Cây khổ qua rừng đã được y học dân gian sử dụng rộng rãi trong trị bệnh đường huyết. Theo một số tài liệu khoa học, cây khổ qua rừng có chứa nhiều nhóm hợp chất tự nhiên trong đó có saponin. Nhưng các saponintrong khổ qua rừng Việt nam chưa được nghiên cứu sâu về cấu trúc hóa học cũng như tác dụng sinh học. Với các lý do đó nhóm nghiên cứu đã thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu nhóm hợp chất saponin trong cây khổ qua rừng momordica charantia L. var. abbreviata ser”.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY KHỔ QUA RỪNG (Momordica charantia L Var Abbreviata Ser Cucurbitaceae) Nguyễn Thành Trung*, Trương Thị Thanh Huyền*, Nguyễn Thị Hồng Hương* TÓM TẮT Mở đầu: Cây khổ qua rừng(Momordica charantia L var abbreviata Ser.) y học dân gian sử dụng rộng rãi trị bệnh đường huyết Theo số tài liệu khoa học, khổ qua rừng có chứa nhiều nhóm hợp chất tự nhiên có saponin Nhưng saponintrong khổ qua rừng Việt nam chưa nghiên cứu sâu cấu trúc hóa học tác dụng sinh học Với lý chúng tơi thực đề tài “Bước đầu nghiên cứu nhóm hợp chất saponin khổ qua rừng Momordica charantia L var abbreviata Ser.” Đối tượng phương pháp nghiên cứu:Đối tượng: khổ qua rừng (toàn mặt đất) thu hái Tây Ninh (4 – 2011) phơi khô xay nhỏ rây mm Mẫu PGS.TS Trương thị Đẹp chủ nhiệm môn Thực vật khoa Dược, đại học Y DượcHCMđịnh danh.Phương pháp nghiên cứu: - Sơ xác định thành phần hóa học khổ qua rừng phương pháp Ciuley cải tiến.- Khảo sát điều kiện chiết xuất saponin khổ qua rừng dùng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70% Loại tạp, cô đặc dịch chiết tới cao đặc chiếtphânbốcaođặcvớinhữngdungmơicóđộphâncựckhácnhauCHCl3, EtOAc, n-BuOH.- Phân lập số hợp chất flavonoid từ cao EtOAc phương pháp sắc ký sắc ký cột nhanh, sắc ký cột pha đảo, chiết pha rắn, sắc ký rây phân tử, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC).- Phân lập tách saponin từ cao n-BuOH phương pháp sắc ký, qua cột chiết pha rắn, cột nhanh pha thuận, cột Sephadex, cột Silicagel Tinh chế saponin thu hợp chất tinh khiết S1 Tiến hành đo phổ MS NMR S1 để xác định cấu trúc Kết bàn luận:- Từ kết phản ứng định tính, sơ kết luận khổ qua rừng có chứa flavonoid, saponin triterpen, hợp chất polyphenol, đường khử.- Khảo sát sơ điều kiện chiết xuất cho thấy thân có nhiều saponin chiết cồn 70% cho nhiều saponin tạp chất so với cồn 90%.Từ 2,5 kg bột thân chiết ngấm kiệt với 20 lít cồn 70%, thu hồi dung môi, lọc loại tạp thu cao lỏng Cao lỏng chiết phân bố với chloroform, EtOAc, n –BuOH cô loại dung môi thu 100g cao EtOAc (chứa flavonoid), 200 g cao n- BuOH (saponin toàn phần).-Tách sắc ký cao EtOAc thu phân đoạn dương tính với thuốc thử FeCl3 kiểmtracác phân đoạn TLC HPLC, phát hiệntrongkhổ qua rừng có chứa rutin (so sánh với rutin chuẩn thấy có trùng khớp Rf, màu sắc vết, thời gian lưu TR phổ UV) vết dương tính với thuốc thử flavonoid.- Phân lập saponin: Từ 100 g cao n - BuOH tiếp tục phân lập qua cột chiết pha rắn thu 3,2 g cắn D1, cột nhanh pha thuận thu 640 mg cắn D2, qua cột Sephadex thu 300 mg cắn D3 cột cổ điển pha thuận thu tinh thể S1 (13 mg) Rửa tinh thể S1 với ether ethylic thu chất khối lượng 11 mg - Xác định cấu trúc S1:Từ phổ MS cho (M+) = 648,39 m/z phổ NMR (1H, 13C, HSQC HMBC)so sánh với tài liệu (Error! Reference source not found.,1) sơ nhận định S1 momordicosid K Kết luận:Trong khổ qua rừng Việt nam mọc Tây ninh có chứa hợp chất flavonoid (trong có rutin), saponin triterpenoid (trong có momordicosid K)vàpolyphenol Từ khóa: Momordica charantia L var abbreviata Ser., momordicosid K ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Thị Hồng Hương Chuyên Đề Dược Học ĐT: 01217432666 Email: nguyenhhuong@yahoo.com 169 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 ABSTRACT PRELIMINARY STUDIES ON CHEMICAL CONSTITUENTS OF MOMORDICA CHARANTIA L VAR ABBREVIATA SER CUCURBITACEAE Nguyen Thanh Trung, Truong Thi Thanh Huyen, Nguyen Thị Hong Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: : 169 - 174 Introduction: The bitter melon M charantia L var abbreviata Ser has been used as antidiabetic drug in traditional medicine According to recent published results, this plant contains various natural compounds including saponins The saponin compoundsof Vietnamese M charantia L var abbreviata Ser have not been yet studied deeply about the chemical structure as well as biological activities Therefore, we have accessed the essay “Preliminary studies on saponin compounds of M charantia L var abbreviate” Materials and methods: Materials: the ground-above parts of M charantia L var abbreviate were harvestedin Tay Ninh province (April – 2010), dried and cut into pieces in order to pass through mm sieve.Methods::- Checking the purity and identifying the chemical constituents of the herbal modified by Ciuley method - Extracting (percolation with alcohol 70%) and isolating flavonoid glycosides, saponin compounds by chromatography methods (TLC, CC, SPE, sephadex column, HPLC) and specific chemical tests - Determining the structure of the pure compound S1 by MS and NMR spectrum results Results and discussions: - M charantia L var abbreviatafrom Tay Ninh province of Viet Nam contains polyphenols, triterpenoids, saponins and flavonoid glycosides.- 2.5 kg of M charantia var abbreviata extracted with 20 liters of 70% alcohol The liquid extract was acessed to collect the EtOAc extract (flavonoid contents 100g) and n- BuOH extract (200 g) contents saponin Results from the EtOAc extract: The results obtained from forest bitter melon fractions were positive with FeCl3test which was continued to be isolated by chromatography (CC, TCL and HPLC) As the results of these we received flavonoids From total flavonoid extract, rutin was found by comparing with the standard rutin in TLC (by Rf, color) and HPLC (by TR, UV spectrum of peak) Results from the n–BuOH extract: Being isolated by solid phase extraction, rapid column chromatography, sephadex column and traditional column chromatography method gave the product S1 (13 mg) The identified product was purified by washing with ether ethylic to obtain 11 mg of S1 According to the references and the results of H1 and C13 NMR spectrum, we preliminarily identify that the terpene saponin S1 is momordicoside K Conclusions: The results showed that M charantia var abbreviata contained flavonoid glycosides (including rutin), triterpenoid saponins (including momordicoside K) and polyphenols Keywords: Momordica charantia L var abbreviata Ser., momordicosid K không điều trị ăn uống cách vơ ĐẶT VẤN ĐỀ nguy hiểm biến chứng (bong võng mạc, hoại Bệnh đái tháo đường type (khơng phụ tử tứ chi, …) Do nhu cầu thuốc điều trị thuộc insulin) với triệu chứng ăn, uống tiểu bệnh ĐTĐ vấn đề cần giải tiện nhiều hai bệnh mãn tính thời cấp bách nhà quản lý y tế đại khó trị khỏi - bệnh tăng huyết áp Y học cổ truyền chứng minh có nhiều loại (hypertension) bệnh đái tháo đường thảo dược hành tây, mướp đắng, nhân (diabetes).Ở Việt Nam bệnh đái tháo đường sâm hiệu điều trị bệnh ĐTĐ, (ĐTĐ) phát triển nhanh Độ tuổi mắc bệnh có tác dụng hạ đường huyết.Khổ qua rừng trẻ hóa từ 45 đến 64 tuổi tập trung nhiều thành dược liệu loài khác thứ thị với tỷ lệ 4%, nông thôn 2,5%.Bệnh ĐTĐ (variete) với khổ qua – thực phẩm, dược 170 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 liệu Khổ qua rừng có nhỏ vị đắng nhiều.Y học dân gian dùng vị thuốc điều trị ĐTĐ làm hạ cholesterol huyết Nhiều tài liệu khoa học cơng bố khổ qua rừng có hoạt tính trị liệu mạnh so với khổ qua, báo cáo khoa học thành phần hóa học loại dược liệu hạn chế.Trong báo chúng tơi trình bày kết “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học khổ qua rừng” ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng Mẫu nghiên cứu toàn thân mặt đất khổ qua rừng thu hái Tây Ninh (tháng 4/2011); Mẫu PGs.Ts Trương thi Đẹp chủ nhiệm môn Thực vật khoa Dược, đại học Y DượcHCMđịnh danh Hóa chất – Thiết bị Tất hóa chất thuốc thử sử dụng đạt yêu cầu tinh khiết cho loại thiết bị phân tích chuyên dụng HPLC, LC-MS, NMR Một số thiết bị sử dụng gồm: Hệ thống HPLC water2695; Water2420 detector PDA; Máy đo phổ MS Micromass® Quattro micro™ API khoa Dược Đại học Y Dược TP.HCM; Máy đo phổ NMRBRUKER Avance Viện Cơng Nghệ Hóa học Nghiên cứu Y học &13C NMR pha mẫu CD3OD, lọc qua màng 0,45µm, đo máy BRUKER Avance 300 MHz (1H) – 75 MHz (13C) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Từ kết thực nghiệm xác định thân khổ qua rừng có chứa hợp chất tinh dầu, saponin, flavonoid, polyphenol, triterpen, acid hữu vàđường khử Chiết 2,5 kg bột thân khổ qua rừng với EtOH 70%, cô loại tạp (chlorophyl, uronic…) thu cao lỏng Lấy cao lỏng hòa với nước chiết phân bố với Et2O, EtOAc, n-BuOH thu 100 g cao phân đoạnEtOAc dùng để tách flavonoid 200g cao phân đoạn n-BuOH dùng để tách saponin Khảo sát hợp chất flavonoid: Từ cao EtOAc tiếp tục phân tách qua cột Lichroprep RP 18, sephadex LH 20 thu phân đoạn dương tính với thuốc thử FeCl3, Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng với pha động EtOAcHOOH-AcOH-H2O (13,5:0,8:1,5:2,5), phát vết với thuốc thử FeCl3 Trên sắc ký đồ TLC thấy có vết trùng khớp Rf màu sắc vết so sánh với rutin chuẩn Kiểm tra phân đoạn HPLC với máy WATERS 2969 điều kiện sắc ký: - Chiếtxuất flavonoid saponin khổ qua rừng bằngkỹ thuật ngấm kiệt với cồn Cột sắc ký Waters Spherisorb 5µm C8, 4,6 x 250 mm; Nhiệt độ cột: 45oC; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Thể tích bơm: 10 µl; Phát hiện: detector PDA 360 nm; pha động gồmacetonitril (a) TFA 0,1%/H2O (b)với chế độ rửa giải gradient: phút 0,0 - 20: 20 (a) 80 (b); phút 20,5 - 30: 21% (a) 79% (b); phút 30,5-34: 30% (a) 70% (b); phút 34,5- 42: 90% (a) 10% (b); phút 42,5-50,0: 20% (a) 80% (b) ethanol 70% Phân lập tách hợp chất phương pháp chiết phân bố, tách pha rắn với pha tĩnh Lichroprep RP 18, sắc ký cột Diaion HP 20, Sephadex LH 20 (4) Tinh chế saponin thu hợp chất tinh khiết S1 Kết cho thấy sắc ký đồ HPLC cho vết với phổ UV có dạng điển hình flavonol So sánh với rutin chuẩn điều kiện cho thấy pic trùng khớp thời gian lưu 13,5 phút dạng phổ UV (hình 1b) Phương pháp nghiên cứu Kiểm tra độ tinh khiết dược liệu (độ tro, độ ẩm) xác định sơ thành phần hóa học khổ qua rừng phương pháp Ciuley cải tiến - Xác định cấu trúc S1 đophổ MS,1H NMR Chuyên Đề Dược Học 171 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Khảo sát hợp chất saponin (b) (a) Hình 1: (a) Sắc ký đồ HPLC phổ UV pic flavonoid toàn phần (b) sắc ký đồ phổ UV rutin Định tính nhóm hợp chất saponin SKLM phản ứng đặc trưng sơ kết luận khổ qua rừng có chứa saponin triterpenoid Khảo sát sơ điều kiện chiết xuất cho thấy thân có nhiều saponin chiết cồn 70% cho nhiều saponin tạp chất so với cồn 90% Từ cao n-butanol tiếp tục tách phương pháp sắc ký cột silica gel.Kiểm tra phân đoạn phản ứng màu với vanilin acid sulfuric (VS) Cô áp suất giảm loại dung thu 12 g cắn D Tiếp tục phân lập cắn D qua cột chiết pha rắnLichroprep RP 18 (D1), cột diaion HP 20 (D2), cột sephadex thu 300 mg cắn D3 cột cổ điển silica gel thu đơn chất S1 (13 mg) Trong trình phân lập phân đoạn sắc ký cột kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3– MeOH– H2O (65:35:10) phát vết dương tính với thuốc thửVS Từ cắn D3 tiếp tục qua cột silica gel với dung môi rửa giải CHCl3, CHCl3–MeOH (99:1), CHCl3– MeOH (98:2) thu tinh thể hợp chất tinh khiết S1 (13 mg) Rửa tinh thể với ether ethylic thu 11 mg S1 172 A B Hình 2: Sắc ký đồ hợp chất saponin khổ qua rừngD1: Cao sau chiết pha rắn D2: Cao sau qua cột diaionD3: Cao sau qua cột Sephadex S1: hợp chất tinh khiết Hệ dung môi A: CHCl3 – MeOH (80:20) B: CHCl3 –MeOH – H2O (65:35:10) Đo phổ MS S1 pha MeOH đo với kỹ thuật (ES +), phổ MS cho phân mảnh có m/z 671,55 (M+Na+), m/z 687,49 (M + K+), m/z 648,39 (M+) Phổ NMRS1 Theo phổ NMR 13C, S1 gồm 37 carbon có Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 chuyển dịch hóa học từ 15 – 210 ppm khơng có tín hiệu nhóm CH 159 ppm, công thức nhân thơm (Error! Reference source not found.) Trên phổ DEPT cho thấy S1 có 15 CH, CH2, CH3 C bậc 4.Mũi CH 210.4 ppm đặc trưng cho nhóm Nghiên cứu Y học aldehyde, HMBC cho tín hiệu tương tác H8 C19chứng tỏ nhóm aldehyde gắn vào vị trí Mũi 102,2 mũi đặc trưng cacbon acetal (O–CH–O) cacbon loại >CH–O cộng hưởng vùng từ 71,7 đến 78,1 chứng tỏ có phân tử đường ghép vào genin Bảng Dữ liệu phổ NMR S1 (CD3OD) Vị trí δC (ppm) 22,3(t) 29,8 (t) 77,1 (d) 42,4 (s) 148,0 (s) 123,4 (d) 73,5 (d) δH (ppm) 1,62 (1H, m), 1,25 (1H, m) 2,02 (1H, s), 1,72 (1H, m) 3,57 (1H, br.s) − − 5,98 (1H, d, 4,5 Hz) 4,20 (1H, d, 5,5 Hz) 47,0 (d) 2,05 (1H, s) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 51,3 (s) 37,5 (d) 23,2 (t) 30,1 (t) 46,7 (s) 49,6*(s) 35,8 (t) 28,4 (t) 51,3 (d) 15,4 (q) 210,3 (d) 37,4 (d) 19,3 (q) 22 40,4 (t) 23 24 25 26 27 28 29 30 OMe 130,0 (d) 137,7 (d) 76,5 (s) 26,4 (q) 26,0 (q) 27,8 (q) 26,2 (q) 18,8 (q) 50,5* (q) − 1,58 (1H, m) 2,38 (1H, m), 1,48 (1H) 1,72 (2H, m) − − 1,40 (2H, m) 1,99 (2H, br), 1,45 (1H, m) 1,55 (1H, m) 0,96 (3H, s) 9,87 (1H, s) 2,61 (1H, br.d, 9,0 Hz) 1,00 (3H, d, 7.0 Hz) 2,24 (1H, br.d, 9,0 Hz) 1,86 (1H, m) 5,61 (1H, m) 5,21 (1H, d, 15,5 Hz) − 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 102,2 (d) 75,0 (d) 78,1 (d) 78,0 (d) 71,7 (d) 6’ 62,8 (t) 1,10 (3H, s) 1,27 (3H, s) 0,84 (3H, s) 3,16 (3H, s) D - Glucopyranosid 4,27(1H, d, 8,0 Hz) 3,15 (1H, m) 3,23 (1H, m) 3,35 (1H, m) 3,29 (1H, m) 3,90 (1H, dd, 1,5, 12,0) 3,69 (1H, dd, 5,5, 12,0) 13 HMBC H→ C C5, C1 C4, C7, C10 C5, C6, C9, C1’ C6, C7, C19, C10, C30 >C< – CH < – CH2 – – CH2 – >C< >C< – CH2 – – CH2 – – CH < – CH3 – CHO – CH < – CH3 C1, C5, C9, C19 C9, C12, C10, C19 C13, C14 C20 C12, C13 C9, C11 C17, C20, C22 C20, C23 – CH2 1,27 (6H, s) Loại carbon – CH2 – – CH2 – >C–O >C< =C< =C– – CH – OH – CH < – CH < >C< – CH3 – CH3 – CH3 – CH3 – CH3 – CH3 C22, C24, C25 C22, C23, C25, C26, C27 C24, C25, C27 C24, C25, C26 C3, C4, C5, C29 C3, C4, C5, C28 C13, C14, C15 C25 – CH < – CH < – CH < – CH < – CH < C7, C3’ C1’, C6’ C2’, C4’ C3’, C5’ C5’ – CH2 (* phần bị trùng lắp với pic D3COD xác định phổHMBC) Phổ NMR 1H cho thấy S1 có nhóm Chuyên Đề Dược Học CH3 Các tín hiệu d, dd, 1H vùng 3,5 – 173 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Từ kết phổ NMR H 13C so sánh với liệu phổ NMR momordicosid K(Error! Reference source not found.,1) sơ nhận định S1 momordicosid K - saponin triterpen 5,5 ppm chứng tỏ S1 có đường ghép vào genin(Error! Reference source not found.) Tại 9,87 ppm có tín hiệu chứng tỏ có H ghép nối với O (CHO)(Error! Reference source not found.) Các liệu phổ 1H 13C hoàn toàn phù hợp với 26 25 O Me 27 23 21 22 20 18 24 12 O 17 11 13 16 19 14 10 15 30 HO 28 O 29 H HO 6' 4' H 5' O HO HO 3' H 2' OH H 1' H Hình 3: Cấu trúc momordicosid K KẾT LUẬN Trong khổ qua rừng có chứa hợp chất polyphenol, triterpenoid, saponin, flavonoid (trong có rutin).Trong nhóm hợp chất saponin triterpen, chúng tơi chiết, phân lập tinh chế momordicosid K Cấu trúc hóa học củamomordicosid K xác định dựa phổ MS, NMR so sánh với tài liệu công bố TÀI LIỆU THAM KHẢO 174 Ngô Hải Ðăng, Phùng Văn Trung Nguyễn Ngọc Hạnh (2011) Khảo sát thành phần hóa học trái khổ qua Momordica charantia L Tạp chí khoa học trường Đại học Cần thơ 2011, 19(a) 35 – 37 Okabe H, Miyahara Y, Yamauchi T (1982) Studies on constituents of Momordica charantia L (III 1, 2) Chem Pharm Bull 30 (11):3977- 3986 Okabe H, Miyahara Y, Yamauchi T (1982) Studies on constituents of Momordica charantia L IV, Characterization of New Cucurbitacin Glycosides of the Immature Fruits, Structures of the Bitter Glycosides, Momordicosides K and L, Chem Pharm Bull 30(12): 4334-4340 Zhao M, Tao G, Gu X, Tang J, Jiang C (2008) “Separation, Purification and Structure Identification of a Saponin from Momordica charantia L var abbreviate Ser”, Journal of food biochemistry 27(6):44-47 Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 21.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... với khổ qua, báo cáo khoa học thành phần hóa học loại dược liệu hạn chế.Trong báo chúng tơi trình bày kết Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học khổ qua rừng ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU... pháp nghiên cứu Kiểm tra độ tinh khiết dược liệu (độ tro, độ ẩm) xác định sơ thành phần hóa học khổ qua rừng phương pháp Ciuley cải tiến - Xác định cấu trúc S1 đophổ MS,1H NMR Chuyên Đề Dược Học. .. thành phần hóa học trái khổ qua Momordica charantia L Tạp chí khoa học trường Đại học Cần thơ 2011, 19(a) 35 – 37 Okabe H, Miyahara Y, Yamauchi T (1982) Studies on constituents of Momordica charantia