AU của dịch protein (đơn vị/ml)
Nồng độ ethanol kết tủa (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
X33PICZA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X33hisentP 100 0 0 0 0 200 200 200 400 1000
Thể tích (ml) 25 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
AU tổng số (đơn vị/tổng thể tích) 2500 0 0 0 0 500 500 500 1000 2500
Hiệu suất thu hồi (%) 100 0 0 0 0 20 20 20 40 100
Hình 3.51. Kiểm tra protein trong các phân đoạn tủa với ethanol bằng điện di Tricine-SDS-PAGE
M: thang protein chuẩn MW-17S, Sigma.
Nhƣ̃ng kết quả thu đƣơ ̣c ở trên đã cho thấy HisentP tái tổ hợp bắt đầu kết tủa ở nồng độ ethanol 50% và tăng dần theo nồng độ ethanol. Khi cho protein phân tách trên gel Tricine-SDS-PAGE, ở mẫu có nồng độ ethanol cao, protein di chuyển chậm hơn. Lƣợng HisentP thu đƣợc là cao nhất khi tủa với 90% ethanol (Hình 3.51). Tƣơng ứng với kết quả này, hoạt tính kháng L. monocytogenes của dịch tủa protein bắt đầu xuất hiện khi tủa với nồng độ 50% ethanol. Hoạt tính này tăng dần và đạt tối đa ở dịch tủa với ethanol 90%, hiệu suất thu hồi HisentP đạt 100%. So sánh khối lƣợng kết tủa thu đƣợc ở nồng độ 40% và 90% chúng tơi nhận thấy khơng có sự chênh lệch lớn. Kết quả này chỉ ra rằng, để thu hồi protein HisentP, các protein lớn có thể đƣợc loại bỏ trƣớc ra khỏi tủa protein tổng số bằng cách tủa phân đoạn với
10% 20% 30% 40% 50% M 60% 70% 80% 90% 14 8 3,5 17 6 HisentP
50% ethanol, thu dịch nổi. Sau đó, nồng độ ethanol trong dịch nổi đƣợc tăng lên bằng cách bổ sung ethanol đến 90% để thu kết tủa HisentP tƣơng đối sạch.
Những kết quả thí nghiệm ở trên cho thấy phƣơng pháp kết tủa HisentP trong dịch lên men bằng ethanol cho hiệu suất cao nhất (100%). Protein thu đƣợc sau kết tủa khơng địi hỏi q trình xử lý loại muối và thẩm tích. Mặt khác, với mục đích ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, ethanol cịn đọng lại trong cặn tủa có thể loại bỏ hoàn toàn và dễ dàng bằng đơng khơ, đảm bảo độ an tồn sinh học cho chế phẩm sau này. Vì vậy, chúng tơi lựa chọn phƣơng pháp kết tủa bằng ethanol để thu HisentP cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thu hồi HisentP từ lượng lớn dịch lên men bằng ethanol công nghiệp
Ethanol công nghiệp đƣợc thêm từ từ vào 5 lít dịch lên men (hoạt tính 100 AU/ml) đến nồng độ 40%, khuấy đều nhẹ nhàng, loại bỏ cặn, bổ sung thêm cồn lên đến nồng độ 90%, để qua đêm. Kết tủa bám lại ở đáy bình đƣợc làm khơ và hịa lại vào nƣớc đến thể tích bằng 1/20 thể tích dịch lên men ban đầu. Một phần protein không tan trong nƣớc đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm thu dịch nổi (Hình 5, Hình 6 phụ lục). Dịch protein sau tủa đƣợc thử hoạt tính kháng L. monocytogenes để xác
định AU và pha loãng 5 lần để điện di kiểm tra protein kết hợp với phủ vi khuẩn. Các kết quả trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.52 cho thấy phƣơng pháp này đã loại bỏ đƣợc một lƣợng lớn protein từ môi trƣờng nuôi cấy. Hiệu suất thu hồi HisentP đạt 80%. Dịch tủa protein thu đƣợc ký hiệu là X33hisentP-etOH và dùng cho các thí nghiệm sau.
Bằng phép thử Bradford, hàm lƣợng protein tổng số trong X33hisentP-etOH xác định đƣợc là 4 mg/ml. Dựa vào thang protein chuẩn đã biết hàm lƣợng, sử dụng phần mềm Quantity 1 phân tích hình ảnh điện di dịch tủa, nồng độ HisentP có trong dịch sau lên men đƣợc xác định sơ bộ là 25 g/ml, tƣơng ƣ́ ng với nồng đô ̣ HisentP trong dịch X33hisentP-etOH là 400 g/ml. Dịch lên men chủng X33PICZA cũng
đƣợc xử lý tƣơng tự và chuẩn về nồng độ tƣơng đƣơng để dùng làm đối chứng , ký hiệu X33PICZA-etOH.
Bảng 3.8. Hiệu suất của quá trình kết tủa lƣợng lớn dịch lên men thu HisentP Thể tích (ml) Hoạt tính (AU/ml) Hoạt tính tổng số (x103 ) Hiệu suất (%) Dịch lên men 5000 100 500 100 Dịch tủa ethanol 250 1600 400 80
Hình 3.52. Phân tích dịch X33hisentP-etOH bằng Tricine-SDS-PAGE (A), phủ vi khuẩn L. monocytogenes thử hoạt tính trực tiếp trên gel (B) và xác định AU trên
thạch đĩa (C)
M: Thang protein chuẩn MW-17S, Sigma. Mũi tên chỉ chiều pha loãng theo cơ số 2 bắt đầu từ dịch gốc.
Trong số các công trình đã công b ố trên T hế giới cho đến nay , EntP là bacteriocin đầu tiên đƣơ ̣c biểu hiê ̣n trong P. pastoris có đầy đủ hoạt tính . Năm 2005
Gutiérrez đã tách dòng gen mã hóa cho EntP trƣởng thành vào vector pPICZA ta ̣i
vị trí ngay sau tín hiệu phâ n cắt peptide và đƣa vào biểu hiê ̣n trong P. pastoris X33
nhằm thu đƣơ ̣c EntP trong môi trƣờng nuôi cấy . Bằng phƣơng pháp hấp phu ̣ miễn dịch gắn enzyme , lƣơ ̣ng EntP sinh ra trong môi trƣờng sau 6 giờ cảm ƣ́ng methanol xác định đƣợc là 28,2 g/ml, cao hơn 3,7 lần so vớ i chủng E. faecium P13. Hoạt
tính kháng khuẩn của dịch ni cấy chủng tái tổ hơ ̣p cũng cao hơn 16 lần so với
dịch nuôi chủng E. faecium P13 [48].
So sánh với kết quả của l uận án , mă ̣c dù quá trình cảm ƣ́ng biểu hiê ̣n gen đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n ở mâ ̣t đô ̣ tế bào cao (OD600 = 50) trong các thiết bi ̣ lên men nhƣng hàm lƣợng HisentP sinh ra trong môi trƣờng không có sƣ̣ khác biê ̣t vƣợt trô ̣i, chỉ đạt
25 g/ml. Điều này cho thấy khả năng biểu hiện gen ngoại lai của chủng
X33hisentP chƣa cao , hoặc quá trình lên men chƣa đa ̣t đƣợc hiê ̣u suất nhƣ mong đơ ̣i. Tuy nhiên , sƣ̣ khác biê ̣t về phƣơng ph áp xác định hàm lƣợng EntP , HisentP cũng là một yếu tố cần xem xét khi so sánh các kết quả này.
3.5. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ ĐỘ AN TOÀN TRƢỜNG DIỄN CỦA PROTEIN HISENTP CỦA PROTEIN HISENTP
3.5.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA PROTEIN HISENTP
3.5.1.1. Ảnh hƣởng của một số yếu tố mơi trƣờng đối với hoạt tính của HisentP
Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của HisentP
Để xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của protein HisentP, dịch lên men chủng X33hisentP có hoạt tính 100 AU/ml đã đƣợc gia nhiệt lên tới các nhiệt độ 60, 80 và 100o C trong 10, 20, 30, 40, 50, 60 phút và 121o C trong 15 phút. Kết quả thử hoạt tính kháng L. monocytogenes (Hình 7 phụ lục ) cho thấy dịch lên
men vẫn duy trì đƣợc hoạt tính nhƣ ban đầu, chứng tỏ HisentP khơng bị ảnh hƣởng bởi q trình gia nhiệt với dải nhiệt độ đã thí nghiệm.
Ảnh hưởng của pH mơi trường đối với hoạt tính của HisentP
Dịch lên men chủng X33PICZA (đối chứng) và X33hisentP3 có hoạt tính 100 AU/ml đƣợc chỉnh pH tới 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11 bằng H3PO4 và KOH. Ủ ở 37o C trong 8 giờ sau đó điều chỉnh pH của các mẫu thí nghiệm trở lại 7. Kết quả thử hoạt tính kháng L. monocytogenes của dịch lên men sau khi ủ (Hình 8 phụ lục) cho thấy: ở tất cả các pH, dịch lên men chủng X33hisentP vẫn giữ nguyên hoạt tính kháng khuẩn AU = 100 (đơn vị/ml) nhƣ ban đầu, trong khi dịch lên men chủng X33PICZA khơng thể hiện hoạt tính ở bất cứ mẫu nào, chứng tỏ HisentP không bị ảnh hƣởng bởi pH axit hay kiềm.
Bản chất protein của sản phẩm tái tổ hợp đƣợc khẳng đi ̣nh thông qua thí nghiê ̣m với các protease . Các enzyme: proteinase K, papain, trypsin, pepsin, neutrase, bromelin, -chymotrypsin, lysozyme đƣợc hịa vào đệm thích hợp và bổ
sung vào dịch X33hisentP-etOH hoạt tính 800 AU/ml đến nồng độ 0,5 mg/ml. (Mẫu đối chứng sử dụng nƣớc cất vô trùng thay cho protease). Sau khi ủ ở 37o C trong 2 giờ, hỗn hợp phản ứng đƣợc gia nhiệt đến 100o C trong 5 phút nhằm bất hoạt các enzyme.