Nghiên cứu thành phần hóa học củ bách bộ chi Stemona

Báo cáo Nghiên cứu thành phần hóa học củ bách bộ chi Stemona trình bày một số kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả về thành phần hóa học của củ Bách bộ chi Stemona, gồm hai loài Stemona cochinchinensis và Stemona tuberosa, với mong muốn góp phần tìm hiểu, nâng cao giá trị sử dụng của các loài cây thuốc quý này.

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦ BÁCH BỘ CHI STEMONA Nguyễn Thị Quyên, Lớp K60A, Hoàng Thị Nhung, Lớp K60B, Khoa Hóa học GVHD: PGS.TS Phạm Hữu Điển Tóm tắt: Từ củ Bách thân đứng Stemona cochinchinensis thân leo Stemona tuberosa phân lập hợp chất Bằng phương pháp phổ IR, MS, 1H NMR, 13C NMR xác định cấu trúc hợp chất stemanthrene C (1), tetracosanoic (2), axit 12-propylpentadec-11-enoic (3), neotuberostemonine (4), stigmasta-5,22-dien-3-ol (5) daucosterol (6) Hợp chất kháng chủng vi khuẩn Gram (+), chủng nấm men C.albicans, hợp chất kháng S.aurerus mức trung bình (IC50 = 76,5 – 92,8 g/mL) Từ khóa: Stemona cochinchinensis, Stemona tuberosa, stemanthrene C, neotuberostemonine I MỞ ĐẦU Họ Bách (Stemonaceae) họ thực vật không lớn lắm, gồm chi (Croomia, Stemona, Stichoneuron, Pentastemona) với khoảng 25 - 35 loài (thân leo hay thân thảo), mọc hoang vùng trung du, miền núi các nƣớc có khí hậu nóng ẩm nhƣ Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan Bách số thuốc cổ truyền [1], từ lâu đƣợc nhân dân ta sử dụng để chữa ho hàn, trị bệnh giun, sán, diệt trùng, mối mọt,… Một số cơng trình nghiên cứu gần cho thấy: thành phần hóa học củ Bách Bộ ancaloit chứa khung pehydroazaazulen (nhƣ tuberostemonine, maistemonine…), stilbenoit, flavonoit… [2,5] Một số hợp chất có khả diệt mối mọt, trùng, ức chế phát triển số tế bào ung thƣ Báo cáo trình bày số kết nghiên cứu nhóm chúng tơi thành phần hóa học củ Bách chi Stemona, gồm hai lồi Stemona cochinchinensis Stemona tuberosa, với mong muốn góp phần tìm hiểu, nâng cao giá trị sử dụng loài thuốc quý II NỘI DUNG Thực nghiệm a Thu hái, xử lí mẫu: Củ Bách thân đứng (Stemona cochinchinensis), thu hái Lào (3,1kg, 10/2011); củ Bách thân leo (Stemona tuberosa), thu hái Thái Nguyên (3,0kg, 11/2013) đƣợc ThS Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam giúp xác định tên khoa học Sau rửa sạch, củ Bách đem thái nhỏ, phơi sấy khô, nghiền nhỏ thành bột b Chiết tách hợp chất: bột củ Bách đƣợc ngâm metanol (3 lít/1,0 kg bột khơ * lần/72 giờ), cất cô quay chân không Đem chiết cao hệ dung môi hữu (nhexan, etyl axetat)/nƣớc = : 1, cất cô quay chân không, đƣợc cao chiết phân đoạn nhexan, etyl axetat, metanol-nƣớc tƣơng ứng Chạy cột sắc kí: chất hấp phụ silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040-0,063mm); sắc kí mỏng tráng sẵn silica gel đế nhôm (Merck); phát chất đèn tử ngoại ba bƣớc sóng 254, 302 365nm dùng thuốc thử dung dịch axit H2SO4 10% Từ cao chiết n-hexan, tiến hành chạy cột sắc kí 90 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/etyl axetat tăng dần độ phân cực (từ 100 : đến : 4) phân lập đƣợc chất, chất từ củ Bách thân đứng (25mg), (42 mg), (18 mg); chất từ cao n-hexan củ Bách thân leo (23 mg) , (12 mg); chất từ cao tổng ankaloit (32mg) c Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất: Điểm nóng chảy đƣợc đo thiết bị Gallen Kamp (CHLB Đức) Bộ mơn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trƣờng ĐHSP Hà Nội Phổ 1H NMR (500MHz), 13C NMR (125 MHz) – đƣợc đo máy Brucker AM500-FTNMR (chất nội chuẩn: TMS), phổ hồng ngoại - máy Shimadzu FTIR- 8101M (ép viên với KBr), phổ khối lƣợng – thiết bị Engine 5989-HP Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam d Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học: Các chất đƣợc thử hoạt tính kháng sinh sở vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus fermentum, vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli, Pseudomonas areuginosa, Salmonella enterica, chủng nấm men: Candida albicans theo phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ Kết nghiên cứu 2.1 Thành phần hóa học Bách thân đứng S.cochinchinensis Hợp chất 1: Phổ IR (KBr) vmax (cm-1) có vân hấp thụ mạnh, nhiều đỉnh, bƣớc sóng 3547,70; 3321,56cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị nhóm OH Phổ 1H NMR có hai pic singlet nhóm metoxi H 3,49 3,81; hai nhóm metyl H 2,16 2,21; nhóm CH2 H 2,69 (2H, m, H-2”), 2,77 (2H, m, H-1”) Ngồi ra, cịn có hai tín hiệu proton thơm, cộng hƣởng H 6,85 (1H, d, J = 8,5Hz, H-4) 8,01 (1H, d, J = 8,5Hz, H5) Do có hiệu ứng mái nhà hai proton, giá trị J trùng nên kết luận hai proton thơm vị thí octo Phổ 13C NMR kết hợp với phổ DEPT, HSQC cho thấy hợp chất có tổng cộng 18 cacbon Trong đó, có hai cacbon metylen cộng hƣởng c 25,54 (C-1”) 22,27 (C-2”), bốn cacbon bậc cộng hƣởng c 8,92 (4‟-Me), 11,79 (2‟-Me), 59,95 (5‟-OMe) 61,40 (2-OMe) Ngồi ra, tín hiệu cacbon thơm 113,05 - 136,15ppm, cacbon thơm liên kết với oxi cộng hƣởng vùng 143,27 154,55ppm Hình Phổ 1H 13C NMR hợp chất 91 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Kết hợp với phổ HSQC, HMBC 1, so sánh với giá trị phổ NMR Stemanthrene C [2,3] chúng tơi thấy có trùng khớp gần nhƣ hồn tồn, kết luận hợp chất Stemanthrene C H3CO 1" 2" CH3 1' 2' HO OH H3CO 4' CH3 (Stemanthrene C) Bảng Các giá trị phổ 1H 13C NMR chất Vị trí H NMR 13 C NMR Vị trí H NMR 13 C NMR - 130,5 5’ - 154,5 - 143,2 6’ - 120,1 - 146,9 1” 2,77 m, 2H 25,9 6,85 d, J= 8,5, 1H 113,0 2” 2,68 m, 2H 22,2 8,01 d, J= 8,5, 1H 124,3 2-OMe 3,82 s, 3H 61,4 - 126,6 3-OH 5,65 s, 1H - 1’ - 136,1 2’-Me 2,21 s, 3H 11,8 2’ - 116,2 3’-OH 4,75 s, 1H - 3’ - 151,3 4’-Me 2,24 s, 3H 8,9 4’ - 114,9 5’-OMe 3,50 s, 3H 59,9 Hợp chất 2: Hợp chất kết tinh vơ định hình, màu trắng, tan tốt clorofom, metanol Phổ LC-MS (negative) cho pic giả ion phân tử [M-H]- với số khối 367,27 Kết hợp với phổ 1H NMR, 13C NMR, cho thấy công thức phân tử C24H48O2 (M = 368) Phổ IR có vân hấp thụ cƣờng độ lớn, nhiều đỉnh bƣớc sóng 3403,78 cm-1 đƣợc gán cho dao động hóa trị nhóm OH tự do; vân hấp thụ khác, cƣờng độ lớn bƣớc sóng 1703,64 cm-1 đƣợc gán cho dao động hóa trị nhóm cacbonyl axit cacboxylic Phổ 1H NMR bao gồm proton liên kết với cacbon no (lai hóa sp3), cộng hƣởng vùng trƣờng cao với giá trị δH từ 0,88 đến 2,35 ppm Cụ thể: CH3 với δH = 0,88 ppm (3H, t, J = 7,0 Hz) bên cạnh CH2; CH2 với δH = 2,34 ppm (2H, t, J=7,5 Hz) bên cạnh CH2 khác với δH = 1,63 ppm (2H, sextet, J = 7,5 Hz) đƣợc gán cho đoạn mạch đimetylen (-CH2-CH2-) 40 proton lại với δH từ 1,20 đến 1,35 ppm thuộc 20 nhóm CH2 mạch thẳng, no Phổ 13C NMR có tất 24 cacbon, có 18 cacbon CH2 trùng lặp khoảng δC từ 29,1 đến 29,7 ppm, lại cacbon metyl (δC 14,1), cacbon metylen (δC 22,7 24,7 31,9 33,7 ppm), cacbon nhóm cacboxylic (δC 177,9 ppm) Kết hợp giá trị phổ LC-MS, IR, 1H NMR, 13C NMR cho phép xác định axit tetracosanoic, CH3[CH2]21CH2COOH 92 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Hợp chất 3: Hợp chất kết tinh vơ định hình, màu trắng, tan tốt clorofom, metanol Phổ LC-MS (negative) H3.6.3 cho pic giả ion phân tử [M-H]- với số khối 281,18 Kết hợp với phổ 1H NMR, 13C NMR, cho thấy công thức phân tử C18H34O2 (M = 282) axit cacboxylic không no este Phổ 1H NMR bao gồm proton liên kết với cacbon no (C lai hóa sp3) 01 proton olefinic cộng hƣởng vùng trƣờng trung bình với δH = 5,34 ppm (1H, m) Ở vùng trƣờng cao có nhóm metyl đầu mạch tƣơng đƣơng, với δH = 0,87 ppm (6H, t, J = 7,0 Hz) đƣợc cho liên kết với nhóm etylen –CH2-CH2 với δH = 1,63ppm (2H, t, J = 7,0 Hz, liên kết với CH3), δH = 2,34ppm (2H, t, J = 7,5 Hz, liên kết với cacbon olefinic, = C) Hai proton thuộc nhóm metylen với δH = 2,00 ppm (2H, d, J = 6,0 Hz) đƣợc gán cho CH2 liên kết với nhóm cacboxylic Phổ 13C NMR có 18 cacbon, có nhóm COOH với δC = 178,6 ppm, cacbon olefinic với δC = 129,7 130,0 ppm Còn lại cacbon metyl (δC 14,1), 13 cacbon metylen với δC từ 22,7 đến 33,8 ppm Kết hợp giá trị phổ LC-MS, IR, 1H NMR, 13C NMR, HSQC cho phép chúng tơi dự đốn axit không no (CH3CH2CH2)2C=CHCH2[CH2]7CH2COOH, axit 12-propylpentadec-11-enoic Bảng Các giá trị phổ 1H NMR 13C NMR chất STT H NMR (CDCl3) 13 C NMR (CDCl3) Số TT H NMR (CDCl3) 13 C NMR (CDCl3) - 178,6 11 - 130,0 2H, 2,01, d, J = 6,0 Hz 27,2 12, 1‟ 4H, 2,34, t, J = 7,5 Hz 33,8 3-9 14H, 1,25-1,32, m 24,7-31,9 13, 2‟ 4H, 1,63, t, J = 7,0 Hz 22,7 10 1H, 5,34, m 129,7 14, 3‟ 6H, 0,87, t, J = 7,0 Hz 14,1 2.2 Thành phần hóa học củ Bách thân leo Stemona tuberosa Hợp chất 4: Hợp chất chất kết tinh màu trắng, hình kim, tan tốt clorofom, metanol, có điểm nóng chảy 155,5 – 156 oC Phổ IR có vân nhọn, cƣờng độ lớn 1760 thuộc dao động nhóm >C=O Phổ ESI-MS xuất píc ion phân tử với số khối M = 375,7 chứng tỏ có chứa số lẻ nitơ Kết hợp với phƣơng pháp phổ 1H NMR, 13 C NMR, HSQC cho thấy ancaloit, có cơng thức phân tử C22H33NO4 Phổ 1H NMR (trong CDCl3) có vân ba (triplet) với H = 1,00 ppm đƣợc gán cho nhóm CH3 bên cạnh CH2, hai vân đôi (doublet) với H = 1,26 1,23 ppm, thuộc hai nhóm metilen vịng (H–22 H–15) Ba vân phổ đặc trƣng cho ancaloit khung tuberostemonine từ chi Stemona Ngồi ra, vùng trƣờng trung bình có vân bội, cƣờng độ 2H, với H = 4,55 ppm đƣợc gán cho proton cacbinol -CHOH (H-11 H-18) Phổ 13C NMR thấy có 18 pic cacbon, giống nhƣ hợp chất B3 [4], pic cacbon bậc vùng trƣờng thấp ( = 178,8 ppm) đặc trƣng cho C C = O dị vịng cạnh γ lacton Có thể cho có chứa vịng γ - lacton Ba nhóm CH3 phân bố vùng trƣờng cao (10,2; 11,3 14,8 ppm), lại cacbon CH2, CH, C vòng pehydroazaazulen 93 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Hình Phổ 13C NMR hợp chất (bên trái) hợp chất B3 (bên phải, tham khảo học viên Phạm Thị Huyền [4]) Dựa vào kết đo, phân tích kiện phổ, so sánh với B3 với neotuberostemonine [5] chúng tơi thấy có trùng khớp tƣơng đối tốt, ngoại trừ thiếu pic cacbon C-6 (30,0), C-9a (66,2), C-11 (80,4) giống nhƣ B3 Kết đo phổ X-ray cho thấy B3 có đủ 22 cacbon, có cấu trúc neotuberostemonine Vì kết luận (hay B3) tuberostemonine, số ankaloit củ Bách thân leo H O 15 12 CH3 H H 11 14 O H 10 16 H H 3C H 22 H CH3 18 9a N H H 19 21 O O 17 (Neotuberostemoni ne) Hình Phổ X-ray đơn tinh thể B3 (tham khảo Phạm Thị Huyền) Hợp chất 5: Hợp chất kết tinh hình kim, màu trắng, tan tốt clorofom, Rf (H : E = : 1) = 0,6, nhiệt độ nóng chảy 155-156 oC Phổ IR có vân tù, nhiều đỉnh, cƣờng độ lớn 3419 cm-1 thuộc dao động nhóm OH Phổ 1H NMR có nhiều nét đặc trƣng cho steroit (tetracyclic triterpenoid) với cụm pic dày đặc vùng trƣờng mạnh, từ 0,698ppm đến 2,310ppm Ở vùng trƣờng trung bình thấp có vân cộng hƣởng proton không tƣơng đƣơng: proton olefin (= CH) vòng với  = 5,35 ppm, proton olefin ngồi vịng (-CH=CH-) với δ = 5,01 5,18 ppm; 1H nhóm -CHOH với δ = 3,52 ppm 94 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Bảng Các giá trị phổ 13C NMR (CDCl3) hợp chất 4, so sánh với B3 [4] neotuberostemonine (NT) [5] STT B3 NT STT B3 NT 37,0 37,2 37,4 12 40,9 41,5 41,8 32,3 32,6 32,8 13 42,7 42,6 42,5 68,9 67,6 66,7 14 178,4 178,8 179,3 52,3 51,0 50,0 15 10,2 10,2 10,3 - - 30,0 16 21,1 21,1 21,1 22,3 22,8 23,3 17 11,0 11,1 11,3 28,2 28,6 29,0 18 78,0 79,0 78,0 35,4 35,9 36,3 19 34,7 34,8 34,4 9a - - 66,2 20 34,9 34,9 34,9 10 34,7 34,6 34,7 21 178,4 178,8 179,2 11 - - 80,4 22 14,8 14,8 14,8 So sánh giá trị phổ 1H NMR với stigmasta-5,22-dien-3β-ol (hay stigmasterol) [6] thấy có trùng khớp tốt, kết luận stigmasterol, steroit phổ biến giới thực vật Bảng Một số giá trị phổ 1H NMR hợp chất 5, so sánh với stigmasta-5,22-dien-3β-ol (hay stigmasterol) [6] TT Stigmasterol TT Stigmasterol 1H 3,52 m 1H 3,525 22 1H 5,18 m 1H 5,160 m 1H 5,35 m 1H 5,351 brd 5,4 23 1H 5,01 m 1H 5,021 m 18 3H 1,01 s 3H 1,011 s 26 3H 0,84 d 6,5 3H 0,844 d 6,4 19 3H 0,7 s 3H 0,697 s 27 3H 0,80 d 6,5 3H 0,791 d 6,6 21 3H 1,05 d 3H 1,026 d 6,8 29 3H 0,82 m 3H 0,811 t 7,3 28 29 20 26 25 6' HO HO 16 27 OH 14 10 24 11 27 18 HO 25 23 26 20 17 11 21 24 19 29 28 22 21 O 3' OH 1' (Stigmasta-5,22-dien-3β-ol) (Daucosterol) Hợp chất 6: Hợp chất kết tinh vơ định hình, màu trắng, tan tốt clorofom, Rf (H:E=3:1) = 0.6, nhiệt độ nóng chảy 155-156 oC Phổ IR có vân tù, nhiều đỉnh, cƣờng độ 95 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 lớn vùng 3400cm-1 thuộc dao động nhóm OH Phổ 1H NMR có vân đơn  = 5,38ppm đƣợc quy kết cho nhóm =C-H vịng xiclohexen ngƣng tụ; vân đơi có = 4,41ppm thuộc CHOH Đây C-1‟ đƣờng tạo liên kết glycozit Sáu proton với giá trị H từ 3,23 đến 3,85 ppm đƣợc gán cho nhóm CH, nhóm CH2 từ gốc đƣờng D-glucozơ Ở vùng trƣờng cao: Có tín hiệu proton đặc trƣng cho steroit, với giá trị  từ 0,70 đến 2,42 ppm, có cacbon metyl với H 0,70; 0,82; 0,83; 0,85; 0,90; 1,03 ppm Phổ 13C NMR có tất 35 pic, tƣơng ứng với 35 cacbon với pic C có C = 121,8ppm 140,3ppm đƣợc gán cho cacbon >C=CH-; 1C với giá trị C =101,8 đƣợc gán cho C-1‟ đƣờng; pic C với giá trị C = 77,3; 76,8; 73,5; 70,2; 61,8 đƣợc gán cho cacbon lại đƣờng D-glucozơ Ở vùng trƣờng cao với δ từ 11,63 ppm đến 56,14 ppm pic cacbon lai hóa sp3, có cacbon metyl với δC = 12,2 12,2 19,3 19,7 20,0 ppm Kết hợp với phổ HSQC so sánh giá trị phổ 1H NMR, 13C NMR với daucosterol [7] chúng tơi thấy có trùng khớp tốt, kết luận daucosterol, glycozit phổ biến giới thực vật 2.3 Kết thử hoạt tính sinh học Kết thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất 1, 2, 4, cho thấy: hợp chất kháng chủng vi khuẩn Gram (+) kháng nấm men Candida albicans, hợp chất kháng vi khuẩn S.aureus – tất mức trung bình (IC50 từ 76,5 đến 92,8 g/mL) III KẾT LUẬN Từ củ Bách thân đứng (Stemona cochinchinensis) Bách thân leo (Stemona tuberosa) phân lập xác định đƣợc cấu trúc hợp chất Đó chất stemanthrene C (1), axit tetracosanoic (2), axit 12-propylpentadec-11-enoic (3), neotuberostemonine (4), stigmasta-5,22-dien-3-ol (5) daucosterol (6); hợp chất kháng chủng vi khuẩn Gram (+) kháng nấm men Candida albican, hợp chất kháng vi khuẩn S.aureus mức trung bình (IC50 từ 76,5 đến 92,8 g/mL) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi, Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb KHKT, 180, 1977 [2] Kostecki K., Engenmeier D.E., Pacher T., Hofer O., Vajrodaya S., Greger H., Dihydrophenanthrenes and other antifungal stilbenoids from Stemona cf pierrei, Phytochem., Vol 65, 99-106, 2004 [3] Nguyen Thi Thu Ha, Vong Anatha Khamko, Nguyen Thi Nhan, Pham Huu Dien, Dang Ngoc Quang, Chemical constituents from the ethyl acetate extract of roots of Stemona peirrei in Laos, J of Chemistry, Vol 51, No.2C, 909-912, 2013 [4] Phạm Thị Huyền, Nghiên cứu thành phần hóa học củ Bách thân leo Stemona tuberosa thu hái Hịa Bình, Luận văn thạc sĩ hóa học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, 2013 [5] Yang Ye, Guo Wei Qin, Ren Sheng Xu, Alkaloids from Stemona tuberosa, Phytochem., Vol.37, No.4, 1201-1203, 1994 [6] Goad L.J., Akihisa T., Analysis of sterols, Blackie Acad & Profess Press., 380, 1992 [7] Jong Su Yoo et al, Steroids from the aerial parts of Artemisia princeps, Korean J Med Crop Sci., Vol.14, No.5, 273-277, 2006 96 ... of Stemona peirrei in Laos, J of Chemistry, Vol 51, No.2C, 909-912, 2013 [4] Phạm Thị Huyền, Nghiên cứu thành phần hóa học củ Bách thân leo Stemona tuberosa thu hái Hòa Bình, Luận văn thạc sĩ hóa. .. Escherichia coli, Pseudomonas areuginosa, Salmonella enterica, chủng nấm men: Candida albicans theo phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ Kết nghiên cứu 2.1 Thành phần hóa học Bách thân đứng S.cochinchinensis... – tất mức trung bình (IC50 từ 76,5 đến 92,8 g/mL) III KẾT LUẬN Từ củ Bách thân đứng (Stemona cochinchinensis) Bách thân leo (Stemona tuberosa) phân lập xác định đƣợc cấu trúc hợp chất Đó chất