Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất triterpenoid từ cây trâu cổ (ficus pumila l ) họ dâu tằm (moraceae

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG HƯƠNG LY PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ CÂY TRÂU CỔ(Ficus pumila L.) HỌ DÂU TẰM (Moraceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG HƯƠNG LY PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ CÂY TRÂU CỔ(Ficus pumila L.) HỌ DÂU TẰM (Moraceae) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Triệu Quý Hùng Trường Đại học Hùng Vương Phú Thọ, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Triệu Quý Hùng Các số liệu, kết nêu Khóa luận trung thực chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Tồn thơng tin trích dẫn Khóa luận rõ nguồn gốc xuất xứ Sinh viên Hoàng Hương Ly LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập rèn luyện giảng đường Trường Đại học Hùng Vương, với lòng yêu nghề, tận tâm, hết lịng truyền đạt thầy cơ, em tích lũy nhiều kiến thức kỹ cần thiết công việc sống Lời đầu tiên,em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Triệu Quý Hùng - người thầy trực tiếp hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em suốt trình thực đề tài nghiên cứu khoa học q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ban giám hiệu Trường Đại học Hùng Vương, tập thể lãnh đạo, cán bộ, chuyên viên khoa Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện thời gian, kinh phí hỗ trợ em thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân ln cạnh con, ủng hộ, động viên suốt trình học tập rèn luyện Khóa luận tốt nghiệp xin dành tặng Bố, Mẹ Em – người trân quý! Phú Thọ, ngày 02 tháng năm 2018 Sinh viên Hoàng Hương Ly -i- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi MỞ ĐẦU 1 Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi F.pumila L 1.2 Đặc điểm thực vật Trâu cổ 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Ficus CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 12 2.3.1 Phương pháp ngâm chiết 13 2.3.2 Phương pháp kết tinh 14 2.3.3 Phương pháp sắc ký 14 2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ 26 3.2 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết n-hexane Trâu cổ 30 3.2.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi 30 3.2.2 Quá trình phân lập chất 33 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FH1 40 3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất FH1 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 -ii- Kết luận 53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 -iii- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột  Các phương pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT DEPT COSY Correlation Spectroscopy: Phổ tương tác chiều đồng hạt nhân HSQC H-1H Heteronuclear Single Quantum Correlation: Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân s: singlet (vạch đơn) m: multiplet (đa vạch) d: doublet (vạch đôi) dd: double doublet (tách đôi vạch đôi) brd: broadboublet (vạch đôi tù)  Các chữ viết tắt khác TMS Tetramethyl silan CTPT Công thức phân tử  Tên hợp chất viết theo nguyên Tiếng Anh -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Trâu cổ Hình 2.1 Bộ chưng cất dung môi máy cất quay chân không 12 Hình 2.2 Các dung mơi phổ biến 12 Hình 2.3 Bình triển khai sắc kí mỏng Camag máy soi UV 12 Hình 2.4 Sơ đồ chung phương pháp ngâm chiết 13 Hình 2.5 Minh hoạt sắc ký lớp mỏng 14 Hình 2.6 Minh họa sắc ký cột 15 Hình 2.7 Ví dụ minh họa tách vạch phổ 18 Hình 2.8 Độ chuyển dịch hóa học carbon-13 19 Hình 2.9 Hình ảnh minh họa phổ DEPT 19 Hình 2.10 Hình ảnh minh họa phổ 1H-1H COSY 20 Hình 2.11 Hình ảnh minh họa phổ HSQC 21 Hình 2.12 Hình ảnh minh họa phổ HMBC 22 Hình 2.13 Phổ IR pentan 23 Hình 2.14 Minh họa phổ EI-MS 24 Hình 2.15 Minh họa phổ ESI-MS 25 Hình 3.1 Mẫu Trâu cổ sau phơi khô 26 Hình 3.2 Hình ảnh ngâm Trâu cổ dung môi n-Hexane 26 Hình 3.3 Quá trình lọc dung dịch qua vải 27 Hình 3.4 Quá trình lọc dung dịch qua giấy lọc 27 Hình 3.5 Quay khơ dung dịch máy cất quay 28 Hình 3.6 Cặn n-hexane Trâu cổ 28 Hình 3.7 Ngâm Trâu cổ dung môi EtOAc 29 Hình 3.8 Ngâm Trâu cổ dung môi MeOH 29 Hình 3.9 Sơ đồ ngâm chiết Trâu cổ 30 Hình 3.10 Kết khảo sát TLC cặn chiết n-Hexane Trâu cổ 31 Hình 3.11 TLC cặn n-hexane Trâu cổ với hệ dung môi (V) 32 Hình 3.12 Cột tổng silica gel cặn n-hexane 33 -v- Hình 3.13 Quá trình sắc ký cột tổng n-hexane 34 Hình 3.14 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F9 35 Hình 3.15 Cột silica gel FPLH F3 36 Hình 3.16 Hình ảnh TLC phân đoạn FPLH F3.1 –F3.12 37 Hình 3.17 Cột silica gel FPLH F3.7 37 Hình 3.18 Cột silica gel FPLH F3.7.4 38 Hình 3.19 Sơ đồ phân lập hợp chất FH1 39 Hình 3.20 Hình ảnh chất FH1 sắc ký đồ TLC 40 Hình 3.21 Cấu trúc FH1 40 Hình 3.22 Phổ khối lượng FH1 41 Hình 3.23 Phổ hồng ngoại FH1 42 Hình 3.24 Phổ 13C-NMR FH1 43 Hình 3.25 Phổ DEPT FH1 44 Hình 3.26 Phổ 1H-NMR FH1 45 Hình 3.27 Phổ 1H-NMR giãn rộng (1) FH1 46 Hình 3.28 Phổ 1H-NMR giãn rộng (2) FH1 46 Hình 3.29 Phổ HSQC FH1 47 Hình 3.30 Phổ COSY FH1 49 Hình 3.31 Phổ HMBC FH1 50 Hình 3.32 Tương tác phổ COSY, HMBC FH1 51 Hình 3.33 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào FH1 52 -vi- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Độ chuyển dịch hóa học proton 17 Bảng 2.2 Tần số số nhóm nguyên tử phổ hồng ngoại 23 Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng 32 Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu từ cột tổng n-Hexane 34 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR FH1 48 -41- Hình 3.22 Phổ khối lượng FH1 Phổ hồng ngoại FH1 cho đỉnh hấp thụ nhóm OH phân tử 3487 cm1 kèm theo đỉnh âm bội 1037cm1, liên kết C=C 1641cm1 Các dao động liên kết H-C= quan sát 3053 cm1, Cno-H 2933 2866 cm1 -42- Hình 3.23 Phổ hồng ngoại FH1 Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy phân tử FH1 có 30C có 8CH3, 10CH2, 5CH 7Cq; điều dự đốn FH1 có cấu trúc triterpenoid -43- Hình 3.24 Phổ 13C-NMR FH1 -44- Hình 3.25 Phổ DEPT FH1 -45- Điều khẳng định phổ 1H-NMR FH1 có tín hiệu nhóm methyl liên kết với C bậc dạng singlet (H 0,80 (3H, s, CH3-24); 0.82 (3H, s, CH3-28); 0,91 (6H, s, CH3-26,30); 0,93 (3H, s, CH3-25); 0,95 (3H, s, CH3-29); 0,98 (3H, s, CH3-23); 1,09 (3H, s, CH3-27) Hình 3.26 Phổ 1H-NMR FH1 -46- Hình 3.27 Phổ 1H-NMR giãn rộng (1) FH1 Liên kết đôi phân tử FH1 khẳng định tín hiệu nhóm methin olefinic H 5,53 (1H, dd, 8,0; 3,0 Hz, H-15) C 158,1 (C-14); 116,9 (C-15) Hình 3.28 Phổ 1H-NMR giãn rộng (2) FH1 -47- Phân tích phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC FH1 cho thấy tín hiệu nhóm methin sp3 liên kết với oxygen H 3,19 (1H, dd, 11,0; 4,0 Hz, H-3) tương ứng với C 79,1 (C-3) phổ 13C-NMR Hình 3.29 Phổ HSQC FH1 -48- So sánh liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR (Bảng 3.3) FH1 cho thấy phù hợp với liệu phổ taraxerol [9], [10], [13] Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR FH1 Vị C, H, ppm, mult Vị C, H, ppm, mult trí ppm (J, Hz) trí ppm (J, Hz) 37,8 27,2 1,62 (1H, m, H-1a) 16 37,7 1,92 (1H, brd, 14,5 Hz, H-16a) 0,95 (1H, m, H-1b) 1,62 (1H, m, H-16b) 1,62 (1H, m, H-2a) 17 35,8 - 1,56 (1H, m, H-2b) 79,1 3,19 (1H, dd, 11,0; 18 49,2 1,38 (1H, m) 4,0 Hz) 39,0 - 19 41.4 2,03 (1H, brd, H-19a) 1,36 (1H, m, H-19b) 55,6 0,78 (1H, m) 18,8 1,60 (1H, m, H-6a) 21 33,1 1,40 (1H, m, H-21a) 1,48 (1H, m, H-6b) 1,26 (1H, m, H-21b) 1,36 (1H, m, H-7a) 22 33,7 1,64 (1H, m, H-22a) 1,02 (1H, m, H-7b) 1,58 (1H, m, H-22b) 35,1 20 28,8 - 38,8 - 23 28,0 0,98 (3H, s) 48.8 0,98 (1H, overl) 24 15,5 0,80 (3H, s) 10 37,6 - 25 15,4 0,93 (3H, s) 11 17,5 1,64 (1H, m, H-11a) 26 29,8 0,91 (3H, s) 1,48 (1H, m, H-11b) 12 36,7 1,32 (1H, m, H-12a) 27 25,9 1,09 (3H, s) 1,00 (1H, m, H-12a) 13 38,0 - 28 29,9 0,82 (3H, s) 14 158,1 - 29 33,4 0,95 (3H, s) 15 116,9 5,53 (1H, dd, 8,0; 30 21,3 0,91 (3H, s) 3,0 Hz) -49- Phân tích phổ COSY xác định chuỗi liên kết H15-H16a; H3H2a-H1a; H5-H6b-H7a; H9-H11b-H12b; H21a-H22a Hình 3.30 Phổ COSY FH1 Trên phổ HMBC xác định tương tác H-3 với C-23, C-24; H23 với C-4, C-24, C-5 chứng tỏ vị trí C-4 gắn với nhóm CH3-23, 24 OH -50- gắn C-3 Các tương tác phổ HMBC trình bày hình 3.32 Hình 3.31 Phổ HMBC FH1 -51- Hình 3.32 Tương tác phổ COSY, HMBC FH1 Kết hợp kiện phổ IR, MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, chiều so sánh với tài liệu tham khảo [9],[10],[13] cho phép xác định cấu trúc FH1 taraxerol Đây hợp chất triterpenoid khung taraxerane lần phân lập từ chi Ficus 3.4Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất FH1 Hợp chất FH1 đem thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gồm tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu) ung thư vú (MCF7) Các phép thử tiến hành phịng Hóa sinh ứng dụng-Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam -52- Hình 3.33 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào FH1 Tuy nhiên kết thử nghiệm cho thấy hợp chất FH1 hoạt tính dịng tế bào ung thư thử nghiệm -53- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết đề tài khóa luận tốt nghiệp đạt mục tiêu đề ra: - Điều chế 97,1 gam cặn dịch chiết n-hexane Trâu cổ khảo sát sắc ký mỏng cặn dịch chiết này; lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2/n-hexane làm dung môi rửa giải sắc ký cột silica gel để phân tách cặn dịch chiết n-hexane thành phân đoạn khác nhau.Lần phân lập hợp chất triterpenoid khung taraxerane taraxerol (FH1) từ phân đoạn nhỏ dịch chiết n-hexane Trâu cổ phương pháp sắc ký cột silica gel kết tinh - Cấu trúc hợp chất FH1 xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, chiều: 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC; khổ khối lượng phổ hồng ngoại - Đã khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất FH1 dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu) ung thư vú (MCF7) Tuy nhiên FH1 khơng thể hoạt tính dịng tế bào Kiến nghị - Tiếp tục phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ dịch chiết khác phận khác Trâu cổ (Ficus pumila L.) nhằm tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có lồi - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ Trâu cổ - Bán tổng hợp số hợp chất từ Trâu cổ khảo sát hoạt tính sinh học chúng -54- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng-Tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [2] Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học hoạt tính sinh học loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium - Quyển 1,NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội [3] Triệu Quý Hùng (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Goniothalamus macrocalyx Ban Goniothalamus gracilipes Ban họ Na (Annonaceae), Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội [4] Đỗ Tất Lợi (2011),Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam,NXB Thời Đại [5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [6] Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình sở hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB Đai học sư phạm [7] Đặng Như Tại, Ngơ Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB Giáo dục Việt Nam [8] Đào Thị Hải Yến (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học số phân đoạn dịch chiết n-Hexane Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm ( Moraceace) địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp ngành sư phạm hóa học, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ Tài liệu Tiếng Anh [9] Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma (2012), “ Ficus carica Linn.: A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and -55- Pharmacological Aspects”,International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research, 1(4), pp 215-232 [10] SHUKRANUL MAWA & IKRAM M SAID (2012), Chemical Constituents of Garcinia prainiana Sains Malaysiana, 41(5), pp 585– 590 [11] Natália Maria Noronha, Grazielle Esteves Ribeiro, Ingridy Simone Ribeiro, Marcos José Marques, Luiz Felipe Leomil Coelho, and Jorge Kleber Chavasco (2014), “Phytochemical profile and antioxidant and antimicrobial activities of hydroethanolic extracts of Ficus pumila”, African Journal of Microbiology Research, 8(28), pp 2665-2671 [12] Pham Thi Nhat Trinh, Nguyen Huu An, Pham Ngoc An, Mai Dinh Tri, Cao Van Du, Nguyen Thi Le Thuy, Nguyen Trong Tuan, Vang Thi Kim Thoa, Nguyen Ngoc Tuan & Le Tien Dung (2017), “A new benzofuran derivative from the leaves of Ficus pumila L.”, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1395427 [13] Virgilio D Ebajo Jr, Robert Brkljača, Sylvia Urban, Consolacion Y Ragasa (2015), “Chemical Constituents of Hoya buotii Kloppenb”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 5(11), pp 069-072 [14] https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/orgpage/nmr.htm [15] http://www.magritek.com/wp-content/uploads/2014/05/009-Propylbenzoate-DEPT-60-MHz.jpeg GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS Triệu Quý Hùng Hoàng Hương Ly ... tài ? ?Phân l? ??p xác định cấu trúc hợp chất triterpenoid từ Trâu cổ (Ficus pumila L. ) họ Dâu tằm (Moraceae) ” Mục tiêu đề tài - Phân l? ??p hợp chất triterpenoid từ phân đoạn dịch chiết nhexane Trâu cổ. .. ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG HƯƠNG LY PHÂN L? ??P VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ CÂY TRÂU C? ?(Ficus pumila L. ) HỌ DÂU TẰM (Moraceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC... International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research cho thấy nhóm nghiên cứu phân l? ??p xác định cấu trúc 50 hợp chất từ chi Ficus; cónhóm hợp chất terpenoid lupeol ( 1), guaiazulene