Hoạt tính kháng một số vi khuẩn thƣờng gặp của HisentP

Chủng Nguồn Môi trƣờng AU (đơn vị/ml)

Bacillus subtilis ATCC 6633 PTHTSH LB -

Bacillus subtilis ATCC 7003 PKTDT LB -

Bacillus cereus ATCC 10702 VCNSTH LB -

Lactobacillus plantarium JCM1149 PKTDT MRS - L. plantarum A88 JCM1048 PKTDT MRS - L. plantarum A17 JCM1230 PKTDT MRS - L. plantarum B33 N4 BTGCVSV MRS - L. plantarum B14 LpA88 PKTDT MRS - L. algilis Lp A17 PKTDT MRS - L. salivarius Lp B33 PKTDT MRS - L. fermentum Lp B14 PKTDT MRS 800 Enterococcus faecium JCM5804 PKTDT MRS 1600 Enterococcus faecium B650 BTGCVSV MRS 800

Salmonella typhimurium ATCC 23555 PKTDT LB 0

Salmonella enteritidis ATCC 13076 PKTDT LB 0

Streptococcus thermophilus B650 PKTDT LB -

Staphylococcus aureus ATCC 13709 PTHTSH LB 1600

Staphylococcus aureus ATCC 14154 PKTDT LB 800

Listeria monocytogenes ATCC 35152 PKTDT BHI 1600

Listeria monocytogenes ATCC 43257 VCNSTH BHI 1600

Escherichia coli NC31 EcNC 31 PKTDT LB -

E. coli NC22 EcNC22 PKTDT LB -

E. coli NC10 EcNC10 PKTDT LB -

E. coli NC11 EcNC11 PKTDT LB -

E. coli K12TG1 EcK12TG1 PKTDT LB -

E. coli LCB Ec LCB PKTDT LB -

Bảng 3.12 tổng kết hoạt tính kháng khuẩn của dịch X33hisentP-etOH đối với một số chủng vi khuẩn kiểm định thƣờng gặp, đƣợc xác định thông qua phƣơng

pháp khuếch tán trên thạch đĩa (phần 2.2.12.2). Theo đó, dịch X33hisentP-etOH chứa HisentP có hoạt tính kháng L. fermentum, S. aureus, E. faecium, L. monocytogenes và khơng có hoạt tính kháng B. subtilis, B. cereus, L. plantarium

cũng nhƣ vi khuẩn Gram âm là E. coli.

Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới rằng EntP ở dạng tinh sạch có hoạt tính mạnh hơn (MIC thấp hơn rất nhiều) so với khi ở dạng protein trong dịch ni cấy. Thậm chí, EntP tinh sạch từ dịch ni cấy có thể ức chế một số chủng vi sinh vật nhƣ L. lactis ở MIC = 22 ng/ml, B. cereus ở MIC = 286 ng/ml, C. tyrobutyricum ở MIC = 412 ng/ml trong khi dịch nuôi cấy kết tủa cô đặc 20 lần lại không thể hiện vùng kháng khuẩn này [21]. Tuy nhiên, điều đáng quan tâm là dịch X33hisentP-etOH chứa HisentP ở dạng thô, chƣa tinh sạch đã thể hiện hoạt tính kháng các chủng gây ngộ độc thực phẩm là S. aureus và L.

monocytogenes khá mạnh (AU = 800 – 1600 đơn vị/ml).

Mặt khác, protein tái tổ hợp HisentP đƣợc sinh tổng hợp từ gen entP có

nguồn gốc từ E. faecium P13 đã thể hiện hoạt tính kháng E. faecium JCM5804 và E.

faecium B650. Nhƣ vậy, q trình tách dịng và biểu hiện gen hisentP trong nấm

men vẫn bảo lƣu đƣợc đặc tính này của protein HisentP tƣơng tự nhƣ EntP sinh ra từ chủng gốc. Điều này phản ánh đúng bản chất của protein kháng khuẩn, là các sản phẩm đƣợc sinh ra trong quá trình cạnh tranh sinh tồn giữa các vi sinh vật, nhằm ức chế, kìm hãm hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác có quan hệ gần gũi hoặc tƣơng đồng, cùng chung một ổ sinh thái.

3.5.2. ĐỘ ĐỘC CẤP TÍNH VÀ ĐỘ AN TỒN TRƢỜNG DIỄN CỦA HISENTP

3.5.2.1. Chuẩn bị chế phẩm HisentP cho thử độc tính trên chuột

Dịch X33hisentP-etOH có hoạt tính kháng khuẩn 1600 AU/ml đƣợc sử dụng để chuẩn bị chế phẩm HisentP dùng cho các thử nghiệm. Sau khi đông khô loại bỏ các dung mơi có thể tồn dƣ, protein khơ đƣợc hịa vào nƣớc cất vơ trùng đến thể tích nhƣ ban đầu. Hoạt tính kháng khuẩn, hàm lƣợng protein tổng số và nồng độ HisentP trong chế phẩm HisentP đƣợc xác định là không đổi. Dịch X33PICZA-

etOH cũng đƣợc xử lý tƣơng tự và chuẩn về nồng độ tƣơng đƣơng để làm đối chứng (ký hiệu X33piczαA). Tồn bộ thí nghiệm xác định độc tính cấp và độ an toàn trƣờng diễn của chế phẩm đƣợc gửi thực hiện độc lập tại Tổ Thử nghiệm Sinh học – Viện Cơng nghệ Sinh học.

3.5.2.2. Độ độc cấp tính của chế phẩm HisentP

Độ độc cấp tính của chế phẩm HisentP và X33piczαA đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Abrham (1978) và Turner (1965) nhƣ đã mô tả trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Sau khi cho uống HisentP và X33piczαA, chuột đƣợc theo dõi các biểu hiện bên ngoài và xác định số lƣợng chuột chết ở từng lơ trong vịng 72 giờ. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 1 phụ lục cho thấy khơng có chuột nào chết khi uống chế phẩm HisentP và X33piczαA ở các liều khác nhau. Do đó có thể kết luận chế phẩm HisentP và X33piczαA không gây độc cấp tính cho chuột thí nghiệm ở các liều nghiên cứu.

3.5.2.3. Độ an toàn trƣờng diễn của chế phẩm HisentP

Ảnh hƣởng của chế phẩm HisentP đến khả năng tăng trọng của chuột thí nghiệm

Sƣ̣ ảnh hƣởng của chế phẩm HisentP đến trọng lƣợng chuột uống trƣờng diễn đƣơ ̣c trình bày ở bảng 2 phụ lục cho thấy : trọng lƣợng chuột khi uống trƣờng diễn HisentP liều cao (10 mg/kgP) thấp hơn so với trọng lƣợng chuột ở lô đối chứng âm (uống nƣớc) và lô uống X33piczαA liều 10 mg/kgP tại các thời điểm nghiên cứu. Tuy nhiên đến liều trung bình 2,5 mg/kgP thì trọng lƣợng chuột khơng có sự sai khác so với lô chuột uống X33piczαA cùng liều và lô ĐC âm (với mức ý nghĩa p = 0.05).

Ở lô chuột uống HisentP liều thấp 0,5 mg/kgP và 0,1 mg/kgP, khối lƣợng chuột thí nghiệm tƣơng đƣơng với trọng lƣợng chuột ở lơ uống X33piczαA cùng liều và cao hơn so với lô đối chứng âm với mức ý nghĩa p = 0.05. Trong thí nghiệm này, chế phẩm X33piczαA ở các liều khác nhau khơng gây giảm trọng lƣợng chuột mà cịn có hiện tƣợng tăng trọng hơn so với lô ĐC âm (Bảng 2 phụ lục).

chuột thí nghiệm

Sau 60 ngày thí nghiệm, một số chuột đƣợc lấy máu để kiểm tra một số chỉ tiêu hóa sinh máu của chuột kết quả thể hiện ở bảng 3 phụ lục cho thấy:

Với các chỉ số huyết học

Các chỉ số về số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và hàm lƣợng hemoglobin ở các lơ chuột uống HisentP khơng có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với lơ đối chứng âm.

Ở lô uống HisentP liều 10mg/kgP, số lƣợng bạch cầu thấp hơn so với lô đối chứng âm, các lô khác số lƣợng bạch cầu tƣơng đƣơng với lô đối chứng âm (với mức ý nghĩa P = 0,05)

Lơ chuột thí nghiệm uống X33piczαA liều 10mg/kg P, số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và hàm lƣợng Hemoglobin thấp hơn so với lô đối chứng âm, tuy nhiên đến liều thấp hơn số lƣợng hồng cầu và hàm lƣợng hemoglobin trở lại bình thƣờng (tƣơng đƣơng với hàm lƣợng hồng cầu và Hb ở lô đối chứng âm).

Số lƣợng bạch cầu ở các lô uống X33piczαA không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với lơ đối chứng âm.

Các chỉ số sinh hóa máu

Hàm lƣợng creatinin ở tất cả các lơ thí nghiệm đều tƣơng đƣơng với lô đối chứng âm với mức ý nghĩa thống kê p = 0,05 phản ánh chức năng thận bình thƣờng, điều này chứng tỏ chế phẩm HisentP không gây ảnh hƣởng đến chức năng thận.

Hàm lƣợng SGOT ở các lơ thí nghiệm khơng có sự sai khác với lơ đối chứng âm (p = 0,05) tuy nhiên hàm lƣợng SGTP ở các lô chuột uống HisentP liều 10 mg/kg P, liều 2,5mg/kg P và X33piczαA liều 10mg/kgP lại cao hơn so với lô đối chứng âm ở mức ý nghĩa thống kê. Điều này chứng tỏ chuột uống HisentP và X33piczαA liều cao thì chức năng gan bị ảnh hƣởng. Hiện tƣơ ̣ng này có thể là do hàm lƣợng protein tổng số trong mẫu chế phẩm là quá lớn và chuột đã đƣợc cho uống liều cao trong mô ̣t thời gian dài.

Ảnh hƣởng của chế phẩm HisentP đến trọng lƣợng các cơ quan nội tạng

quan chuột thí nghiệm ở tất cả các lơ đều bình thƣờng, khơng có đặc điểm lạ hoặc bất thƣờng. Khối lƣợng các cơ quan trong cơ thể chuột khi cho uống HisentP và X33piczαA là tƣơng đƣơng nhau và tƣơng đƣơng với khối lƣợng các cơ quan của lô đối chứng âm là lô chuột chỉ uống nƣớc với mức ý nghĩa thống kê P = 0,05. Nhìn chung, các nội tạng có đặc điểm nhƣ sau:

- Gan: màu nâu đậm, bề mặt gan nhẵn, khơng có hiện tƣợng viêm, hoại tử, các tiểu thùy rõ.

- Thận: màu nâu, hai quả thận đều nhau, bề mặt nhẵn.

- Lách: rìa lách đều, nhẵn, màu nâu đậm hoặc nhạt, không sƣng, các đảo malpigi đều bình thƣờng

- Phổi: màu hồng nhạt và đều khắp, khơng có hiện tƣợng viêm hay nhục hóa

- Dạ dày, ruột: hình dạng bình thƣờng, khơng viêm, khơng có hiện tƣợng xuất huyết.

Ảnh hƣởng của chế phẩm HisentP đến khả năng sinh sản của chuột thí nghiệm

Để đảm bảo tính an tồn trƣờng diễn của chế phẩm HisentP, một chỉ tiêu sinh lý quan trọng nữa cần kiểm tra là khả năng sinh sản tạo thế hệ mới khỏe mạnh của chuột thí nghiệm . Các chuột đực và chuột cái từ các lơ thí nghiệm ở trên sau thời gian uống trƣờng diễn đƣợc cho tạo cặp ngẫu nhiên với chuột bình thƣờng và cho phối giống. Kết quả cho thấy sau khi ghép đôi từ 3 đến 10 ngày chuột bắt đầu mang thai, số lƣợng chuột con/đàn ở các lơ thí nghiệm là khá đồng đều và tƣơng đƣơng với lô đối chứng âm là lô chỉ uống nƣớc với mức sai số cho phép (Bảng 5 phụ lục). Nhƣ vậy, chế phẩm HisentP không ảnh hƣởng đến chức năng sinh sản của chuột.

Nhƣ vậy, protein HisentP tái tổ hợp đã đƣợc chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn và khơng gây độc cấp tính cũng nhƣ độc trƣờng diễn trên chuột thí nghiệm. Một số thí nghiệm sơ bộ đƣợc tiến hành nhằm xác định khả năng bảo quản thực phẩm của chế phẩm HisentP (Bảng 6, bảng 7 phụ lục) cho thấy HisentP bƣớc đầu đã có khả năng kéo dài thời gian bảo quản của một số loại thực phẩm so với đối chứng. Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu tạo EntP tái tổ hợp và ứng

dụng trong bảo quản thực phẩm dƣới nhiều hình thức nhƣ dung dịch ngâm, phun, phụ gia bổ sung hoặc màng bọc thực phẩm…[62, 74, 97] Với đặc tính ƣu việt là hoạt tính ổn định trong khoảng pH dao động lớn và khả năng bền nhiệt, các enterocin nói chung và EntP nói riêng vẫn là một trong các mối quan tâm hàng đầu để phát triển thành các phụ gia sinh học dùng cho bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, trên thế giới cho đến nay vẫn chỉ có nisin là bacteriocin duy nhất đƣợc sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản thực phẩm. Điều này có thể do những quan ngại về nguồn gốc của các enterocin tự nhiên (từ các Enterococcus có khả năng sinh độc tố) hay tái tổ hợp (từ các vi sinh vật chuyển gen).

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Gen entP của chủng E. faecium P13 đã đƣợc tổng hợp nhân tạo và tách dịng

thành cơng. Gen mang hai đột biến thay thế nucleotide: T thay cho G và T thay cho C tại vị trí 6 và 48. Trình tự amino acid suy ra từ gen tƣơng đồng 100% so với EntP của chủng E. faecium P13.

2. Đã biểu hiện gen entP trong E. coli ER2566. Hầu hết peptide EntP ở dạng dung hợp với MxeIntein đƣợc tổng hợp dƣới dạng thể vùi, khơng có hoạt tính. Sau

khi cắt bỏ intein, EntP tái tổ hợp có hoạt tính kháng L. monocytogenes và S. aureus.

3. Đã biểu hiện gen hisentP trong nấm men P. pastoris chủng GS115 và gen entP,

hisentP trong chủng X33. Hiệu suất biểu hiện gen trong chủng X33 cao hơn,

đồng thời không thấy sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn giữa chủng X33entP mang gen entP và chủng X33hisentP mang gen hisentP.

4. Điều kiện thích hợp cho lên men chủng X33hisentP sinh tổng hợp protein HisentP hiệu suất cao là sử dụng mơi trƣờng có chứa peptone và cao nấm men, pH 6, cảm ứng biểu hiện gen tại mật độ tế bào OD600  50, trong điều kiện

thơng khí tối đa. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch ni cấy cảm ứng trong bình nón đạt 100 AU/ml.

5. Đã lên men thành công chủng X33hisentP quy mơ 10 lít và 80 lít. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch lên men tƣơng ứng là 50 và 25 AU/ml.

6. HisentP đƣợc thu hồi tốt nhất bằng phƣơng pháp kết tủa với ethanol 90%. HisentP vẫn đảm bảo hoạt tính sau khi xử lý nhiệt ở 100o C trong 60 phút, 121o

C trong 15 phút và sau khi xử lý 8 giờ ở pH từ 2 đến 11. HisentP bị phân cắt và mất hoạt tính bởi pepsin, papain, proteinase K, bromelin, trypsin và -

chymotrypsin. HisentP có khả năng diệt L. monocytogenes, S. aureus, L. fermentum và E. faecium.

7. Chế phẩm HisentP khơng gây độc cấp tính trên ch ̣t thí nghiê ̣m. Khi cho uống trƣờng diễn, HisentP không ảnh hƣởng tới trọng lƣợng chuô ̣t thí nghiê ̣m không

làm thay đổi các chỉ tiêu huyết học nhƣ hồng cầu, tiểu cầu, hemoglobin v.v và một số chỉ tiêu hóa sinh máu nhƣ creatinin hay SGOT, SGPT, khơng làm biến đổi hình thái trực quan và trọng lƣợng của các cơ quan nội tạng của chuột thí nghiệm, khơng làm thay đổi khả năng sinh sản của chuột thí nghiệm. Tuy nhiên với liều 10mg/kg cân nă ̣ng /ngày, có hiện tƣợng giảm trọng lƣợng , giảm lƣợng bạch cầu và tăng chỉ số SGPT.

KIẾN NGHỊ

Cần tiếp tục nghiên cứu tối ƣu hóa q trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enterocin P tái tổ hợp, giảm chi phí nguyên liệu đầu vào và hạ giá thành sản phẩm.

Cần nghiên cứu nâng cao hiệu suất thu hồi và sơ chế HisentP từ dịch lên men, đặc biê ̣t là tối ƣu quá trình phân cắt HisentP để thu đƣợc enterocin P tinh sa ̣ch đủ tiêu chuẩn sử dụng trong bảo quản thực phẩm.

Tiếp tu ̣c nghiên cƣ́u mô hình thƣ̉ nghiê ̣m bảo quản các thƣ̣c phẩm khác nhau nhƣ hoa quả , thịt và các sản phẩm từ thịt ... sƣ̉ du ̣ng EntP tái tổ hợp bằng những phƣơng pháp khác nhau nhƣ dung dịch ngâm, phun, bổ sung dƣới dạng phụ gia, màng bọc thực phẩm…

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

2. Lê Thanh Bình, Phan Thị Khánh Hoa, Phạm Thị Ngọc Lan, Trần Thị Thúy (2000), “Hoạt tính sinh tổng hợp bacteriocin của khuẩn lactic”, Các cơng trình

nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học và công nghiệp thực phẩm giai đoạn 1996-2000, Bộ Công Nghiệp, Viện công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và

kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình (2008), “Một số tính chất của Bacteriocin đƣợc tổng hợp bởi vi khuẩn Lactic phân lập từ sữa bò tƣơi”,

Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ 6, tr. 33-41.

4. Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình (2009), “Nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp bacteriocin của các chủng Lactococcus bằng cách chọn tế bào

kháng nisin”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2009.

5. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy (2002), “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum L24”,

Tạp chí Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ Sinh học 2002, tr.

47-52.

6. Nguyễn Thúy Hƣơng, Trần, Thị Tƣởng An (2008), “Thu nhận Bacteriocin bằng phƣơng pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang

Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tƣơi sơ chế tối thiểu”,

Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ - ĐHQG TP.HCM 11(9), tr.100-

109.

7. Lƣơng Đức Phẩm (2005), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

8. Nguyễn Thị Hƣơng Trà, Nguyễn Tuấn (2002), Nghiên cứu công nghệ sản xuất bacteriocin từ chủng vi khuẩn lactic ST20, Tạp chí Nơng nghiệp và phát triển nông thôn 6, tr.507-508

9. Lê Ngọc Tú (2006), Độc tố học và an toàn thực phẩm, Nxb Khoa Học và Kỹ

Thuật, Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

10. Abrham W.B. (1978), Techniques of animal and clinical toxicology, Med Pub Chicago, pp. 55 – 68.

11. Bergmeyer H.U. and Bernt E. (1974), Methods of Enzymatic Analysis, 2nd ed., Academic Press, New York.

12. Bhunia A.K., Johnson M.G. (1992), “A modified method to directly detect in SDS-PAGE the bacteriocin of Pediococcus acidilactici”, Lett. Appl. Microbiol.