Tuyển chọn nghiên cứu các chủng vi khuẩn lactobacillus có khả năng sinh gamma aminobutyric acid gaba và một số đặc tính probiotic ứng dụng trong sản xuất các thực phẩm chức năng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Thị Anh Đào TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH GAMMAAMINOBUTYRIC ACID(GABA) VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÁC THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học) Mã số: 42 01 03 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS DƯƠNG VĂN HỢP Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa học thạc sĩ mình, tơi vô biết ơn thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật- Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS.Dương Văn Hợp, người tận tình hướng dẫn đóng góp nhiều kinh nghiệm q báu cho tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ nhiều suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Cuối tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, khuyến khích tơi suốt trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 27 tháng 10 năm 2018 Nguyễn Thị Anh Đào LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, luâ ̣n văn này là kế t quả nghiên cứu và làm viê ̣c của tôi, các nội dung nghiên cứu kế t quả trình bày luận văn là trung thực, rõ ràng Nếu có vấn đề xảy ra, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Hà Nội, ngày 27 tháng 10 năm 2018 Tác giả luâ ̣n văn Nguyễn Thị Anh Đào MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LÕÌI CAM ÐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN… 1.1 Probiotic ………………………………………………… 1.1.1.Định nghĩa…………………………………………………………… 1.1.2 Vai trò probiotic .2 1.2 Vi khuẩn lactictrong sản xuất probiotic………………… 1.2.1 Một số đối tượng vi sinh vật phổ biến sản xuất probiotic… 1.2.2.Vi khuẩn lactictrong sản xuất probiotic 1.3 Tổng quan Gamma - Aminobutyric Acid………………………… 10 1.3.1 Giới thiệu…………………………………………………………… 10 1.3.2 Hình dạng cấu trúc GABA…………………………………… 10 1.3.3 Thụ thể GABA……………………………………………………… 11 1.3.3.1.Thụ thể GABAA…………………………………………………… 12 1.3.3.2.Thụ thể GABAB…………………………………………………… 13 1.3.4 Quá trình tổng hợp GABA não…………………………………14 1.3.5 Cơ chế hoạt động GABA…………………………………………15 1.3.6 Chức GABA……………………………………………… 15 1.3.7 Các nguồn sinh tổng hợp GABA…………………………………… 17 1.3.8 Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn…………………………………….18 1.3.9 Tình hình nghiên cứu GABA…………………………………… 19 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 23 2.1 Nguyên liệu………………………………………………………… 23 2.2 Hóa chất thiết bị………………………………………………… 23 2.2.1 Hóa chất……………………………………………………………… 23 2.2.2 Thiết bị dụng cụ………… ………………………………………23 2.3 Các loại môi trường nghiên cứu…………………………………… 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 26 2.4.1 Phương pháp định tính GABA sắc ký mỏng (TLC)…………… 26 2.4.2 Phương pháp định lượng GABA………………………………………… 27 2.4.3.Phương pháp phân loại……………………………………………… 29 2.4.3.1.Phân loại dựa phân tích trình tự rDNA…………………… 29 2.4.3.2 Phân loại phương pháp quan sát hình thái…………………… 32 2.4.4 Xác định đặc tính probiotics chủng vi khuẩn lựa chọn… 33 2.4.4.1 Phương pháp xác định khả chịu axit………………………… 33 2.4.4.2.Phương pháp xác định khả chịu muối mật………………… 34 2.4.4.3 Phương pháp xác định khả sống môi trườngdịch dày dịch ruột giả lập…………………………………………… 34 2.4.4.4 Phương pháp xác định khả bám dínhinvitro ………………35 2.4.4.5 Phương pháp xác định khả kháng kháng sinh 36 2.4.4.6 Kiểm tra khả ức chế số chủng vi sinh vật gây bệnh …… 36 2.4.4.7 Phương pháp xác định khả sinh axit lactic………………… 37 2.4.5 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho trình tạo GABAvà sinh khối cao chủng vi khuẩn lựa chọn………………………… 37 2.4.5.1 Lựa cho ̣n môi trường…………………………………………… 38 2.4.5.2 Lựa cho ̣n nhiê ̣t đô ̣ nuôi cấ y thích hơ ̣p…………………………… 38 2.4.5.3 Lựa cho ̣n pH môi trường nuôi cấ y thích hơ ̣p…………………… 38 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………… 40 3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA……………… 40 3.2 Phân loại……………………………………………………………… 42 3.2.1 Phân loại dựa phân tích trình tự rDNA 42 3.2.2 Hình thái chủng Lactobacillus nghiên cứu………………… 43 3.2.2.1 Chủng VTCC-B-421…………………………………………… 43 3.2.2.2 Chủng VTCC-B-426…………………………………………… 44 3.2.2.3 Chủng VTCC-B-431…………………………………………… 45 3.2.2.4 Chủng VTCC-B-1450…………………………………………… 45 3.3 Xác định đặc tính probiotics chủng vi khuẩn lactic……… 46 3.3.1 Kết xác định khả chịu axit………………………………….47 3.3.2 Kết xác định khả chịu muối mật……………………………48 3.3.3 Khả sống sót dịch dày dịch ruột giả lập……………………………………………………………………………49 3.3.4 Khả bám dính màng nhầy ruộtinvitro 51 3.3.5 Kết xác định khả kháng kháng sinh……………………… 52 3.3.6 Kết kiểm tra khả ức chế số chủng vi sinh vật gây bệnh 54 3.3.7 Khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn……………………… 55 3.4 Kết nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho q trình tạo GABA sinh khối cao chủng vi khuẩn lựa chọn……………… 57 3.4.1.Kết lựa cho ̣n môi trường ………………………………………….57 3.4.2 Kết lựa cho ̣n nhiêṭ đô ̣ nuôi cấ y thích hơ ̣p…………………… .60 3.4.3 Kết lựa cho ̣n pH nuôi cấ y thích hơ ̣p………………………… .61 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………65 KẾT LUẬN…………………………………………………………………65 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT………………………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 67 Tài liệu tiếng Việt……………………………………………………… 67 Tài liệu tiếng Anh………………………………………………….……… 68 PHỤ LỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃCƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Vi sinh vật phổ biến sản xuất probiotic………… ……… Bảng 1.2: Vai trò chức sinh lý GABA ……………………… 16 Bảng 2: Mật độ quang phổ (OD 570nm) nồng độ GABA khác 29 Bảng 3.1.Kết sàng lọc khả sinh GABA chủng vi khuẩn Lactobacillus 40 Bảng 3.2: Khả sống sót dịch dày dịch ruột giả lập chủng vi khuẩn 50 Bảng 3.3: Khả bám dính màng nhầy ruột in vitrocủa chủng vi khuẩn 52 Bảng 3.4:Khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 53 Bảng 3.5:Khả ức chế số vi sinh vật gây bệnh chủng vi khuẩn 54 Bảng 3.6 : Khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn 55 Bảng 3.7: Khả sinh GABA sinh trưởng chủng vi khuẩn loại môi trường…………………………………………………… 58 Bảng 3.8: khả sinh GABA sinh trưởng chủng vi khuẩn nuôi cấy nhiệt độ khác nhau…………………………… 60 Bảng 3.9: Khả sinh GABA sinh trưởng chủng vi khuẩnkhi nuôi cấy nhiệt độ khác nhau……………………………………… 62 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Minh họa chế tác động probiotic………………………… Hình 1.2: Hình ảnh bám dính nấm men lên bề mặt E.coli Hình 1.3: Cấutrúcphântử GABA………………………………………… 11 Hình 1.4: Mơhìnhcấutrúcthụthể GABAA……………………………… 13 Hình 1.5:Mơ hình cấu trúc thụ thể GABAB………………………… 13 Hình 1.6: Con đường tổng hợp GABA…………………………………… 14 Hình 3.1: Khả sinh GABA chủng vi khuẩn lactic………… 41 Hình 3.2: Vị trí phân loại chủng nghiên cứu với lồicó mối quan hệ họ hàng gần……………………………………………… 43 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào (B) chủngVTCC-B-421… 44 Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào (B) chủng VTCC-B-26… 44 Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào (B) chủngVTCC-B-31… 45 Hình 3.6:Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào (B) chủngVTCC-B-450….46 Hình 3.7: Khả chịu axit chủng vi khuẩn……………………… 48 Hình 3.8: Khả chịu muối mật chủng vi khuẩn………………… 49 Hình 3.9: Khả chịu kháng sinh chủng VTCC-B-421(A) chủng VTCC-B-431(B)……………………………… 53 Hình 3.10: Khả ức chế Bacillus cereus (A) Salmonella enterica (B) chủng vi khuẩn……………………………… 55 Hình 3.11: Con đường chuyển hóa glutamate thành ABA………………… 64 BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribo nucleic Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations GABA Gamma - aminobutyric acid GAD Glutamic acid decarboxylase GRAS Generally Recognized as Safe HPLC High performance liquid chromatography LAB Lactic acid bacteria MSG Monosodium glutamate MRS De Man, RoGoSa and Sharbe (Medium for LAB) NA Nutrient agar NB Nutrient broth PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid TLC Thin layer chromatography WHO World Health Organization OD Optical Density CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.Từ 100 chủng vi khuẩn Lactobacillus lựa chọn chủng: VTCC-B-1450, VTCC-B-421, VTCC-B-431, VTCC-B-426 có khả sinh GABA cao Đã lựa chọn môi trường cám gạo, nhiệt độ 37 oC pH=5-6 thích hợp cho khả sinh GABA sinh trưởng chủng vi khuẩn lựa chọn Kết kết hợp nghiên cứu hình thái phân tích tương đồng trình tự rDNA 16S cho thấy chủng định danh sau: chủng VTCC-B431 VTCC-B-426 giống với loài Lactobacillus paracasei, chủng VTCC-B421 giống với loài Lactobacillus brevis chủng VTCC-B-1450 giống với loài Lactobacillus buchneri Cả chủng sinh GABA có tiềm cho nghiên cứu phát triển probiotic, có khả tồn đường tiêu hóa như: chịu axit, chịu muối mật, có khả sống sót dịch dày dịch ruột, có mặt chất kháng sinh, khả bám dính ruột, sinh bacteriocin, sinh axit lactic, nhiên chủng VTCC-B-431 chủng có tiềm khả sinh GABA cao (0,662mg/ml) 65 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT Sau thực đề tài đưa số đề xuất sau: GABA chất có ứng dụng quan trọng người, đặc biệt lĩnh vực y học Trong luận văn này, nghiên cứu nghiên cứu sơ ban đầu, chưa để vào thực tế Vậy nên xin kiến nghị số vấn đề cần nghiên cứu sâu để đưa GABA vào trình sản xuất ứng dụng thực tế -Cần chạy HPLC – sắc kí lỏng hiệu cao để xác định chắn khả sinh GABA chủng vi khuẩn lactic -Tối ưu điều kiện nuôi cấy, khảo sát thêm sinh trưởng, phát triển khả sinh GABA chủng vi khuẩn lactic khác thay đổi điều kiện môi trường (thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống cấy, thành phần mơi trường, lượng Sodium glutamate bổ sung thích hợp…) -Xây dựng quy trình lên men để đưa chủng nghiên cứu vào sản xuất thực phẩm chức giàu GABA 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO TiếngViệt Nguyễn La Anh, Quách Thị Việt, Đặng Thu Hương, Trần Thị Ngoan (2013), Nghiên cứu khả bám dính số chủng vi khuẩn probiotic màng nhầy ruột in vitro, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc 2013, tr 40-44 Trịnh Tất Cường (2012), Nghiên cứu qui trình sản xuất acid Gammaaminobutyric từ lên men dịch cám gạo Lactobacillus để ứng dụng làm thực phẩm chức năng, Báo cáo tổng hợp kết đề tài cấp nhà nước KC10.TN/11-15 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học NXB Khoa học Kỹ thuật Dương Minh Khải (2013) Nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả probiotic, sinh tổng hợp Gamma-aminobutiric acid ứng dụng Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2010), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng chế biến bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Chun san Cơng nghệ Sinh học, 6, tr.1- Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội Quách Thị Việt, Dương Minh Khải, Đặng Thu Hương, Trần Thị Ngoan, Nguyễn La Anh (2013), Nghiên cứu đặc điểm chủng vi khuẩn probiotic Lactobacillus brevis NCTH24 có khả sinh tổng hợp Gama - aminobutyric acid ứng dụng sản xuất Bio – yogurt, Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013, tr 649-653 67 Tiếng Anh Balasingham K., Valli C., Radhakrishnan L., Balasuramanyam D.(2017), “Probiotic characterization of lactic acid bacteria isolated from swine intestine”, Veterinary World, 10(7), pp.825-829 Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., Turck M.(1966), Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method, American journal of clinical pathology, 45(4) 10 Castor J.G.B.(1953), The B-complex vitamins of musts and wines as microbial growth factors, Applied Microbiology, (1), pp.97-102 11 Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C.(2007), Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from Kimchi and its Neuroprotective Effect on Neuronal Cells Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(1), pp.104-109 12 Chauhan P.B., Daru D.(2016), “ Isolation and characterization of Lactobacillus isolated from milk, curd and fecal sample and asigning their probiotic”, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 7(3), pp.1070-1075 13 Collins M.D., Gibson G.R.(1999), Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut, American Society for Clinical Nutrition, 69(5), pp.1052-1057 14.Cossart R., Bernard C., Ben-Ari Y (2005), "Multiple facets of GABAergic neurons and synapses: multiple fates of GABA signalling in epilepsies", Trends Neurosci, 28(2), pp.108-115 15 Curtis D.R., Johnston G.A.(1974) Amino acid transmitters in the mammalian central nervous system Ergebnisse der Physiologie, biologischen Chemie und experimentellen Pharmakologie, 69, pp.97-188 16 Dat L.Q., Ngan T.T.K., Nu N.T.X.(2017), “Gamma-amino butyric acid (GABA) synthesis of Lactobacillus in fermentation of defatted rice bran extract”, International Conference on Chemical Engineering Biotechnology, pp.1-7 68 Food and 17.Del Giudice M., De Luca M.G.(2004), The role of probiotics in the clinical management of food allergy and atopic dermatitis, Journal of Clinical Gastroenterology, 38 (6), pp.84-85 18.Dhakal R., Bajpai V.K., Baek K.H.(2012), Production of GABA (γaminobutyric acid) by Microorganisms, Brazilian Journal of Microbiology, 43(4), pp.1230-1241 19 Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D.E., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D.E., Marco G.(2010), Synthesis of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 86, pp.731-741 20 FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria 21.Fuller R (1989), Probiotics in man and animals, Journal of Applied Bacteriology, 66, pp.65-78 22.Gabor E.M., Vries E.J.D., Jansen D.B.(2003), " Efficien recovery of enviromental DNA for expression cloning by indirect extraction method", FEMS Microbiology Ecology, 44(2), pp.153-163 23.Hayakawa K., Kimura M., Kasaha K., Matsumoto K., Sansawa H., Yamori Y (2004), Effect of a γ-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar–Kyoto rats, British Journal of Nutrition, 92, pp 411-417 24 Higuchi T., Hayashi H., Abe K (1997), Exchange of glutamate and gaminobutyrate in a Lactobacillus strain, Journal of Bacteriology , 179, pp 3362–3364 69 25 Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J., Schillinger U., Huis In’t Veld J.H (1998), Overview of gut flora and probiotic International Journal of Food Microbiology, 41(2), pp 85-101 26 Hosseinimehr J.S., Fereshteh P., Moshtaghi E., Amini M (2010), “Colorimetric Determination of Baclofen with Ninhydrin Reagent and Compare with HPLC Method in Tablet”, A.J.Chemistry, 22(1), pp 522-526 27.Jena P.K., Trivedi D., Thakore K., Chaudhary H., Giri S.S., Seshadri S (2013), “Isolation and characterization of probiotic properties of Lactobacilli isolated from rat fecal microbiota”, Microbiol Immunol, 57, pp 407-416 28.Jeng K.C., Chen C.S., Fang Y.P., Hou R.C.W., Chen Y.S (2007), Effect of microbial fermentation on content of statin, GABA, and polyphenols in PuErh tea, Journal Of Agricultural And Food Chemistry, 55, pp 8787–8792 29.Jin Z., Mendu S.K., Birnir B (2011), “GABA is an effective immunomodulatory molecule”, Amino Acids, 45, pp 87-94 30 Juliano R.O (1985), Rice: Chemistry and Technology 2nd ed American Association of Cereal Chemists St Paul, Minnesota 31 Kastner S., Perreten V., Bleuler H., Hugenschmidt G., Lacroix C., Meile L.(2006), Antibiotic susceptibility patterns and resistance genes of starter cultures and probiotic bacteria used in food, Systematic and Applied Microbiology, 29(2), pp.145–155 32.Kim J Y., Lee M Y., Ji G E., Lee Y S., Hwang K T (2009), Production of γ-aminobutyric acid in black raspberry juice during fermentation by Lactobacillusbrevis GABA100, InternationalJournal of Food Microbiology, 130, pp 12–16 33.Kim S H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J (2007), Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 12, pp.707-712 34.Kimura M.(1980), A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequence, Journal of Molecular Evolution, 16, pp.111-120 70 35.Komatsuzaki N., Shima J., Kawamotoa S., Momosed H., Kimurab T (2005), Production of g-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods, Food Microbiol, 22, pp 497–504 36.Kook M.C., Seo M.J., Cheigh C.I., Pyun Y.R., Cho S.C., Park H (2010), Enhanced production of gamma-aminobutyric acid using rice bran extracts by Lactobacillus sakei B2-16, Journal of Microbiology, 20(4), pp.763-766 37.Kook M.C., Seo M.J., Cheigh C.I., Lee S.J., Pyun Y.R., Park H.(2010), “Enhancement of γ-Amminobutyric acid production by Lactobacillus sakei B2-16 Expressing Glutamate decarboxylase from Lactobacillus plantarum ATCC 14917”, Journai of the Koorean Society for Applied Biological Chemistry, 53(6), pp.816-820 38 Kos B., Suskovic J., Goreta J.,and Matosic S (2000), Effect of protectors on the viability of Lactobacillus acidophilus M92 in simulated gastrointestinal conditions, Food Technology and Biotechnology, 38, pp.121-127 39 Li H., Cao Y (2010), Lactic acid bacterial cell factories for gamma aminobutyric acid, Amino Acids, 39, pp.1107–1116 40.Li H., Gao D., Cao Y., Xu H (2008), A high γ-aminobutyric acidproducing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai, Annals of Microbiology, 58(4), pp.649–653 41.Li H., Qiu T., Huang G., Cao Y (2010), “Production of gamma-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis NCL912 using fed-batch fermentation”, Microbial Cell Factories, 9(1): 85 http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/85 42 Lim S., Seo M., Lee J., Nam Y., Lee S., Park S., Yi S., Lee M., Roh S.W, Cho H (2013), Production of γ- Aminobutyric Acid by Lactobacillus brevis 340G Isolated from Kimchi and Its Application to Skim Milk Food Engineering Progress, 17(4), pp 418–423 43 Lu X., Xie C., Gu Z (2008), Isolation of γ-aminobutyric acid-producing bacteria and optimization of fermentative medium, Biochemical Engineering Journal, 41, pp 48-52 71 44 Maras B., Sweene G., Barra D., Bossa F., John R.A (1992), The amino acid sequence of glutamate decarboxylase from Escherichia coli, European Journal of Biochemistry, 204, pp 93-98 45 Miller G.L.(1959): Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Analytical Chemistry, 31, pp 426-428 46 Ouwehand A C., Salminen S , Isolauri E (2002), Probiotic: an overview of beneficial effects, Antonie Van Leeuwenhoek, 82, pp 279- 289 47 Park S.Y., Kim K.S., Lee M.K., Lim S.D (2013), “Physiological Characteristics and GABA Production of Lactobacillus plantarum K255 Isolated from Kimchi”, Korea Food Research Institute, 33(5), pp 595-602 48 Patterson J.A., Burkholder K.M.(2003), Application of prebiotics and probiotics in poultry production, Journal of Animal Science, 82, pp.627-631 49.Qiu T., Li H., Cao Y (2010), Pre-staining thin layer chromatography method for amino acid detection, African Journal of Biotechnology, 9(50), pp 8679-8681 50.Roberts K.A., Wright J.W., Harding J.W (1993), GABA and bicucullineinduced blood pressure changes in spontaneously hypertensive rats, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 21, pp.156-162 51 Robert M., Kliegman M.D., Rodney E., Willoughby M.D (2005), Prevention of Necrotizing Enterocolitis With Probiotics., Pediatrics, 115(1), pp.171-172 52 Saikusa T., Horino T., Mori Y (1994), Distribution of Free Amino Acids in the Rice Kernel and Kernel Fractions and the Effect of Water Soaking on the Distribution Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42(5), pp.1122–1125 53 Saitou N., Nei M.(1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Molecular Biology and Evolution, 4, pp.406425 54.Servili M., Rizzello C.G., Taticchi A., Esposto S., Urbani S., Mazzacane F., Di Maio I., Selvaggini R., Gobbetti M., Di Cagno R (2011), Functional milk beverage fortified with phenolic compounds extracted from olive vegetation 72 water, and fermented with functional lactic acid bacteria, International Journal of Food Microbiology, 147(1), pp 45–52 55.Shelp B.J., Bown A.W (1997), The Metabolism and functions of γAminobutyric Acid, Plant Physiol, pp.1-5 56.Shelp B.J., Bown A.W., McLean M.D (1999) “Metabolism and functions of gamma-aminobutyric acid,” Trends in Plant Science, 4(11), pp 446-452 57 Siragusa S., Angelis M.De., Cagno R.Di., Rizzello C.G., Coda R., Gobbetti M.(2007), Synthesis of γ -aminobutyric acid by lactic acid bacteria isolated from a variety of Italian cheeses, Applied and Environmental Microbiology, pp.7283– 7290 58 Smith A.C., Hussey M.A.(2005), Gram Stain Protocols, American society for microbiology Microbel Library 59.Su Y.C., Wang J.J., Lin T.T., Pan T.M.(2003), “Production of the secondary metabolites γ-aminobutyric acid and monacolin K by Monascus”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 30(1), pp.41-46 60 Tajabadi N., Ebrahimpour A., Baradaran A., Abdul R.R., Mahyudin N A., Abdul M.M.Y., Abu B.F., Saari N (2015), Optimization of γ-Aminobutyric Acid Production by Lactobacillus plantarum Taj-Apis362 from Honeybees Molecules, 20(4), pp.6654–6669 61 Tsai J.S., Lin Y.S., Pan B.S., Chen T.J (2006), Antihypertensive peptides and gamma-aminobutyric acid from prozyme facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk, Process Biochem, 41, pp.1282–1288 62.Tsushida T., Murai T.(1987), Conversion of Glutamic Acid to γ-Aminobutyric Acid in Tea Leaves under Anaerobic Conditions Agricultural and Biological Chemistry, 51(11), pp.2865-2871 63.Tung Y.T., Lee B.H., Liu C.F., Pan T.M (2011), Optimization of Culture Condition for ACEI and GABA Production by Lactic Acid Bacteria Journal of Food Science, 76(9), pp.585-591 73 64 Watanabe M., Maemura K., Kanbara K., Tamayyama T., Hayasaki H (2002).GABA and GABA Receptors in the Central Nervous System and Other Organs International Review of Cytology, pp.1-47 65 Wood B.J.B., Holzapfel W.H.(1995), The genera of Lactic acid bacteria The Lactic acid bacteria, 2, pp.9-15 66.Yokoyama S., Hiramatsu J., Hayakawa K.(2002), Production of y- aminobutyric acid from alcohol distillery lees by Lactobacilusbrevis IFO – 12005, Journal of Bioscience and Bioengineering, 93(1), pp.95-97 WEB 67 https: //en.wikipedia.org/wiki/GABA-recepter 74 PHỤ LỤC - Trình tự gen mã hóa cho rARN 16S chủng VTCC-B-421 GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCTCAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAA TGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAG AACACATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCA CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCC GGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAA GCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGAGACTTGAGTGCAGAA GAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGA ACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAA GCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATG AGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGCTTGAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGA ACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAATCTTAGAGATAAGACGTTCCCTTC GGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTAGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCA GTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG ACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA CGGTACAACGAGTCGCGAAGTCGTGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTC TCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTA ATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGATAACCTTCGGG AGTCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA GCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT Trình tự gen có độ tương đồng 100% so với lồi Lactobacillus brevis ATCC14869 gần gũi -Trình tự gen mã hóa cho rARN 16S chủng VTCC-B-426 TACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCC AAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTG ATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTG TTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCT GATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTT GAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCC GTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCT AACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTT CCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTAGCC AGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTA CAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAA GCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC ACACCGCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACC CTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCGTA ACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT Trình tự gen có đ ộtương đồng 100% so với lồi Lactobacillus paracasei_ATCC334 gần gũi -Trình tự gen mã hóa ch orARN 16S chủng VTCC-B-431 AACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGAT CGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAC ACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAAT ACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTA TCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCAC CAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTG AGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATG GACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGT AAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGA CGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGG TTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAA AACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCT GTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTT CAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGG TTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTAGGAGCATGTGG TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTGACATCTTTTGATCACC TGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACA AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAA GCTAATCTCTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACAC GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGC CGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTA GGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCC TTT Trình tự gen có độ tương đồng 100% so với lồi Lactobacillus paracasei_ATCC334 gần gũi -Trình tự gen mã hóa ch orARN 16S chủng VTCC-B-1450 CAGGATATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCG CCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCA CTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGC CGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAA TAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACA CCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACG CGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCT CCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAG GTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACAAGCTAATAC GCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGACAGCCGAAGCCGTCTTTTAAACCAAAACCA GGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTA CTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTCTCAATG TTAAATCTTTCAAGTGCAAGCACCTAAAATCATTAACGGAGACGCGTTCGACT TGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCTGAAACCAAACTCTT T Trình tự gen có độ tương đồng 99,2% so với loài L buchneri AB205055 gần gũi DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Oanh, Lê Thị Hoàng Yến, Dương Văn Hợp (2018), Sàn glọc số vi khuẩn lactic sinh Gamma- aminobutyric acid nghiên cứu số đặ ctính probiotic chúng, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2018, tr.824-832 ... acid (GABA) số đặc tính probiotic ứng dụng sản xuất sản phẩm chức năng? ?? với mục tiêu: - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả sinh tổng hợp gamma- aminobutyric acid - Nghiên cứu số đặc tính. .. -Nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp GABA ứng dụng Bio-yogurt Năm 2013, Quách Thị Vi? ??t cộng (Vi? ??n Công nghệ thực phẩm) có nghiên cứu chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis NCTH24 có khả. .. hợp GABA[ 7] Tuy nhiên nghiên cứu nước tập trung nghiên cứu khả sinh GABA vi khuẩn lactic mà chưa nghiên cứu sâu đặc tính probiotic chủng Vì nghiên cứu tiến hành nghiên cứu để tìm chủng vi khuẩn