(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin p tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thùy Linh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thùy Linh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trương Nam Hải GS TS Phạm Văn Ty Hà Nội – 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Theo thống kê, năm Việt Nam có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân 100 - 200 ca tử vong Trong tháng đầu năm 2008, xảy 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 ngƣời mắc 43 ngƣời tử vong Có nhiều nguyên nhân dẫn tới ngộ độc thực phẩm nguyên nhân nhiễm vi sinh vật độc tố chúng chiếm 80%, chủ yếu chủng thuộc loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Clostridium botulinum, C perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii Escherichia coli O157:H7 [53] Các vi khuẩn phát triển nhiệt độ thấp (4-6o C), thịt ƣớp lạnh, thịt nguội, phô mai chƣa tiệt trùng gây rối loạn tiêu hóa, cân điện giải, kiệt sức Trƣờng hợp nặng dẫn đến tử vong khơng chữa trị cách kịp thời Trong năm gần đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm có liên quan đến L monocytogenes bùng phát nhiều nƣớc giới Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, Listeria đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO) xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cao lĩnh vực an tồn vệ sinh thực phẩm Listeria phân tán rộng rãi môi trƣờng đất, nƣớc, phân gia súc nên dễ lây nhiễm qua thực phẩm Tác hại loại vi khuẩn không dừng lại việc gây ngộ độc thực phẩm mà chúng gây bệnh lý nguy hiểm đặc biệt cho thai phụ nhƣ gây nhiễm trùng phôi thai, sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng máu [99] Một nguyên nhân khác gây ngộ độc thực phẩm chất phụ gia bảo quản chất tạo màu, tạo mùi trình xử lý, chế biến Thực phẩm đƣợc bảo quản chủ yếu dựa vào phụ gia tổng hợp hóa học qua chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất Điều khiến ngƣời tiêu dùng lo ngại tác động lâu dài có hại đến sức khỏe nhƣ đặt yêu cầu ngày tăng độ “tự nhiên”, giảm tối đa quy trình xử lý thực phẩm Bởi vậy, song song với vấn TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhu cầu phƣơng pháp bảo quản thực phẩm nhƣ chất bảo quản thực phẩm mới, chất diệt khuẩn an toàn có nguồn gốc sinh học, khơng độc hại sức khỏe ngƣời nhu cầu cấp thiết hầu khắp nƣớc giới Bacteriocin nhóm chất thu hút quan tâm nhà khoa học Thế giới nhằm đƣa vào ứng dụng công nghiệp thực phẩm Đây peptide protein vi khuẩn sinh ra, có khả ức chế tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh gây hƣ hỏng thực phẩm dù nồng độ thấp nhƣng lại an toàn ngƣời sử dụng dễ bị bất hoạt phân hủy dƣới tác động protease hệ tiêu hóa Trong số đó, enterocin P (EntP) đƣợc sinh tổng hợp từ chủng Enterococcus faecium P13, có phổ kháng khuẩn tƣơng đối rộng vi khuẩn Gram dƣơng gây bệnh thƣờng đƣợc phát thực phẩm nhƣ C perfringens, C botulinum, S aureus đặc biệt L monocytogenes EntP bền nhiệt, đảm bảo hoạt tính sau xử lý 100 o C 60 phút 121o C 15 phút Hoạt tính ổn định thời gian dài đƣợc bảo quản - 20o C 4o C [21] EntP cịn có khả hoạt động khoảng pH rộng, từ đến 11 Tuy nhiên, chủng vi khuẩn Enterococcus có khả sản sinh enterocin lại thƣờng sinh độc tố nên việc lên men, thu hồi enterocin dạng sạch, đủ tiêu chuẩn sử dụng thực phẩm gặp nhiều khó khăn Với mục tiêu tổng hợp EntP theo đƣờng tái tổ hợp nhằm chủ động điều khiển sinh tổng hợp enterocin hiệu suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho trình tinh sản phẩm, ứng dụng vào bảo quản thực phẩm, thực đề tài: “Nghiên cứu khả tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng bảo quản thực phẩm” Cơng trình đƣợc thực phịng Kỹ thuật Di truyền, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đƣợc hỗ trợ kinh phí thực từ đề tài cấp nhà nƣớc Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn chủ quản “Nghiên cứu công nghệ sản xuất sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin enterocin) dùng bảo quản nông sản thực phẩm” TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1.1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BACTERIOCIN Trong trình đấu tranh sinh tồn, vi sinh vật thƣờng tiết chất có khả kìm hãm, ức chế tiêu diệt vi sinh vật khác có cạnh tranh với chúng nơi sống nguồn dinh dƣỡng nhƣ axit hữu cơ, diacetyl, acetoin, peroxide hidro, reuterin, reutericyclin, peptide kháng nấm [36, 54, 55, 72], số phổ biến bacteriocin Bacteriocin peptide protein vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng khuẩn [25, 34, 43] Bacteriocin đƣợc Gratia phát vào năm 1925 với tên gọi principe V chủng E coli sinh Năm 1946, Gratia Fredericq đổi tên bacteriocin thành “colicin” Thuật ngữ bacteriocin đƣợc Jacob cộng đề xuất từ năm 1953 [17, 86, 87] Tƣơng tự “ase” sử dụng enzyme, tiếp tố “in” “cin” dùng để biểu thị hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Tiếp tố đƣợc viết thêm vào tên chi tên lồi Ví dụ, bacteriocin tiết từ E coli đƣợc gọi colicin, từ Bacillus subtilis đƣợc gọi subtilin Các chữ đứng sau tên bacteriocin thứ tự bacteriocin đƣợc tìm lồi Ví dụ, lactacin F bacteriocin thứ đƣợc tìm từ lồi thuộc chi Lactobacillus [53] Bacteriocin đƣợc phát hầu hết lồi vi khuẩn, đặc biệt số lồi có khả tiết hàng chục bacteriocin khác [86] Vi khuẩn cổ (Archaea) có khả sinh chất kháng khuẩn giống bacteriocin gọi archaeocin, điển hình họ halocin sinh vi khuẩn cổ thuộc chi Halobacterium [87, 92] Cho tới có hàng trăm bacteriocin đƣợc phát nghiên cứu Chúng đa dạng chủng sản sinh, kích thƣớc phân tử, tính chất vật lý hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn chế tác động [31] Tập hợp gen cấu trúc gen điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn đa dạng, nằm hệ gen (plantaracin A sackacin 674), plasmid (pediocin) [91], chí nằm TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com transposon nhƣ nisin đƣợc sinh từ L lactis [83] Mặc dù vậy, nay, số hàng trăm bacteriocin đƣợc phát nghiên cứu, có nisin bacteriocin đƣợc Tổ chức Nông lƣơng (Food and Agriculture Organization – FAO) Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) công nhận chất bảo quản thực phẩm từ năm 1969 đƣợc sử dụng rộng rãi 50 quốc gia Thế giới [17] Cùng có hoạt tính kháng khuẩn nhiên bacteriocin hồn tồn khác biệt với chất kháng sinh dùng y học Đa phần bacteriocin có phổ kháng khuẩn khơng rộng, chủ yếu ức chế tiêu diệt vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi tƣơng đồng, có cạnh tranh trực tiếp nơi sống nguồn dinh dƣỡng [67] So sánh bacteriocin kháng sinh dùng y tế [25] Đặc tính Bacteriocin Kháng sinh Mục đích ứng dụng Tổng hợp Hoạt tính Cơ tác động tế bào đích Yêu cầu tƣơng tác Thực phẩm Từ ribosom Phổ hẹp Ảnh hƣởng tới kết cấu màng tế bào Đôi cần cắt ngắn phân tử Y tế Sản phẩm trao đổi chất bậc Phổ đa da ̣ng Tùy thuộc phƣơng thức hoạt động Đích đặc hiệu Phƣơng thức hoạt động Hầu hết tạo lỗ màng tế bào chất (một số ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp thành tế bào) Chƣa thấy Màng tế bào đích nội bào Độc tính/tác dụng phụ Có Trong bối cảnh vi sinh vật kháng thuốc nay, song song với việc phát triển kháng sinh phổ rộng dùng y tế việc nghiên cứu bacteriocin đặc hiệu với nhóm vi khuẩn nhằm đƣa vào ứng dụng vấn đề đƣợc quan tâm đặc biệt lĩnh vực cơng nghệ thực phẩm sản phẩm chăm sóc sức khỏe 1.1.2 PHÂN LOẠI BACTERIOCIN Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn đa dạng phong phú, đƣợc tiết TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, đƣơ ̣c chia thành hai nhóm lớn bacteriocin vi khuẩn Gram âm bacteriocin vi khuẩn Gram dƣơng Vi khuẩn gram dƣơng có q trình điều hịa sinh tổng hợp bacteriocin đặc hiệu, bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc tổng hợp phụ thuộc vào hệ thống điều hòa thông thƣờng tế bào chủ điều kiện bất lợi Quá trình tiết bacteriocin vi khuẩn Gram dƣơng không giết chết thân vi khuẩn chủ, bacteriocin vi khuẩn Gram âm thƣờng đƣợc giải phóng thơng qua q trình tiêu bào [85] 1.1.2.1 Bacteriocin vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram âm sản sinh loạt bacteriocin đa dạng kích thƣớc phƣơng thức hoạt động, đƣợc đặt tên theo chi (nhƣ klebicin Klebsiella pneumoniae) hay theo loài vi khuẩn sản xuất (nhƣ colicin E coli, marcescin Serratia marcescens, alveicin Hafnia alvei, cloacin Enterobacter cloacae ) Tính riêng E coli, nhà khoa học phát đƣợc 30 loại bacteriocin Tuy nhiên, đến yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp bacteriocin đa dạng chúng chƣa đƣợc hoàn toàn sáng tỏ Việc nghiên cứu thông tin cần thiết, không giúp phân loại quần thể vi khuẩn mơi trƣờng tự nhiên mà cịn tìm bacteriocin có đặc tính cho nghiên cứu [87] Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc phân thành ba nhóm dựa vào kích thƣớc: Nhóm 1: bacteriocin dạng colicin (colicin-like bacteriocin - CLB) kích thƣớc lớn (25-80 kDa), nhóm 2: microcin kích thƣớc nhỏ (