Plasmid/chủng Đặc điểm
pJET1
Kích thƣớc 3128 bp, có chứa gen kháng ampicillin, vùng đa nối nằm trong gen eco47IR gây chết tế bào E. coli
Đƣợc sử dụng để tách dòng, phù hợp cho cả các đoạn DNA đầu dính và đầu bằng.
pTWIN1
Kích thƣớc 7375 bp, đƣợc thiết kế trình tự DNA mã hóa cho cho 2 protein intein có thể dung hợp với protein đích là intein 1 (Ssp DnaB mini-intein) và intein 2 (Mxe GyrA mini-intein). Protein đích đƣợc thu hồi nhờ cơ chế phân cắt protein dung hợp bởi pH hoặc DTT.
Đƣợc sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli.
pPIC9
Có chứa gen kháng ampicillin dùng cho chọn lọc trong E. coli và gen
HIS4 (histidinol dehydrogenase) dùng làm dấu chuẩn chọn dòng trong
nấm men.
Đƣợc sử dụng làm vector biểu hiện trong nấm men
pPICZA
Có chứa gen kháng zeocin dùng làm dấu chuẩn chọn dòng trong cả E.
coli và nấm men
Đƣợc sử dụng làm vector biểu hiện trong nấm men
E. coli ER2566 Chứa gen mã hóa cho T7-RNA polymerase
Mang các đột biến mất khả năng tổng hợp một số protease
P. pastoris GS115
Mang gen his4 làm mất khả năng tổng hợp histidine và gen AOX1 (alcohol oxidase) giúp nấm men sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa methanol là nguồn cacbon duy nhất.
P. pastoris X33 Mang gen AOX1 giúp nấm men sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. CÁC CHỦNG VI SINH VẬT, DNA VÀ PLASMID
2.1.1.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1
relA1 lac U169 (80 lacZM15)] của hãng Invitrogen đƣợc sử dụng để chọn
dòng và nhân dòng gen.
- Chủng vi khuẩn E. coli ER2566 [fhuA2 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr- 73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--TetS) endA1 (mcrC-
mrr)114::IS10) của hãng BioLabs đƣợc sử dụng làm tế bào biểu hiện.
- Chủng vi khuẩn B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 13709 (Viện Hóa học - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam), L. plantarum JCM1149, L. plantarum A88 JCM1048, L. algilis Lp A17, L. salivarius Lp B33, L. fermentum Lp B14,
E. faecium JCM5804, E. faecium B650, S. Thermophilus Str. Thermo , E. coli,
B. cereus, L. monocytogenes ATCC 35152 (Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện
Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đƣợc sử dụng làm sinh vật chỉ thị để đánh giá khả năng kháng khuẩn của EntP tái tổ hợp.
- Chủng nấm men P. pastoris GS115 [his4] và P. pastoris X33 của hãng
Invitrogen đƣợc sử dụng làm chủng biểu hiện.
2.1.1.2. Plasmid
Plasmid pJET1/blunt (Fermentas) đƣợc sử dụng làm vector tách dòng. Hệ vector pTWIN1 (BioLabs), pPIC9 và pPICZA (Invitrogen) đƣợc sử dụng làm vector biểu hiện. Trình tự gen mã hóa cho EntP đƣợc lấy trên ngân hàng Gen quốc tế (Genbank) với ký hiệu AF005726.1.
2.1.1.3. Các trình tự DNA mồi
Mồi dài xuôi (ký hiệu entP-F1, bảng 2.1) gồm 91 nucleotide mang trình tự từ nucleotide thứ 1 đến nucleotide thứ 75 của gen entP với 2 nuclceotide đƣợc cải biến
là T thay cho G và T thay cho C tại vị trí 6 và 48 nhằm tránh bộ ba hiếm trong chủng biểu hiện mà vẫn đảm bảo trình tự amino acid trong protein sau dịch mã. Mồi dài ngƣợc (ký hiệu entP-R1, bảng 2.1) gồm 90 nucleotide mang trình tự từ nucleotide thứ 54 đến nucleotide cuối cùng (135) của gen entP. Hai mồi có một
đoạn trình tự 18 nucleotide (đoạn gạch chân) có thể bắt cặp bổ sung ở nhiệt độ gắn mồi.
Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong luận án
STT Ký hiệu
mồi Trình tự DNA Mơ tả
1 entP-F1 tcttctcgaggacccggctactcgttcatatggtaatggtgtttattgt aataatagtaaatgttgggttaactggggagaagctaaagag
Mồi dài, xuôi, thay thế 2 nucleotide 2 entP-R1 aattgcggccgcttaatgtcccatacctgccaaaccagaagccca
gccactaataacgattcctgcaatattctctttagcttctcccca Mồi dài, ngƣợc 3 entP- F2E/NdeI gcatatggctactcgttcttatggtaa NdeI Mồi ngắn, xi, thêm ví trí cắt NdeI 4 entP- R2E/SapI tgctcttctgcaatgtcccatacctgccaa SapI Mồi ngắn, ngƣợc, thêm ví trí cắt SapI 5 entP- pastoris F3/XhoI tctctcgagaaaagagctactcgttcatatggtaatggtgtttat XhoI Mồi ngắn, xuôi, thêm ví trí cắt XhoI 6 entP- pastoris F4/EcoRI EcoRI gtagaattccatcatcatcatcatcatgacccggctactcgttcatat ggtaatggtgtttat Mồi ngắn, xi, thêm ví trí cắt EcoRI 7 entP- pastoris R3/NotI aattgcggccgcttaatgtcccatac NotI Mồi ngắn, ngƣợc, thêm ví trí cắt NotI
8 5’ AOX1 5’ gactggttccaattgacaagc 3’ Mồi nhân đoạn gen
vùng AOX1
9 3’ AOX 5’ gcaaatggcattctgacatcc 3’ Mồi nhân đoạn gen
vùng AOX1
Mồi ngắn, xuôi entP-pastoris F3/XhoI, đƣợc thiết kế vị trí nhận biết bởi XhoI và trình tự cắt Kex2 ngay trƣớc đầu 5’ của gen entP nhằm bảo đảm trình tự hồn
toàn tự nhiên của peptide EntP sau khi dịch mã trong nấm men. Mồi ngắn xi entP-pastoris F4/EcoRI đƣợc thiết kế vị trí nhận biết bởi EcoRI và đoạn trình tự 6 histidine – asparagin – prolin (vị trí phân cắt bởi acid formic) ngay trƣớc gen entP phục vụ cho mục đích tinh sạch peptide trong dịch ni cấy sau dịch mã. Các cặp mồi khác có kích thƣớc từ 27 – 30 nucleotide đƣợc thiết kế thêm vị trí nhận biết của enzyme hạn chế ở 2 đầu để có thể dễ dàng đƣa gen entP vào các vector tƣơng ứng khác nhau. Các mồi đều đƣợc tổng hợp bởi hãng Amersham Pharmacia Biotech.
2.1.2. HÓA CHẤT, ENZYME VÀ KHÁNG THỂ
2.1.2.1. Hóa chất
SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); isoamylalcohol, chloroform (Roth, Đức); phenol, EtBr (Ethidium bromide), glycerol, agarose (Gribco, Mỹ); ethanol, agar (Fluka, Đức); ampicillin, methanol, ethanol, sorbitol, dextrose, K2HPO4, KH2PO4, tricin (Merk, Đức); cao nấm men, peptone, d-NTPs (Promega, Mỹ); MgSO4 (BioLabs, Anh); MgCl2, CaCl2, NaOH, NaCl, potassium acetate, axit acetic, glucose, hóa chất trong bộ kit tinh sạch DNA (Qiagen, Đức); zeocin (Invitrogen), yeast nitrogen base (YNB, Difco) Biotin (Bayer, Đức), IPTG, polyacrylamide, lysozyme, triton X-100, urea, DTT (1,4-Dithiothreitol), ammonium sulfate.
2.1.2.2. Enzyme
Các enzyme: SapI, NdeI, PstI, EcoRI, NotI, XhoI, NdeI Taq-DNA
polymerase, Klenow, T4-DNA ligase (New England BioLabs, Mỹ).
2.1.2.3. Kháng thể
Kháng thể kháng hexahistidin (Histag) và kháng thể kháng CBD từ huyết thanh thỏ (BioLabs). Kháng kháng thể thỏ cộng hợp Peroxidase, kháng thể cộng hợp HRPO (Horse radish peroxidase) (Sigma).
2.1.3. MÁY MÓC VÀ THIẾT BỊ
Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm eppendorf, máy điện di DNA (Bio-Rad, Mỹ), máy biến nạp bằng xung điện, bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose, máy Speed-Vac, máy điện di protein (Bio-Rad, Mỹ), tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn
(Metler, Thụy Sỹ), máy biến tính mẫu, bộ chuyển màng (Bio-Rad, Mỹ).
2.1.4. CÁC DUNG DỊCH VÀ MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG
2.1.4.1. Dung dịch
Các dung dịch dùng cho tách chiết và điện di DNA
Dung dịch I (Sol I): Tris-HCl 25 mM, pH 8; EDTA 10 mM, pH 8; glucose 50 mM. Dung dịch II (Sol II): NaOH 0,2 %; SDS 1 %. Dung dịch III (Sol III): kali acetate 3 M; acid acetic 5 M. Dung dịch đệm SCED: sorbitol 1 M; sodium citrate 10 mM pH7,5; EDTA 10 mM; DTT 10 mM. Dung dịch đệm TE: Tris HCl 10 mM; pH 7,4; EDTA 1 mM, pH 8. Dung dịch chloroform/isoamylalcohol (24:1): 24 lần thể tích chloroform hịa vào với 1 lần thể tích isoamylalcohol. Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1): 25 lần thể tích phenol cộng với 24 lần thể tích chloroform và 1 lần thể tích isoamylalcohol. Dung dịch đệm TAE 50 lần (50X - 100 ml): Tris 24,2 %; acid acetic: 5,71 ml; EDTA 0,5M pH 8: 10 ml. Đệm tra mẫu (loading dye 6X): Bromophenol blue 0,25 %; xylen cyanol FF 0,25 %; glycerol 30 %. Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBr) 0,5 g/ml.
Các dung dịch dùng trong điện di Glycine-SDS-PAGE
AB 30-0,8: hòa tan 30 gam acrylamide và 0,8 gam bis-acrylamide trong 100 ml nƣớc cất vô trùng, bảo quản ở 4oC. Đệm Tris-HCl, pH 8,8: Tris 0,75 M; SDS 0,2 %, chỉnh pH đến 8,8 bằng HCl. Đệm Tris-HCl, pH 6,8: Tris 0,25 M; SDS 0,2 %, chỉnh pH đến 6,8 bằng HCl. SDS 10 %; glycerol 50%; APS 10%; TEMED. Đệm xử lý mẫu (Treatment buffer 6X) : Tris-HCl (pH 6,8) 350mM; glycerol 30%; SDS: 10%; 2-Mercaptoethanol: 6%; Bromophenol blue: 0,012%. Đệm chạy điện di (Running buffer), pH 8,4: Tris 0,05 M; Glycine 0,192 M; SDS 0,1 %. Dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue - CBB): CBB R-250 0,1%; methanol 40 %; acid acetic 10 %. Dung dịch rửa gel: methanol 30%; acid acetic 10%.
Các thành phần cho một bản gel Glycine - SDS:
STT Hóa chất Gel tách 12,6% (4,5 ml) Gel cô 0,5% (0,8 ml)
1 H2O 0,55 ml 0,45 ml 2 Tris-HCl 1,125 ml (1,5 M; pH 8,8) 0,2 ml (0,5 M; pH 6,8) 3 Glycerol 50% 0,9 ml 4 AB 30-0,8 1,89 ml 0,14 ml 5 SDS 10% 45 l 4 l 6 APS 10% 30 l 8 l 7 TEMED 3 l 1 l
Các dung dịch dùng trong điện di protein Tricine-SDS-PAGE
Điện di Tricine-SDS-PAGE đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Schagger [89] gồm có các hóa chất và dung dịch sau: Dung dịch acrylamide-bisacrylamide (AB)-3: hòa tan 48 g acrylamide và 1,5 g bisacrylamide (Serva) trong 100 ml vào nƣớc cất vô trùng, bảo quản ở 7 - 10o
C. Đệm gel (Gel buffer 3X): Tris 3 M; HCl 1 M; SDS 0,3%, chỉnh pH đến 8,45. Glycerol. APS 10%. TEMED. Đệm xử lý mẫu (treatment buffer 4X): SDS 12%; mercaptoethanol 6%; glycerol 30%; Coomassie blue G-250 0,05%; Tris/HCl (pH 7.0) 150 mM. Đệm chạy điện di cathode: Tris 0,1 M; Tricine 0,1 M; SDS 0,1%; điều chỉnh pH đến 8,25. Đệm chạy điện di anode: Tris 0,1 M; HCl 0,0225 M; điều chỉnh pH đến 8,9. Dung dịch cố định gel (fixing solution - dùng cho nhuộm bạc và cosmasie): methanol 50%; acetic acid 10%; ammonium acetate 100 mM. Dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue G- CBB): CBB G-250 0,025%; acid acetic 10 %. Dung dịch rửa gel: acid acetic 10%
Các thành phần của gel Tricine-SDS:
Hóa chất Gel 4% Gel 16%
AB-3 Gel buffer (3X) Glycerol H20 APS (10%) TEMED (ml) (ml) (g) (ml) (l) (l) 1 3 _ 12 90 9 10 10 3 30 100 10
Các dung dịch dùng trong nhuộm bạc
Dung dịch Sensitize: sodium thiosulfate 0,005%. Dung dịch bạc: silver nitrate 0,1%. Dung dịch hiện màu: sodium carbonate 2%; formaldehide 0,036%. Dung dịch dừng phản ứng: EDTA 50 mM
Các dung dịch dùng trong Western blot
Dung dịch chuyển màng (blotting buffer 1X): Tris-HCl 25 mM; glycine 192 mM; methanol: 20%. Dung dịch TBS: Tris-HCl 0,5 M pH 7,5; NaCl 2,5 M. Dung dịch TTBS: dung dịch TBS bổ sung 0,05% Tween-20. Dung dịch sữa: 5% sữa tách bơ (skim milk) trong TBS. Hỗn hợp hiện màu gồm dung dịch 1: 5 ml methanol + 15 mg chất hiện màu (4-chlorol-1-naphtol) và dung dịch 2: 25 ml TBS + 15 l H2O2 30% (trƣớc khi hiện màu trộn hai dung dịch này với nhau).
Các dung dịch dùng trong xử lý protein tái tổ hợp ở dạng thể vùi
Đệm B1: Tris 20 mM; EDTA 1 mM; NaCl 500 mM, chỉnh pH đến 8 bằng HCl. Dung dịch đệm phá tế bào: đệm B1 + lysozyme 0,1 mg/ml + PMSF 0,5 M. Dung dịch đệm rửa (washing buffer): đệm B1 + urea 2 M + DTT 10 mM hoặc đệm B1 + triton X-100 0,1%. Dung dịch biến tính protein: đệm B1 + urea 8 M
Các dung dịch dùng trong tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp
Dung dịch 1: natri phosphate 20 mM, pH 5,8. Dung dịch 2: 2-propanol 85%, pH 2,0. Dung dịch 3: 2-propanol 20% trong dung dịch TFA 0,1%.
Các dung dịch dùng cho pha môi trường nuôi cấy
Dung dịch YNB 10 lần (yeast nitrogen base with ammonium sulfate without aminoacids - 10X): hịa tan hồn tồn 134 g YNB vào 1000 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 4oC. Dung dịch H 100 lần (histidine 0,4% - 100X): hòa tan 400 mg L- histidine vào 100 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 40C. Dung dịch B 500 lần (biotin 0,02% - 500X): hòa tan 20 mg biotin vào 100 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 4oC. Dung dịch D 10 lần (dextrose 20% - 10X): hòa tan 200 g D-glucose vào 1000 ml nƣớc, khử trùng nhiệt hoặc lọc vô khuẩn. Dung dịch GY 10 lần (glycerol 10% - 10X). Dung dịch M 10 lần: (methanol 5% - 10X). Hòa 5 ml methanol vào 95 ml nƣớc, lọc vô khuẩn, giữ ở 4o C. Dung dịch đệm potassium phosphate 1 M, pH 6: hòa
132 ml dung dịch K2HPO4 1 M với 868 ml dung dịch KH2PO4 1 M, chỉnh pH đến 6 bằng H3PO4 hoặc KOH. Dung dịch CaCl2 0,1 M vô trùng, giữ ở 4o C. Dung dịch GYP (glycerol - yeast extract - peptone): glycerol 50%, yeast extract 10%, peptone 20%.
2.1.4.2. Môi trƣờng
Môi trƣờng BHI, MRS (Merk)
Môi trƣờng LB lỏng: cao nấm men 0,5%; tryptone 1%; NaCl 1%
Môi trƣờng chọn lọc LBA lỏng: LB lỏng bổ sung Amp nồng độ 100 g/ml. Môi trƣờng LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,6% agar.
Môi trƣờng LBA đặc: LBA bổ sung bổ sung Amp nồng độ 100 g/ml. Môi trƣờng LB nồng độ muối thấp: LB 0,5% NaCl.
Môi trƣờng YPD: cao nấm men 1%; peptone 2%; dextrose 2%.
Môi trƣờng MD (minimum dextrose medium - môi trƣờng tối thiểu chứa dextrose): YNB 1,34%; dextrose 1%; biotin 4x10-5 %. Khử trùng 800 ml nƣớc, làm nguội đến 60o C, sau đó thêm vào 100 ml dung dịch YNB 10X, 2ml dung dịch B 500X.
Môi trƣờng MGY (Minimum Glycerol Medium - môi trƣờng tối thiểu chứa glycerol): YNB 1,34%; glycerol 1%; biotin 4x10-5 %. Hòa vào 800 ml nƣớc vô trùng 100 ml YNB 10x, 2 ml B 500X và 100 ml GY 10X.
Môi trƣờng BMG (buffered minimal glycerol - môi trƣờng tối thiểu chứa đệm và glycerol): potassium phosphate 100 mM, pH 6; YNB 1,34%; glycerol 1%; biotin 4x10-5 %. Hòa vào 700 ml nƣớc vô trùng 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2ml B 500X và 100ml GY10X.
Môi trƣờng BMM (buffered minimal glycerol - môi trƣờng tối thiểu chứa đệm và methanol): potassium phosphate 100 mM, pH 6; YNB 1,34%; methanol 0,5%; biotin 4x10-5 %. Hịa vào 700 ml nƣớc vơ trùng 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2 ml B 500X và 100ml M 10X.
Môi trƣờng BMGY (buffered glycerol-complex medium - môi trƣờng đầy đủ - glycerol): 1% cao nấm men; 2% peptone, potassium phosphate 100 mM, pH 6;
YNB 1,34%; glycerol 1%; biotin 4x10-5 %. Hòa 10 g cao nấm men và 20 g peptone vào 700 ml nƣớc, khử trùng, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm vào 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2 ml B 500X và 100 ml GY10X.
Môi trƣờng BMMY (Buffered Glycerol-complex Medium - môi trƣờng đầy đủ - methanol): 1% cao nấm men; 2% peptone, potassium phosphate 100 mM, pH 6; YNB 1,34%; methanol 0,5%; biotin 4x10-5 %. Hòa 10 g cao nấm men và 20 g peptone vào 700 ml nƣớc, khử trùng. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm vào 100 ml potassium phosphate 1 M, pH 6; 100 ml YNB 10X; 2 ml B 500X và 100 ml M 10X.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. TỔNG HỢP GEN entP TỪ CẶP MỒI DÀI
Quá trình tổng hợp gen entP gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là tổng
hợp gen entP khuôn mẫu từ cặp mồi dài và giai đoạn 2 là nhân gen entP từ khuôn mẫu là sản phẩm của giai đoạn 1.
Giai đoạn 1 có thể thực hiện theo 2 cách: phản ứng PCR tự mồi và phản ứng
lấp đầy chuỗi nhờ enzyme Klenow.
Tổng hợp gen entP bằng kỹ thuật PCR tự mồi
PCR tự mồi là một trong các kỹ thuật phát triển từ PCR. Đây là phản ứng sử dụng cặp mồi dài có một đoạn trình tự DNA gối nhau để tiến hành tổng hợp kéo dài về hai phía của mồi. Giai đoạn gắn mồi trong phản ứng này đƣợc tiến hành ở nhiệt độ thấp nhằm tạo điều kiện cho cặp mồi bắt cặp với nhau và kéo dài. Sự bắt cặp
5’
5’ Klenow/Tag DNA polymerase
Cặp mồi dài với một đoạn trình tự gối nhau, tự bắt cặp bổ sung ở nhiệt độ gắn mồi
5’
5’ 3’
3’ Enzyme Klenow hoặcTag
DNA polymerase tổng hợp kéo dài chuỗi tạo gen entP hoàn chỉnh
tƣơng đồng và kéo dài của các đoạn đƣợc tiếp tục diễn ra ở các chu kỳ sau. Sản phẩm của lần PCR tự mồi này đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo nhằm tăng số bản sao mong muốn. Một mẫu phản ứng PCR tự mồi đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 l gồm các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Lƣợng (l)
Mồi xuôi entP-F1 (1 mM) 1 Mồi ngƣợc entP-R1 (1 mM) 1 Buffer for Taq (10X) 2,5
MgCl2 (25 mM) 2
dNTPs (2,5 mM) 2,5
Tag DNA polymerase (5u/l) 0,5
H2O 15,5
Tổng hợp gen entP nhờ phản ứng Klenow
Enzyme Klenow là một phân mảnh của DNA polymerase I có hoạt tính của DNA polymerase và 3’ 5’ exonuclease. Cặp mồi dài có một đoạn trình tự bổ sung đƣợc bắt cặp với nhau, khởi đầu cho quá trình lấp đầy chuỗi. Những phần khuyết sau khi mồi xuôi và mồi ngƣợc bắt cặp sẽ đƣợc enzym Klenow lấp đầy nhờ hoạt tính DNA polymerase. Tuy nhiên, Klenow cịn có tác dụng nhƣ một exonuclease nên enzyme này sẽ cắt những nucleotide ở đầu 3’-OH tự do. Một mẫu phản ứng Klenow đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 l gồm các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Lƣợng (l)
Mồi xuôi EntP F1 (1 mM) 3 Mồi ngƣợc EntP R1 (1 mM) 3 Buffer for Klenow (10X) 2,5
dNTPs (2,5 mM) 5
Klenow (5u/l - bổ sung sau) 2
H2O 9,5 Tổng thể tích 25 Chương trình PCR tự mồi: Bƣớc 1: 94o C - 2 phút Bƣớc 2: 94o C - 1 phút Bƣớc 3: 55o C - 1 phút Bƣớc 4: 72o C - 30 giây Bƣớc 5: Lặp lại 25 lần từ bƣớc 2 - 4 Bƣớc 6: 72o C trong 7 phút Bƣớc 7: giữ mẫu ở 4o C Chương trình phản ứng: Bƣớc 1: 94o C - 2 phút