Nhiệt độ thường dùng cho công việc thông thường từ 00C đến 50C Đối với enzyme không bền, cơng đoạn làm tiến hành 1/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme nhiệt độ thấp (từ - 50C đến - 200C) Trong trường hợp này, người ta hay sử dụng hỗn hợp lạnh nước đá với CO2 nước đá với muối NaCl, chí người ta dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc Ví dụ số hỗn hợp làm lạnh trình bày bảng Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt Nước đá: muối 100:33 (3:1) - 21,30C Nước đá: H2SO4 đậm đặc 100: 25 (4:1) - 20,00C Như nói, nhiều enzyme bị hoạt tính dung dịch có pH < pH > 9, có số ngoại lệ pepsin bền acid Do đó, tùy thuộc loại enzyme, song nên ý tránh pH acid kiềm Khi điều chỉnh pH dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ thận trọng acid kiềm Và thêm hóa chất để điều chỉnh pH nên tiến hành 00C Khi làm việc với enzyme cần ý tránh tạo bọt nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) mặt phân cách hai pha nước khí Để tránh việc tạo bọt xảy ra, người ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh không lắc Có việc tách phần enzyme bột dễ làm hoạt tính enzyme Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêm ammonium sulfate dạng dung dịch bão hịa Trong xử lý mẫu thí nghiệm cắt, thái, xay nhỏ mẫu thực vật động vật (ví dụ cây, thịt, quan nội tạng ) không dùng dụng cụ dao kéo dụng cụ xay han rỉ để tránh tác dụng ion kim loại nặng (Cu, Pb, Fe ) mà dùng dụng cụ inox Khi dùng dung môi hữu aceton, alcol để kết tủa enzyme cần tiến hành nhiệt độ thấp Tách kết tủa enzyme cách ly tâm lạnh tốt lọc lạnh tiến hành nhanh Ở số trường hợp, tách làm enzyme có tượng giảm dần hoạt độ, cần phải làm thí nghiệm nhanh Tốt thực thí nghiệm liên tục, khơng ngắt quảng Ví dụ tách chiết enzyme chống oxy hóa (antioxidant enzyme) ty thể vịng 6h đo ln khơng hoạt tính Cịn microsome tiến trình kéo dài khơng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme chống oxy hóa enzyme oxy hóa khử Một điều cần ý tiến hành xác định hoạt độ enzyme, xác định khoảng nhiệt độ tất thành phần hỗn hợp phản ứng phải giữ nhiệt độ Lúc thiết phải dùng máy ổn nhiệt ( thermostate) Khi hỗn hợp phản ứng đạt nhiệt độ cần thiết tiến hành đo pH trình phải giữ ổn định dung dịch đệm phải đảm bảo độ xác pH: phản ứng tạo acid phải thêm kiềm vào ngược lại Để đảm bảo 2/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme kết tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật xác lượng dịch enzyme Người ta thường dùng loại pipette không chia độ sau dùng loại micropipette Trong thí nghiệm cần ý tránh đánh rơi enzyme vào dung dịch nghiên cứu Ví dụ làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn khơng nói chuyện nhiều Khi có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng nhiệt độ thấp Một số enzyme ổn định dung dịch đậm đặc ammonium sulfate Trong trường hợp này, người ta giữ kết tủa dạng huyền phù dung dịch ammoni sulphate bão hòa lấy chế phẩm cách ly tâm Trong điều kiện phịng thí nghiệm, việc sấy khô chế phẩm enzyme làm hoạt độ enzyme hồn tồn Nhưng điều kiện chân khơng sấy khô nhiệt độ thấp dùng phương pháp đông khô (lyophilization) Tách làm (tinh chế) enzyme Chọn nguồn nguyên liệu Enzyme chất xúc tác sinh học, có nhiều thể sống Việc điều chế chúng phương pháp hóa học với số lượng lớn việc làm khó khăn đầy tốn khơng muốn nói điều khơng tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn sinh học Mặc dù enzyme có tất quan, mô động vật thực vật tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu mặt kinh tế tiến hành nguyên liệu có chứa lượng lớn enzyme cho phép thu enzyme với hiệu suất cao dễ dàng tinh chế chúng Việc phân bố enzyme tế bào không đồng đều, loại tế bào có nhiều enzyme song khơng có enzyme khác Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh vật tùy theo loài nên phải chọn nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút tinh chế enzyme Có ba nguồn nguyên liệu sinh học bản: mô quan động vật, mô quan thực vật, tế bào vi sinh vật Trong tất nguyên liệu có nguồn gốc động vật tuyến tuỵ, màng nhầy dày, tim dùng để tách enzyme thuận lợi Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease số enzyme khác Từ ngăn tư dày bê nghé người ta thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa sản xuất fomat Người ta sản xuất pepsin từ dày động vật Nhưng khác với pepsin, renin có khả đơng tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein Renin chế phẩm enzyme có giá trị lớn cơng nghiệp Ở thực vật: thơng thường enzyme hay có mặt quan dự trữ hạt, củ, Cơ quan dự trữ giàu chất nhiều enzyme chuyển hóa chất Ví dụ hạt thầu dầu có nhiều lipase, hạt đậu tương có nhiều enzyme urease Thóc nảy mầm chứa nhiều - amylase, củ khoai lang lại có nhiều β - amylase Người ta thu số chế phẩm enzyme thủy phân papain, bromelain, fixin từ thực 3/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme vật bậc cao Papain thu từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ phận (lá, thân, quả) dứa, fixin tách từ dịch ép thân Ficus Qua nguồn ngun liệu động, thực vật từ chiết xuất chế phẩm enzyme, thấy hai nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất chế phẩm enzyme với quy mô lớn nhược điểm sau đây: - Chu kỳ sinh trưởng chúng dài - Nguồn nguyên liệu không cải tạo - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn nhu cầu kinh tế quốc dân Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm bật có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, khắc phục khó khăn hạn chế Trước hết vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây nguồn nguyên liệu mà người chủ động tạo Chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) ni cấy hàng trăm lần năm Enzyme vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vượt xa sinh vật khác Vì cần lượng nhỏ enzyme chuyển hóa lượng lớn chất Số liệu tính tốn cho biết, vịng 24 giờ, vi sinh vật có khả chuyển hóa lượng thức ăn gấp 30 40 lần so với trọng lượng thể chúng Trong đó, hệ enzyme lợn 50 kg chuyển hóa vài kg thức ăn ngày Hệ enzyme vi sinh vật vô phong phú Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, có enzyme động, thực vật khơng tổng hợp Ví dụ cellulase, raxemase Phần lớn thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm giá rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả phát triển môi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm phế liệu ngành sản xuất Hơn nữa, dùng ngun liệu khơng phải thực phẩm, dung dịch muối vô để nuôi vi sinh vật Vì dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh hiệu kinh tế cao Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, tỷ lệ enzyme tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme sản xuất thời gian ngắn Đối với số trường hợp dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme 4/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Vi sinh vật nhạy cảm tác động môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng số tác nhân lý hóa, học khác Do thay đổi điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta điều khiển tổng hợp enzyme dễ dàng nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme tổng hợp tổng hợp định hướng enzyme Tuy trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý số vi sinh vật có khả sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung vi sinh vật muốn sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn điều kiện sau: - Khả tổng hợp enzyme mạnh thời gian ngắn - Dễ tách enzyme khơng sinh độc tố Có điều lí thú là: điều kiện bình thường, vi sinh vật tổng hợp lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý thể chúng ( thường gọi tổng hợp enzyme "bản thể") Nếu tăng hàm lượng số chất thêm số chất vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt chất enzyme, tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên cách đáng kể, khác thường có tổng hợp enzyme mới: tượng gọi cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên cảm ứng sinh tổng hợp gọi chất cảm ứng Sự tổng hợp lượng đáng kể enzyme gọi siêu tổng hợp enzyme Để thu nguồn enzyme dồi từ vi sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng Có hai phương pháp ni cấy vi sinh vật để thu enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp nuôi cấy bề sâu phương pháp phương pháp chìm Trong phương pháp ni cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát triển bao phủ bề mặt hoạt chất dinh dưỡng rắn, làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, cám mì, bắp xay nhỏ ) Để môi trường xốp người ta trộn thêm lượng nhỏ mạt cưa Sau nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường sấy nhẹ, nghiền nhỏ Chế phẩm thu dạng rắn - thơ Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách tinh chế enzyme Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy bề sâu người ta cho vi sinh vật phát triển mơi trường lỏng Ngun liệu phổ biến dịch đường glucose, fructose, maltose, saccharose dịch thủy phân cellulose, tinh bột Nguồn nitơ hữu thường dùng nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men Cần chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật tổng hợp enzyme theo mong muốn Sau nuôi, ta thu canh trường lỏng - dạng thô Để làm tăng lượng enzyme vi sinh vật cần ý tuyển lựa chọn giống chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp enzyme cần thiết với 5/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme số lượng nhiều Các chủng phân lập theo phương pháp thông thường tổng hợp lượng nhỏ enzyme (enzyme thể), cần tiến hành gây đột biến phương pháp sinh học, lý, hóa học để tạo chủng có khả siêu tổng hợp enzyme Vi sinh vật sau tuyển chọn, cần nhân giống nuôi điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme Ngoài cần phải chọn mơi trường thành phần mơi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng tổng hợp enzyme vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ chất đảm bảo sinh trưởng bình thường vi sinh vật tổng hợp enzyme Để tăng tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào tượng cảm ứng Vì thành phần mơi trường có chất cảm ứng chất hay sản phẩm phân giải kìm hãm làm yếu tác dụng kìm toả chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả sinh tổng hợp enzyme cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường chất tương ứng enzyme cần tổng hợp Muốn tách α - amylase nấm mốc (Asp Oryzae), người ta cho vào môi trường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid có chứa liên kết α - 1,6 glucozid Muốn tách pectinase Asp Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin Đối với hemicellulase chất cảm ứng hemicellulose; cịn proteinase chất cảm ứng có hiệu lực protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ở Actinomyces fradiae) Chất cảm ứng chất giống chất sản phẩm thủy phân chúng Thay cho protein peptid thay cho tinh bột erithrodextrin có tác dụng cảm ứng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C Trị số pH ban đầu môi trường (chủ yếu mơi trường nước) gây ảnh hưởng đến tạo thành enzyme, cần tính đến khả biến đổi nhanh chóng số vi sinh vật Thơng thường α amylase, pH tối ưu cho sinh tổng hợp (pH = - 8) khác với pH tối ưu cho hoạt động (pH = 4,7 - 4,9) Các enzyme đường hóa khác nấm mốc glucoamylase pH tối ưu cho sinh tổng hợp cho hoạt động chung (4,5 - 5,0) Độ thơng khí cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme Vì mơi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp trấu vào, mơi trường bề sâu (mơi trường dịch thể) , người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc việc quan trọng) Độ ẩm quan trọng (chỉ có tác dụng ni cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt 6/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Một điều cần nói thêm enzyme thường chứa tế bào sinh vật gọi enzyme tế bào (intracellular), sinh vật tiết mơi trường sống Đó enzyme ngồi tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết enzyme ngoại bào Chiết rút enzyme Muốn tìm hiểu tồn hoạt động sống thể sinh vật, phải biết chất biến đổi hóa học xảy mơ tế bào Điều thực tách tế bào khỏi mô chiết rút làm enzyme chứa chúng Từ dạng enzyme tinh khiết thu nghiên cứu sâu sắc chế tác dụng, tính đặc hiệu hoạt động xúc tác chúng Tùy theo đặc tính riêng biệt loại enzyme mà lựa chọn phương pháp làm cho thích hợp Trong q trình tinh chế enzyme, trình tự thủ thuật bước thay đổi , song có nguyên tắc chung Như biết, thể sinh vật, enzyme có tế bào chất cấu tử (nhân, microsome, ty thể, lysosome ) tế bào Tế bào bao bọc lớp màng Lớp màng vi khuẩn đơi bền dày Người ta cịn thấy nhiều enzyme liên kết chặt chẽ với cấu tử tế bào Các phân tử enzyme khơng có khả qua màng tế bào màng cấu tử tế bào Do để chiết rút enzyme nội bào, bước phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa enzyme chuyển chúng vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, làm đồng hóa thiết bị đồng hóa (homogenizator) Thiết bị có chày thủy tinh gắn với mơtơ quay điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào chày thủy tinh thành cối bị phá hủy Để việc phá vỡ có hiệu mô thực vật, trước nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá cho trương nước (ví dụ mẫu hạt khơ) Cịn mô động vật gan thận, chiết enzyme người ta cần cắt bỏ mô liên kết Muốn tách enzyme cấu tử tế bào, người ta phải dùng yếu tố vật lý hóa học khác sóng siêu âm, dùng dung môi hữu butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ cấu tử tế bào quan thường chứa mỡ Sau phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme chiết nước cất, dung dịch đệm thích hợp dung dịch muối trung tính Có số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết rút cần lưu ý Trước hết nhiệt độ Để tránh hoạt tính chí vơ hoạt, cần chiết rút tiến hành kết tủa enzyme 7/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme nhiệt độ thấp (từ đến 50C) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly làm tăng trình chiết rút enzyme NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng chúng phụ thuộc vào phương pháp dùng chiết rút Ví dụ dùng máy nung ba chất có tác dụng Nếu để lắng NaCl có tác dụng Vì cần dùng chất điện ly thích hợp Ví dụ chiết rút amylase, cho thêm NaCl 0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút hiệu suất chiết rút tăng lên 30% Người ta nhận thấy, thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% làm cho kết tủa enzyme tốt cấu trúc kết tủa tốt Trong trình chiết rút enzyme đối tượng động, thực vật, có trường hợp cịn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm xác định hoạt độ enzyme Trong trường hợp người ta cho thêm vào chất khử để loại màu Màu hemoglobin hồng cầu chlorophyll số chất màu khác bị loại trừ hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp Hoạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) - enzyme chống ơxy hóa xác định sau loại màu khỏi dịch chiết enzyme Ở mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu Người ta thường loại màu cột nhựa trao đổi ion cách cho dịch enzyme qua cột lắc Khi qua cột, chất màu bị giữ lại enzyme khơng bị giữ Ví dụ người ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) than hoạt tính Trong q trình phải ý kiểm tra pH Sau loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ enzyme Trong dịch chiết, enzyme cịn có protein cấu trúc, chất cao phân tử khác polysaccharid nucleic acid, chất có phân tử nhỏ đường monose, chất lipid, muối khoáng Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác Để loại bỏ muối khoáng loại đường tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel sephadex Cách làm thẩm tích sau: cho dung dịch enzyme vào túi colodion cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đặt túi vào nước cất dung dịch đệm pha lỗng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn) Màng cellophane màng bán thấm, có kích thước lỗ cho chất có phân tử nhỏ xuyên qua vào dung dịch đệm lỗng theo định luật khuếch tán Cịn lại màng chất protein có phân tử lớn (Hình 1) 8/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 kết tủa protein Để loại bỏ protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel Phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt pH môi trường dùng trường hợp enzyme bền với nhiệt bền với acid Thủ thuật tiến hành sau: dịch enzyme giữ 50 - 700C hay pH = thời gian xác định Protein bị biến tính loại bỏ cách lọc ly tâm Các phương pháp tách phần protein enzyme Protein chất lưỡng tính,vì dung dịch acid kiềm chúng bị phân ly sau: Ở số pH xác định, phân tử protein có điện tích tổng số mà độ lớn phụ thuộc vào số lượng nhóm tích điện dương tích điện âm Kết số nồng độ ion hydro cố định, protein khác hỗn hợp có tổng điện tích khác Nhiều phương pháp dùng để tách hỗn hợp protein dựa vào 9/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme đặc tính Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương âm) dấu đẩy xa nên dễ tan vào dung dịch Mỗi protein có trị số pH định mà tổng số điện tích âm điện tích dương phân tử khơng Trị số pH gọi điểm đẳng điện Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan protein thấp nhất, protein dễ bị kết tủa.Dựa vào tính chất này, người ta tách phần protein enzyme hỗn hợp Ở phương pháp tách phần này, người ta sử dụng phương pháp kết tủa thuận nghịch muối dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký cột Nói chung để đạt kết tốt, người ta thường phối hợp hai phương pháp với Dùng muối (NH4)2 SO4 để tách enzyme Phương pháp kết tủa phân đoạn (NH4)2 SO4 dựa sở khác khả kết tủa protein enzyme nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hịa) xác định dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp dịch enzyme Các loại muối dùng (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 người ta nhận thấy muối (NH4)2 SO4 tốt khơng làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết loại enzyme Loại muối lại rẻ phổ biến Độ hịa tan lại lớn (bão hịa 767g/l 250C) Ngồi nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa enzyme khác khác nhiều Ví dụ: Protease nấm mốc dễ bị kết tủa 70% (NH4)2 SO4 bão hịa hồn tồn, cịn amylase mầm lúa bị kết tủa 50% độ bão hòa dung dịch muối Điều nói lên tính kết tủa lựa chọn (NH4)2SO4 cao muối khác Thường dùng hai dạng bột bão hòa - Khi dùng bột: Người ta cho vào dịch chiết enzyme Cách cho ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo hòa tan muối - Khi dùng dung dịch bão hòa: Trong nhiều sách phương pháp nghiên cứu người ta đưa bảng tính số lượng muối cần thiết để pha dung dịch có độ bão hịa khác nhiệt độ định Khái niệm số phần trăm độ bão hịa hồn tồn đề cập đến Như ví dụ nói, enzyme bị kết tủa 50% (0,5) 70% (0,7) độ bão hịa hồn tồn (NH4)2 SO4 Khi cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết enzyme nồng độ (NH4)2 SO4 khơng tăng đột ngột 10/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Sau kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích tạo kết tủa hồn tồn (ở phương pháp dùng dung mơi hữu khơng cần để lâu) Kết tủa lấy cách ly tâm lọc qua phễu Buckner Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ làm bền (CaCl2 Ca(COOH)2) Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích trình bày phần trước Thời gian thẩm tích thường 24 - 28h, nước thay nhiều nhanh tốt Có thể loại muối cách lọc qua gel sephadex G25 dẫn suất dextran Ưu phương pháp tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm hoạt độ enzyme Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, enzyme có trọng lượng phân tử lớn xuống trước (xem phương pháp lọc gel 2.2.3.4.a) Giai đoạn làm đông khô thành bột trắng Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà khơng qua trạng thái lỏng Để tiện lợi người ta đưa cơng thức cách tính lượng (NH4)2 SO4 cho vào dung dịch có độ bão hịa cho trước (S1) để đạt đến độ bão hòa cần thiết (S2) Tùy theo trạng thái (NH4)2 SO4 cho thêm vào dung dịch chiết enzyme, mà có cơng thức tính tốn khác • Đối với (NH4)2 SO4 dạng bột Trong V thể tích dung dịch S1, S2 độ bão hòa cho trước độ bão hòa cần đạt ví dụ S1= 0,5 S2= 0,7 chẳng hạn Người ta dùng đồ tốn (nomogram) để chiếu xác định lượng (NH4)2 SO4 thêm vào để dung dịch enzyme đạt độ bão hịa định Hoặc đối chiếu bảng có sẵn Lượng (NH4)2 SO4 đưa vào để dung dịch có độ bão hịa định có khác tùy thuộc nhiệt độ thí nghiệm • Đối với (NH4)2 SO4 dạng dung dịch bão hịa Thể tích (tính theo ml) dung dịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hịa ban đầu S1 để đạt đến độ bão hòa S2 cần thiết tính theo cơng thức sau: 11/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Dùng dung môi hữu Phương pháp tiến hành dựa sở: độ hòa tan protein phụ thuộc vào tương tác nhóm tích điện phân tử protein với phân tử nước Sự tương tác (cịn gọi hydrate hóa) bị giảm xuống thêm vào dung dịch enzyme dung môi hữu Dung môi hữu thường dùng ethanol, isopropanol, acetone hỗn hợp loại rượu Ở phương pháp ý tiến hành nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống) Dùng dung mơi hữu tiến hành tách phân đoạn 00C đến - 200C, có tác dụng tốt đến độ ổn định protein enzyme Khi có kết tủa, ý lấy nhanh kết tủa khỏi dung môi cách dùng máy li tâm Phương pháp có lợi khơng cần loại muối, có nhược điểm hay có màu Dùng nhiệt Cũng dùng nhiệt để loại bỏ protein enzyme tạp khỏi dịch chiết enzyme Tuy phương pháp dùng enzyme bền với nhiệt Các kỹ thuật sắc ký cột Dịch chiết enzyme loại bỏ phần lớn protein tạp chưa đảm bảo độ đồng cần thiết Do dịch chiết enzyme tiếp tục làm phương pháp sắc ký cột Phương pháp sắc ký (chromatography) hai chữ "chroma" màu sắc " grapho" viết, nghĩa "viết màu" Thuở ban đầu, người ta sử dụng phương pháp sắc ký để tách chất màu sau người ta áp dụng cho việc tách chất không màu Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration) Cơ sở phương pháp lọc gel dựa vào khác kích thước hình dạng phân tử lượng enzyme có hỗn hợp để tách chúng 12/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Để đảm bảo cho việc tách enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất khơng hịa tan tương đối bền với yếu tố học sinh học Ngồi chất sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải chất khơng có tính đàn hồi (không co) phải chất ưa nước (hydrophyl) Gel sephadex chất thoả mãn yếu tố Sephadex chế phẩm dextran loài vi sinh vật khác Leuconostoc tạo chúng nuôi cấy môi trường chứa saccharose Trọng lượng phân tử dextran đạt tới hàng triệu lớn Phân tử dextran bao gồm chuỗi gốc glucose tạo thành liên kết glucsid 1,6 Sephadex nhận từ dextran cách xử lý hóa học (do tác dụng epichlohidrin) để tạo lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi "sàng phân tử" chất trở thành không tan nước Số liên kết ngang tạo nhiều, kích thước lỗ sàng phân tử nhỏ Phương pháp lọc sephadex tiến hành sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài cân bằng dung dịch đệm có pH định Sau cho dung dịch enzyme lên cột Khi lọc chiết dung mơi thích hợp, phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở muối) khuyếch tán chậm chạp qua lỗ nhỏ hạt Sephadex bị trương phồng, cịn chất có trọng lượng phân tử lớn (ở trường hợp protein enzyme ) khơng có khả vào mà lách nhanh qua hạt sephadex rơi xuống trước, chiết nhanh khỏi cột (Hình 2.2 hình 2.3.) Vì ta tách chất có trọng lượng phân tử cao khỏi chất có phân tử lượng nhỏ Hãng Sephadex (Pharmacia) Thuỵ Điển tung thị trường loại sephadex có kích thước khác có ký hiệu từ G10 đến G200 Số ký hiệu nhằm mức độ nhận (hút) nước chúng Ví dụ G10 để trương phồng 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g) Hoạt động lọc phân tử sephadex Các sephadex có ký hiệu khác từ G10 đến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng lượng phân tử khác lọt vào ngưỡng sau đây: 13/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Các loại sephadex Trọng lượng phân tử G 10 - 700 G 15 - 1.500 G 25 hạt tinh (F) hạt thô (C) 100 - 5000 G 50 hạt tinh (F) hạt thô (C) 1500 - 30.000 G 75 3.000 - 70.000 G 100 4.000 - 150.000 G 150 5.000 - 400.000 G 200 5.000 - 800.000 Các gel lọc phân tử sản xuất cỡ hạt vòng lọc phân tử: hạt thơ (coarse), hạt trung bình (medium), hạt mịn (fine), hạt siêu mịn, mịn (superfine) Tách phân tử theo kích thước sắc ký lọc gel Sự chênh lệch nhiều phân tử lượng enzyme (12700 - 1.000.000) cho phép nghỉ để tách làm enzyme, phương pháp lọc gel sephadex phương pháp có nhiều triển vọng Nơi có liên kết ngang tách chất có trọng lượng phân tử lớn ngược lại Người ta sử dụng sephadex để loại muối thay cho q trình thẩm tích 14/22 Phương pháp nghiên cứu enzyme Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polysaccharid, chế phẩm dextran sephadex (pharmacia) cịn có Molselect (Reanal) - sản phẩm Hungary ứng dụng nhiều nghiên cứu Có thể dùng để làm đặc chất có trọng lượng phân tử lớn protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh so với thẩm tích), lọc gel tách theo trọng lượng phân tử (như protein huyết thanh) tách sản phẩm protein hình thành tác dụng enzyme phân cắt (như ? - G - globulin bị cắt papain) Các Molselect có ký hiệu từ G10 đến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng lượng phân tử khác lọt vào ngưỡng sau đây: Các loại Molselect Trọng lượng phân tử G - 10