(LUẬN văn THẠC sĩ) tuyển chọn vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic ứng dụng cho nhân giống khởi động trong lên men sữa chua

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Thu Thủy TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CĨ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC ỨNG DỤNG CHO NHÂN GIỐNG KHỞI ĐỘNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Thu Thủy TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC ỨNG DỤNG CHO NHÂN GIỐNG KHỞI ĐỘNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đào Thị Lƣơng TS Phạm Thế Hải Hà Nội - 2017 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Lương, cán Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp giải vấn đề nảy sinh trình làm luận văn hoàn thành luận văn theo định hướng ban đầu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới : PGS TS Bùi Thị Việt Hà, TS Phạm Thế Hải quý thầy cô môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt kiến thức cho khóa học để tơi có tảng kiến thức thực nghiên cứu PGS TS Dương Văn Hợp, Viện trưởng Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học- ĐHQGHN toàn cán viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực đề tài Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học – ĐHQGHN Luận văn thực với hỗ trợ kinh phí từ đề tài ― Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn ứng dụng công nghiệp sản xuất sữa chua‖, mã số 05.13/CNSHCB Tôi xin cảm ơn tới KS Hà Thị Hằng, Ths Trần Thị Lệ Quyên, CN Nguyễn Hoàng Tuấn bạn phịng thí nghiệm nhiệt tình hỗ trợ tơi q trình làm thí nghiệm Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân ủng hộ, tin tưởng động viên tơi hồn thành luận văn Học viên Đỗ Thị Thu Thủy TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Sữa chua công nghệ sản xuất sữa chua 1.1.1 Lịch sử hình thành 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng vai trò sữa chua dối với sức khỏe 1.1.3 Thị trường sữa chua giới Việt Nam 1.2 Lên men sữa chua vi khuẩn lactic lên men sữa chua 1.2.1 Lêm men sữa chua 1.2.2 Các chủng vi khuẩn lactic dùng lên men sữa chua 12 1.3 Thực trạng nghiên cứu liên quan Việt Nam 20 Chƣơng – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 Nguyên vật liệu, hoá chất tthiết bị 21 2.1.1 Vi sinh vật 21 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 21 2.1.3 Môi trường 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Hoạt hóa chủng giống 22 2.2.2 Đánh giá khả lên men sữa 23 2.2.3 Nghiên cứu đặc tính probiotic chủng LAB 23 2.2.4 Khảo sát khả sinh trưởng chủng 27 2.3 Phân loại 27 2.3.1 Phân loại hình thái 27 2.3.2 Phân loại sinh học phân tử 28 2.4 Lựa chọn tổ hợp cho lên men 32 2.4.2 Lên men đa chủng 33 2.5 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp 34 2.5.1 Nghiên cứu môi trường ni cấy thích hợp 34 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 2.5.2 Nghiên cứu điều kiện cung cấp khí thích hợp 34 2.5.3 Nghiên cứu nhiệt độ ni thích hợp 34 2.5.4 Nghiên cứu pH ni thích hợp 34 2.5.5 Nghiên cứu nguồn cacbon thích hợp 34 2.5.6 Lựa chọn nguồn N thích hợp 34 2.5.7 Lựa chọn thời gian ni thích hợp 35 2.6 Thử nghiệm lên men quy mơ lít 37 2.6.1 Nghiên cứu tỉ lệ giống khởi động 37 2.6.2 Nghiên cứu tỉ lệ thành phần chủng tổ hợp 37 2.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men 37 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic mang đặc tính probiotic có khả lên men sữa 38 3.1.1 Khả lên men sữa chủng vi khuẩn lactic 38 3.1.2 Các đặc tính probiotic chủng vi khuẩn lactic 40 3.2 Phân loại 50 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng 50 3.2.2 Kết phân loại sinh học phân tử 51 3.3 Lựa chọn tổ hợp cho lên men 54 3.3.1 Lên men đơn chủng 54 3.3.2 Kết lên men đa chủng 55 3.4 Lựa chọn điều kiện ni thích hợp 60 3.4.1 Lựa chọn mơi trường ni thích hợp 60 3.4.2 Lựa chọn điệu kiện cung cấp khí thích hợp 61 3.4.3 Lựa chọn nhiệt độ ni thích hợp 62 3.4.4 Lựa chọn pH ni thích hợp 62 3.4.5 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp 63 3.4.7 Lựa chọn nguồn N thích hợp 64 3.4.8 Lựa chọn thời gian ni thích hợp 65 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 3.5 Kết thử nghiệm lên men 67 3.5.1 Lựa chọn tỉ lệ giống bổ sung 68 3.5.2 Lựa chọn tỉ lệ chủng tổ hợp lên men 69 3.5.3 Lựa chọn nhiệt độ lên men 71 3.5.4 Thử nghiệm lên men quy mơ lít 71 KẾT LUẬN 73 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com D NH M C CH VI T T T CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit) CMC Carboxymethyl Cellulose DNS axit 3,5-dinitrosalicilic EPS Exopolysaccharide LAB Vi khuẩn lactic MRS Môi trường Man Rogosa Sharpe NA Môi trường thạch thường OD Mật độ quang ONPG o-nitrophenyl-β-D-galactoside QPS Quy trình xử lý chất lượng VTCC Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH M C BẢNG Bảng 1.1 Nhu cầu sử dụng sữa quốc gia giới Bảng 1.2 Doanh số thị trường sữa chua năm gần Bảng 2.1 Các tiêu cảm quan sữa chua…………………………………………….33 Bảng 2.2 Mật độ quang phổ (OD575) nồng độ glucose khác 36 Bảng 3.1 Khả làm đông sữa chủng vi khuẩn lactic 39 Bảng 3.2 Một số đặc tính probiotic chủng lactic 40 Bảng 3.3 Khả chịu muối mật, chịu pH thấp tính kị nước chủng lactic 42 Bảng 3.4 Kích thước vịng kháng khuẩn chủng lactic 44 Bảng 3.5 Khả kháng chất kháng sinh chủng vi khuẩn lactic 47 Bảng 3.6 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn lactic 50 Bảng 3.7 Kết lên men sữa đơn chủng sau 10 54 Bảng 3.8 Thành phần loài tổ hợp lên men 55 Bảng 3.9 Kết lên men tổ hợp sữa chua 56 Bảng 3.10 Cảm quan sữa chua sau tuần 58 Bảng 3.11 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng LAB 63 Bảng 3.12 Chất lượng sữa chua thay đổi tỉ lệ giống ban đầu 69 Bảng 3.13 Chất lượng sữa chua thay đổi tỉ lệ thành phần tổ hợp 71 Bảng 3.14 Số lượng vi sinh vật trình lên men 71 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH M C HÌNH Hình 3.1 Khả lên men đường lactose chủng vi khuẩn lactic 38 Hình 3.2 Vịng phân giải cazein chùng BH chủng M01 41 Hình 3.3.Vịng kháng M luteus chủng vi khuẩn lactic đại diện 45 Hình 3.4 Vịng kháng L innocua chủng 2991 45 Hình 3.5 Khả sinh trưởng chủng LAB 49 Hình 3.6 Ảnh khuẩn lạc tế bào nhuộm gram chủng vi khuẩn lactic 51 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại chủng nghiên cứu số lồi có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự ADNr 16S 52 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại chủng nghiên cứu số loài có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Streptococcus dựa vào trình tự ADNr 16S 53 Hình 3.9 Sản phẩm sữa lên men từ TH1 57 Hình 3.10 pH sữa chua bảo quản 4oC sau tuần, tuần tuần 57 Hình 3.11 Khả sinh trưởng chủng LAB loại môi trường khác 61 Hình 3.12 Sinh trưởng vi khuẩn LAB điều kiện cung cấp khí khác 61 Hình 3.13 Sinh trưởng chúng LAB nhiệt độ khác 62 Hình 3.14 Sinh trưởng chủng LAB nguồn Cacbon khác 63 Hình 3.15 Sinh trưởng chủng LAB bổ sung hàm lượng đường khác 64 Hình 3.16 Sinh trưởng chủng LAB nguồn N khác 65 Hình 3.17 Sinh trưởng L bulgaricus M01 theo thời gian 65 Hình 3.18 Sinh trưởng L acidophilus 2991 theo thời gian 66 Hình 3.19 Sinh trưởng S thermophilus theo thời gian 66 Hình 3.20 pH theo thời gian lên men với tỉ lệ giống khác 68 Hình 3.21 pH theo thời gian lên men thay đổi tỉ lệ thành phần chủng tổ hợp 70 Hình 3.22 Biến động thành phần chủng trình lên men sữa 72 Hình 3.23 Thành phần tổ hợp khuẩn lạc sau lên men 72 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017) LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Sữa chua loại thực phẩm quan trọng cần thiết cho thể để tăng cường sức khỏe, ngăn ngừa bệnh tật, giữ vóc dáng cân đối, gọn gàng Rất nhiều bác sĩ, chuyên gia dinh dưỡng giới khuyến khích hình thành thói quen ăn sữa chua đặn ngày Sữa chua nguồn dinh dưỡng quý giá sử dụng từ ngàn năm Vào năm 1910, nhà bác học người Nga Ilya Metchnikoff đoạt giải Nobel cho khám phá vai trò sữa chua sức khỏe người Ngày 13-3-2009 Hà Nội, Viện Dinh dưỡng quốc gia tổ chức hội thảo khoa học ―Vai trò sữa chua dinh dưỡng sức khỏe‖ Phó giáo sư - tiến sĩ, Phó viện trưởng Viện Dinh dưỡng quốc gia (NIN) Lê Thị Bạch Mai cho rằng: ―Người Việt Nam nên hình thành thói quen ăn sữa chua ngày‖ Báo cáo phó giáo sư - tiến sĩ Nguyễn Văn Hoan (trưởng phòng quản lý khoa học Viện Dinh dưỡng quốc gia) buổi hội thảo nêu bật giá trị dinh dưỡng Cứ 100g sữa chua chứa khoảng 100kcal, có chất đường (15,4g), chất đạm (3,1g), chất béo (3g), canxi số loại vitamin , D, E… Trong 226g sữa chua (khoảng hộp) cung cấp 20% protein, 30-40% canxi lượng vitamin, khoáng chất quan trọng khác thể cần ngày Ngoài ra, nhiều lợi ích khác sữa chua tiếp tục tìm giảm tượng khơng dung nạp lactose, ngăn ngừa bệnh đường ruột, kích thích đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu hạn chế bệnh liên quan đến tim mạch [10,39,45,62] Đặc biệt sản phẩm sữa chua có bổ sung chủng vi khuẩn probiotic có khả kháng chất kháng sinh phối hợp điều trị kết hợp kháng sinh giúp bệnh nhân tăng cường sức đề kháng Là thực phẩm bổ dưỡng có nhiều lợi ích tình hình sử dụng sữa chua bữa ăn người Việt Nam thấp (