Đánh giá tình hình sử dụng, sự tồn dư thuốc bảo vệ thực vật ở một số loại rau ăn lá tại huyện củ chi 2

33 CHƢƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Nội dung nghiên cứu 2 1 1 Đánh giá thực trạng canh tác, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên một số loại rau trồng trên địa bàn huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh  Thu thập thông tin về tình hình canh tác một số loại rau ăn lá trên địa àn huyện Củ chi  Thu thập thông tin về tình hình sữ dụng thuốc BVTV trong sản xuất rau ăn lá trên địa àn huyện Củ chi 2 1 2 Đánh giá tồn dư thuốc bảo vệ thực vật đối với một số loại rau trồng trên địa bàn huyện C.

CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đánh giá thực trạng canh tác, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật số loại rau trồng địa bàn huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh  Thu thập thơng tin tình hình canh tác số loại rau ăn địa àn huyện Củ chi  Thu thập thơng tin tình hình sữ dụng thuốc BVTV sản xuất rau ăn địa àn huyện Củ chi 2.1.2 Đánh giá tồn dư thuốc bảo vệ thực vật số loại rau trồng địa bàn huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh  Khảo sát đánh giá tồn dƣ thuốc BVTV số loại rau trồng địa huyện Củ chi 2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian thu hoạch đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có rau  Khảo sát biến đổi tồn dƣ thuốc số thuốc BVTV rễ, thân, số loại rau ăn theo thời gian phƣơng thức canh tác truyền thống  Khảo sát iến đổi tồn dƣ thuốc số thuốc BVTV rễ, thân, số loại rau ăn theo thời gian phƣơng thức canh tác truyền thống 2.1.4 Đề xuất giải pháp quản lý, sử dụng hiệu thuốc bảo vệ thực vật đạt hiệu sản xuất rau thành phố Hồ Chí Minh  Giải pháp kỹ thuật canh tác  Giải pháp quản lý kinh doanh sử dụng thuốc BVTV  Giải pháp khoa học công nghệ  Nâng cao nhận thức ngƣời tiêu dùng 33 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp điều tra thu thập số liệu Để điều tra tình hình sử thuốc bảo vệ thực vật nông dân trồng rau: Tiến hành xây dựng phiếu điều tra (đính kèm phần phụ lục 1), sau tiến hành phƣơng pháp điều tra theo phƣơng pháp PRA (đánh giá nơng thơn có tham gia) hộ trồng hợp tác xã trồng rau đối tƣợng rau đƣợc trồng Tiến hành điều tra b ng cách vấn trực tiếp ngƣời trồng theo nội dung phiếu điều tra Số lƣợng phiếu điều tra 50 phiếu Do đặc điểm phân ố vùng trồng rau, loại rau địa àn huyện Củ Chi, tham khảo niêm giám thống kê nhƣ theo dõi thực tế để chọn tổng số 21 xã, thị trấn huyện đại diện cho vùng trồng rau huyện Củ Chi Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu: Số liệu đƣợc thu thập xử lý thống kê ng phần mềm Excel, SAS 9.2 2.2.2 Phương pháp thu mẫu rau phục vụ nghiên cứu Mẫu rau đƣợc thu mẫu kiểm định tiêu chuẩn TCVN 386 -99 Thu thập mẫu rau đƣợc trồng vùng sản xuất: Việc thu hoạch mẫu rau đƣợc thực cẩn thận để thu toàn ộ rễ Mẫu rau sau lấy điểm trồng thực nghiệm đƣợc loại bỏ phần giá thể ám rễ cây, đựng túi nilon có ghi tên mẫu đƣa phịng thí nghiệm Mẫu rau đƣợc thu vào ngày 0, 2, 4, 6, 8, 10 sau phun thuốc bảo vệ thực vật 34 2.2.3 Phương pháp phân tích thuốc BVTV Tùy gốc thuốc BVTV cần phân tích, tƣơng ứng với phƣơng pháp thiết ị sử dụng khác Quy trình phân tích: Nghiền Chiết mẫu Lọc dung mẫu b ng dịch chiết Chiết ng hỗn hợp dung môi muối Aceton ăn Xác định hàm Cô d2 5ml Làm Cô d2 10 lƣợng thuốc b ng thiết bị dung dịch ml b ng thiết BVTV b ng máy cô quay chân b ng thiết bị bị cô quay GC/MS không chiết pha rắn chân không 2.2.4 Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV Cypermethrin, Indoxacarb phương pháp sắc ký khí đầu dị phối khổ ghép khối phổ GC-MS/MS  Chuẩn ị mẫu thô: Cân khoảng kg mẫu Bỏ phần không ăn đƣợc, cắt mẫu thành mảnh có kích thƣớc nhỏ, cỡ cm x cm ng dao Xay nhuyễn mẫu máy nghiền đồng thể trƣớc thử nghiệm Cho mẫu v -18 °C  Chuẩn ị mẫu thử: Cân 15.00 ± 0.01 g mẫu thử đồng hóa vào ống nghiệm nhựa 50 ml cân kỹ thuật, thêm 600µl nội chuẩn TDCPP (Tris(1,3-dichloro-isopropyl) phosphate) 10 mg/l, để yên 15 phút  Chuẩn ị mẫu trắng: Mẫu trắng mẫu không chứa thuốc ảo vệ thực vật cần xác định 35 Cân 15 ± 0.01 g mẫu trắng đồng hóa vào ống nghiệm nhựa 50 ml cân kỹ thuật, thêm 600µl nội chuẩn TDCPP (Tris(1,3-dichloro-isopropyl) phosphate) 10 mg/l, để yên 15 phút  Chuẩn ị mẫu kiểm soát 100 µg/kg Cân 15 ± 0.01 g mẫu trắng đồng hóa vào ống nghiệm nhựa 50 ml cân kỹ thuật, thêm 150µl chuẩn làm việc hỗn hợp chất BVTV 10 mg/l 600µl nội chuẩn TDCPP (Tris(1,3-dichloro-isopropyl) phosphate) 10 mg/l vào ống nghiệm, để yên 15 phút  Chuẩn ị mẫu thêm chuẩn để xây dựng đƣờng chuẩn ( 0.0, 10, 50, 100, 150, 200 µg/kg): Mẫu thêm chuẩn đƣợc chuẩn ị tƣơng tự nhƣ mẫu trắng Cho lần lƣợt dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp chất BVTV 10 mg/l nội chuẩn làm việc TDCPP (Tris(1,3-dichloro-isopropyl) phosphate) 10 mg/l vào ống nghiệm có chứa mẫu trắng theo ảng ghi sau đây, sau để yên 15 phút trƣớc tiến hành ƣớc 36 Bảng 2.1 Bảng ký hiệu mẫu STT Khối lƣợng (g) Nồng độ dung dịch chuẩn thêm vào (mg/l) Thể tích chuẩn thêm vào (µl) Nồng độ chuẩn lý thuyết (µg/kg) Nồng độ dung dịch nội chuẩn thêm vào (mg/l) Thể tích nội chuẩn thêm vào(µl) Nồng độ nội chuẩn lý thuyết (µg/kg) S1 15 10 0 10 600 400 S2 15 10 15 10 10 600 400 S3 15 10 75 50 10 600 400 S4 15 10 150 100 10 600 400 S5 15 10 225 150 10 600 400 S6 15 10 300 200 10 600 400 - Xử lý mẫu thí nghiệm Thêm 15 mL dung dịch 1% (v/v) acid acetic acetonitrile cho ống nghiệm Lắc mạnh vortex phút Thêm g anhydrous MgSO4 1,5 g anhydrous NaOAc vào ống (khi nhiệt độ dung dịch đạt khoảng 40 – 45 °C) Đậy nắp ống ly tâm thật chặt Lắc mạnh ống vortex phút ng máy vortex Ly tâm 1500 vòng / phút phút Chuyển ml dịch chiết vào ống nghiệm nhựa có chứa sẵn: 1.5± 0.01 g anhydrous MgSO4, 0.2 ± 0.01 g C18, 0.2 ± 0.01 g PSA, 0.2 ± 0.01 g than hoạt tính Lắc mạnh ống vortex phút ng máy vortex Ly tâm 1500 vòng / phút phút Hút ml dịch chiết vào ống nghiệm thủy tinh, cẩn thận đuổi dung môi khô nhiệt độ 40 °C ng nitrogen 37 Thêm ml dung dịch cyclohexane: acetone 9:1 (v/v) vào ống nghiệm, siêu âm giây vortex 10 giây Chuyển dung dịch hịa tan vào vial - Tiến hành q trình - Chạy mẫu GC - Sắp xếp thứ tự tiêm mẫu theo trật tự sau: dung dịch chuẩn, mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử - Cột: SLB-5ms (30m x 0,25mm x 0,25μm) - Nhiệt độ uồng tiêm 250 °C - Chế độ tiêm: khơng chia dịng - Áp suất uồng tiêm 250 kPa (1,5 phút) - Carrier gas control: linear velocity (40 cm/sec) út) - Nhiệt độ interface: 280°C - Nhiệt độ ion source: 200°C - MS: MRM; loop time = 0,4 sec; pressing time required = 0,3 - Thể tích tiêm: μL - Ion định lƣợng Ion xác nhận: Thành phần Cypermethrin Ion định lƣợng (m/z) Ion xác nhận (m/z) Ion xác nhận (m/z) 163>127.1 181>152 163>91.1 38 - Tính kết - Xây dựng đƣờng chuẩn ng phƣơng pháp ình phƣơng cực tiểu, đƣờng chuẩn có dạng tổng quát: A = kR - (k hệ số góc, giao điểm đƣờng chuẩn với trục tung, A tỷ lệ diện tích chuẩn nội chuẩn, R tỷ lệ nồng độ chuẩn nồng độ nội chuẩn) - Đƣờng chuẩn thể mối quan hệ tỷ lệ nồng độ với nồng độ nội chuẩn tỷ lệ diện tích với diện tích nội chuẩn - Nồng độ (tính ng µg/Kg) chất mẫu đƣợc tính từ đƣờng chuẩn (tuyến tính) ởi cơng thức: C = (A-b) x CIS/k - Với: + k hệ số góc, + giao điểm đƣờng chuẩn với trục tung, + A tỷ lệ diện tích chuẩn nội chuẩn, + C: Nồng độ chất mẫu + CIS: Nồng độ lý thuyết nội chuẩn - Nồng độ tính từ đƣờng chuẩn mẫu kiểm sốt chia cho nồng độ thêm vào lúc an đầu đƣợc gọi độ thu hồi 2.2.5 Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV Emamectin benzoate phương pháp sắc ký lỏng đầu dò phối khổ ghép khối phổ LC-MS/MS - Chuẩn ị mẫu thô Cân khoảng Kg mẫu Bỏ phần không ăn đƣợc, cắt mẫu thành mảnh có kích thƣớc nhỏ, cỡ 3cm x 3cm ng dao Xay nhuyễn mẫu máy nghiền đồng -18 °C 39 - Chuẩn ị mẫu thử Cân 15 ± 0.01 g mẫu thử đồng hóa vào ống nghiệm nhựa 50 ml cân kỹ thuật, thêm 300µl nội chuẩn TPP 10 mg/l, để yên 15 phút - Chuẩn ị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu không chứa thuốc ảo vệ thực vật cần xác định Cân 15.00 ± 0.01 g mẫu trắng đồng hóa vào ống nghiệm nhựa 50 ml cân kỹ thuật, thêm 300µl nội chuẩn TPP 10 mg/l, để yên 15 phút - Chuẩn ị mẫu kiểm sốt 20 µg/kg Cân 15.00 ± 0.01 g mẫu trắng đồng hóa vào ống nghiệm nhựa 50 ml cân kỹ thuật, thêm 30µl chuẩn làm việc Emamectin enzoate 10 mg/l 300µl nội chuẩn TPP 10 mg/l vào ống nghiệm, để yên 15 phút - Chuẩn ị mẫu thêm chuẩn để xây dựng đƣờng chuẩn (10, 20, 30, 50, 100, 200, 300 µg/kg) Mẫu thêm chuẩn đƣợc chuẩn ị tƣơng tự nhƣ mẫu trắng Cho lần lƣợt dung dịch chuẩn làm việc Emamectin enzoate 10 mg/l nội chuẩn làm việc TPP 10 mg/l vào ống nghiệm có chứa mẫu trắng theo ảng ghi sau đây, sau để yên 15 phút trƣớc tiến hành ƣớc 40 Bảng 2.2 Bảng ký hiệu mẫu STT Khối lƣợng (g) Nồng độ dung dịch chuẩn thêm vào (mg/l) Thể tích chuẩn thêm vào (µl) Nồng độ chuẩn lý thuyết (µg/kg) Nồng độ dung dịch nội chuẩn thêm vào (mg/l) Thể tích nội chuẩn thêm vào(µl) Nồng độ nội chuẩn lý thuyết (µg/kg) S1 15 15 10 10 300 200 S2 15 30 20 10 300 200 S3 15 45 30 10 300 200 S4 15 75 50 10 300 200 S5 15 150 100 10 300 200 S6 15 300 200 10 300 200 S7 15 450 300 10 300 200 - Xử lý mẫu thí nghiệm Thêm 15 mL dung dịch 1% (v/v) acid acetic acetonitrile cho ống nghiệm Lắc mạnh vortex phút, đánh siêu âm phút Thêm g anhydrous MgSO4 1,5 g anhydrous NaOAc vào ống (khi nhiệt độ dung dịch đạt khoảng 40 – 45 °C Đậy nắp ống ly tâm thật chặt Lắc mạnh ống vortex phút ng máy vortex Ly tâm 5000 vòng / phút phút Chuyển ml dịch chiết vào ống nghiệm nhựa có chứa sẵn: 1.5± 0.01 g anhydrous MgSO4, 0.2 ± 0.01 g C18, 0.2 ± 0.01 g PSA(Sao khơng có viết tắt trang đầu) Lắc mạnh ống vortex phút ng máy vortex Ly tâm 5000 vòng / phút phút 41 Hút ml dịch chiết vào ống nghiệm thủy tinh, cẩn thận đuổi dung môi khô (ở nhiệt độ 40 °C ng nitrogen Thêm ml dung dịch tái tạo acetonitril vào ống nghiệm, siêu âm giây vortex 10 giây Chuyển dung dịch hòa tan vào kim tiêm có gắn màng lọc 0,45µm sau chuyển qua vial 1,5ml - Tiến hành trình - Chạy mẫu LC/MS (Liquid chromatography-electrospray mass spectrometry) - Sắp xếp thứ tự tiêm mẫu theo trật tự sau: dung dịch chuẩn, mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử - Cột: Shim – pack XR-ODS II (75 mm x 2mm ID; 2,2μm) - Pha động A: dung dịch nƣớc chứa 0,1% acid formic - Pha động B: dung dịch acetonitril chứa 0,1% acid formic - Gradient: 5% B (0 đến phút) => 40% đến 60% B ( 2.01 đến phút) => 60% đến 90% B ( đến phút) => 90% B (9 đến 11 phút => 5% (từ 11,01 đến 17 phút) - Lƣu lƣợng: 0,3 ml/phút - Lò cột: 40 oC - Nhiệt độ autosampler: 10 °C - MS: ESI (positive/negative), Ion spray voltage (- 4,5 kV/ - 3,5 kV); MRM Dwell time = 10 msec - Ne ulizing gas flow: L/phút - Drying gas flow: 15 L/phút -DL temperature: 250 oC 42 - Heater block temperature: 400 0C - CID gas: 500 kPa - Thể tích tiêm: 10 μL - Ion định lƣợng Ion xác nhận: Thành phần Ion định lƣợng (m/z) Ion xác nhận (m/z) Emmamectin benzoate 886.5 > 158.2 886.5 > 126 TPP 327 > 251.1 327 > 233 - Tính kết - Xây dựng đƣờng chuẩn ng phƣơng pháp ình phƣơng cực tiểu, đƣờng chuẩn có dạng tổng quát: A = kR - (k hệ số góc, giao điểm đƣờng chuẩn với trục tung, A tỷ lệ diện tích chuẩn nội chuẩn, R tỷ lệ nồng độ chuẩn nồng độ nội chuẩn) - Đƣờng chuẩn thể mối quan hệ tỷ lệ nồng độ với nồng độ nội chuẩn tỷ lệ diện tích với diện tích nội chuẩn - Nồng độ (tính ng µg/Kg) chất mẫu đƣợc tính từ đƣờng chuẩn (tuyến tính) ởi cơng thức: C = (A-b) x CIS/k - Với: + k hệ số góc, + giao điểm đƣờng chuẩn với trục tung, + A tỷ lệ diện tích chuẩn nội chuẩn, + C: Nồng độ chất mẫu + CIS: Nồng độ lý thuyết nội chuẩn - Nồng độ tính từ đƣờng chuẩn mẫu kiểm sốt chia cho nồng độ thêm vào lúc an đầu đƣợc gọi độ thu hồi 43 ... phân ố vùng trồng rau, loại rau địa àn huyện Củ Chi, tham khảo niêm giám thống kê nhƣ theo dõi thực tế để chọn tổng số 21 xã, thị trấn huyện đại diện cho vùng trồng rau huyện Củ Chi Phƣơng pháp.. .2. 2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2. 2.1 Phương pháp điều tra thu thập số liệu Để điều tra tình hình sử thuốc bảo vệ thực vật nông dân trồng rau: Tiến hành xây dựng phiếu... đƣợc thu vào ngày 0, 2, 4, 6, 8, 10 sau phun thuốc bảo vệ thực vật 34 2. 2.3 Phương pháp phân tích thuốc BVTV Tùy gốc thuốc BVTV cần phân tích, tƣơng ứng với phƣơng pháp thiết ị sử dụng khác Quy trình