CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.13. Xác định khả năng gây độc cấp tính và độ an toàn trƣờng diễn
TRƢỜNG DIỄN CỦA CHẾ PHẨM ENTEROCIN P TRÊN CHUỘT THUẦN CHỦNG DÕNG BALB/c
2.2.13.1. Phƣơng pháp thử độc cấp tính của chế phẩm HisentP
45 chuột BALB/c khoẻ mạnh, trọng lƣợng 25 – 30g/con, nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học, đƣợc chia làm 9 lô (5 chuột/lô), và bị bỏ
X33picZαA. Chế phẩm đƣợc cho uống một lần duy nhất ở các ở nồng độ thấp 0,25 mg/kg thể trọng (kgP), liều trung bình 2,5 mg/kgP, liều cao 25 mg/kgP và liều tối đa 100 mg/kg (kgP) tƣơng ứng với 8 lơ thí nghiệm [59]. Lơ 9 chuột đƣợc uống nƣớc cất là dung môi pha 2 loại chế phẩm HisentP và X33picZαA, đƣợc xem là lô đối chứng. Sau khi cho uống hoạt chất 1-2 giờ, chuột đƣợc ni dƣỡng bình thƣờng trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô sau khi cho uống chế phẩm HisentP và tính giá trị LD50 [10].
Trong đó: LD50: liều chết 50% động vật thí nghiệm, n: số động vật sử dụng trong từng lơ thí nghiệm, k: số lơ động vật, mi: số động vật chết đếm theo từng lô trong 72 giờ, d: khoảng cách giữa các mức liều, Xi: liều thuốc ở mức cao nhất, zi : hệ số phụ tính từ công thức zi = 2k-1-2i (i=1,2,3,.....k-1).
2.2.13.2. Phƣơng pháp xác định độ an toàn trƣờng diễn của chế phẩm HisentP
Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Abraham (1978). Trong đó: 90 chuột BALB/c khoẻ mạnh (gồm 25 chuột đực và 25 chuột cái) đƣợc nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học, đƣợc chia làm 9 lơ thí nghiệm (10 chuột/lơ với 5 chuột đực và 5 chuột cái/lô) nhƣ sau:
- Lô 1 đến 4: uống chế phẩm HisentP với liều 0,1; 0,5; 2,5; 10 mg/kgP/ngày.
- Lô 5 đến 8: uống chế phẩm X33picZαA với liều 0,1; 0,5; 2,5; 10 mg/kgP/ngày.
- Lô 9: uống nƣớc cất là dung mơi để hồ tan chế phẩm HisentP và X33picZαA. Thời gian thực hiện thí nghiệm là 90 ngày. Theo đó, hàng ngày chuột thí nghiệm đƣợc cho uống chế phẩm và theo dõi biểu hiện chức năng của chuột gồm khả năng di chuyển, khả năng thu nhận thức ăn, thức uống và khả năng phản xạ ánh sáng. Mổ chuột để quan sát sự biến đổi bất thƣờng của các nội tạng. Các chỉ tiêu nghiên cứu về độ an toàn trƣờng diễn của chế phẩm HisentP và X33picZαA sẽ gồm:
Ảnh hưởng của chế phẩm HisentP đến khả năng tăng trọng của chuột thí nghiệm
Chuột thí nghiệm ở tất cả các lơ nghiên cứu sẽ đƣợc kiểm tra trọng lƣợng LD50= Xk - d/2 - d/n x mk-1 i
vào các thời điểm 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày, 70 ngày, 80 ngày và 90 ngày và kiểm tra độ sai khác có ý nghĩa thống kê. Sau 90 ngày thí nghiệm, 3 chuột đực và 3 chuột cái chọn ngẫu nhiên từ các lơ thí nghiệm sẽ bị giết mổ để kiểm tra trọng lƣợng của một số cơ quan nội tạng quan trọng gồm: tim, gan, thận, lách. Riêng phổi sẽ đƣợc kiểm tra màu sắc trực quan. Đồng thời các mẫu nội tạng này sẽ đƣợc cố định trong formol để làm các tiêu bản tế bào nhằm kiểm tra bệnh tích có thể có.
Ảnh hưởng của chế phẩm HisentP đến một số chỉ tiêu enzyme và hóa sinh của chuột thí nghiệm
Chuột ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm (ngày 0) và sau khi kết thúc thí nghiệm (ngày 90) sẽ đƣợc lấy máu để làm các xét nghiệm sinh hoá gồm các chỉ tiêu về số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hoạt độ các enzyme creatine phosphokinase (CPK), serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT), serum glutamic purivic transaminase (SGPT) để đánh giá chỉ tiêu huyết học và chức năng gan thận theo phƣơng pháp của Bergmeyer (1974) [11].
Ảnh hưởng của chế phẩm HisentP đến khả năng sinh sản của chuột thí nghiệm
2 chuột đực và 2 chuột cái còn lại từ 5 lơ thí nghiệm ở trên sẽ đƣợc cho tạo cặp ngẫu nhiên và cho phối giống. Từ đây, tỉ lệ phối thành công cũng nhƣ số lƣợng chuột con/đàn của lơ thí nghiệm sẽ đƣợc so sánh với lơ đối chứng để kiểm tra sự sai khác về mặt thống kê. Nếu khơng có sự sai khác đáng kể thì chế phẩm HisentP sẽ đƣợc xem là có độ an tồn sinh sản và an toàn cho sử dụng lâu dài.
2.2.13.3. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Các số liệu đƣợc xử lí theo thuật tốn thống kê dùng trong y - sinh - dƣợc, bằng hệ thống Student t-test.