PHÂN lập VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS từ đất, KHẢO sát KHẢ NĂNG ức CHẾ sản SINH AFLATOXIN của các CHỦNG PHÂN lập đƣợc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM HỒNG THÁI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM HỒNG THÁI Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ ba, má người thân gia đình cho có ngày hôm Chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm mơn Cơng Nghệ Sinh Học tồn thể q thầy tận tình dạy bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường Chân thành biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô Ts Nguyễn Ngọc Hải Ts Lê Anh Phụng Cơ Nguyễn Thị Kim Loan tận tình bảo giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Chân thành cảm ơn toàn thể bạn bè động viên, chia giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT LUẬN VĂN Qua thời gian thực đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập đƣợc.” từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 Phịng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Ni-Thú Y, chúng tơi có kết luận sau: - Có thể phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất với tỷ lệ 8,16 % - Đánh giá sơ khả ức chế aflatoxin chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất môi truờng thạch nước cốt dừa: sau ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis Aspergillus flavus môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ánh đèn tia cực tím (UV) cho thấy số chủng có khả ức chế sinh trưởng sản sinh aflatoxin nấm mốc Aspergillus flavus - Khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất: môi trường bắp sau ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc bào tử vi khuẩn , ghi nhận số chủng có khả làm giảm aflatoxin mơi trường bắp so với mẫu đối chứng có bào tử Aspergillus flavus khơng có bào tử Bacillus subtilis - Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ảnh hưởng đến khả sản sinh aflatoxin môi trường bắp phối trộn tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn 1/103, 1/104 1/105 Sau ngày nuôi cấy cho thấy tỷ lệ bào tử vi khuẩn tăng lên tăng khả làm giảm aflatoxin - Nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin có xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis gây chết vịt nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin không xử lý với vi khuẩn iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY The thesis: “ Isolation of Bacillus subtilis in soil and survey their ability in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize.” The thesis Bacillus subtilis in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize and in protection of duck frome aflatoxin infection was carried out in Microbiology and Infections Diseases Department of Freulty of Animal sciences and Veterinary, Nong Lam University, Ho Chi Minh cty frome 03/2007 to 08/2007 The results showed: - Bacillus subtilis could inhibite the aflatoxin production of Aspergillus flavus on maize in times - Bacillus subtilis treatment could reduce the neortility rate, health affect of the ducks fed with 100 ppb aflatoxin containated maize v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1………………………………………………………………… … .i Trang bìa 2……………………………………………………………… …… ii LỜI CẢM TẠ………………………………………………………… .……… iii MỤC LỤC…………………………………………………………….…… … iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………… ix DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………… .… x DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………… .… xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ…………………………………………………… xii TÓM TẮT LUẬN VĂN….…………………………………………….…… .….xiii MỞ ĐẦU………………………………………………………………….… …1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ… ……………………………………………… … ……1 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI… .………………………………………… ……2 1.3 YÊU CẦU ĐỀ TÀI………… .……………………………… … ….…2 TỔNG QUAN………………………… ……………………… … .…3 2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS…… .…….3 2.1.1 Lịch sử phát hiện……………………………………………… 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.2.1 Đặc điểm phân loại…………………………… ….…………… ….3 2.1.2.2 Sự phân bố………………………………………………… …… 2.1.3 Đặc điểm hình thái………………….…………………………… …….4 2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy……………………………………………… … … vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.1.5 Đặc điểm sinh hóa……………………………………… …… 2.1.6 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên……………………… … … 2.1.7 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis………………………… …… 2.1.7.1 Cấu tạo bào tử………………………………………… … .… 2.1.7.2 Đặc điểm tác dụng bào tử……………………… …… .… 2.1.8 Tính chất đối kháng Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh .9 2.1.9 Những nghiên cứu tác dụng đố kháng Aspergillus Bacillus subtilis 11 2.2 KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN…… … 12 2.2.1 Khái niệm nấm mốc……………………………………… …… 12 2.2.2 Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin…………… .12 2.2.3 Độc tố aflatoxin………………………………… 13 2.2.3.1 Các loại độc tố aflatoxin……………………… 13 2.2.3.2 Cơ chế gây bệnh aflatoxin…………………… .14 2.2.3.3 Những tác hại aflatoxin gây ra…………………… .14 2.2.3.4 Các phƣơng pháp phân hủy aflatoxin……………………… ……… 15 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 19 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 19 3.1.1 Thời gian 19 3.1.2 Địa điểm 19 3.2 ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT 19 3.3 THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 19 3.4 MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 20 3.4.1 Môi trƣờng tự nhiên 20 3.4.2 Môi trƣờng tổng hợp .20 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.5 NỘI DUNG 20 3.6 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU .20 3.6.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất .20 3.6.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 20 3.6.1.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis .21 3.6.2 Khảo sát đặc điểm sinh học vi khuẩn phân lập đƣợc 21 3.6.2.1 Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi 21 3.6.2.2 Khảo sát phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập đƣợc………… 22 3.6.3 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả sinh aflatoxin chủng nấm mốc Aspergillus flavus đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 22 3.6.3.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin chủng nấm mốcAspergillusflavus 22 3.6.3.2 Thí nghiệm đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc……………………………… ………… …23 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả làm giảm aflatoxin sản sinh môi trƣờng bắp chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc…… … 23 3.6.4.1 Phƣơng pháp thu hoạch xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus……………………………………………………………… … 23 3.6.4.1.1 Phƣơng pháp thu hoạch bào tử nấm mốc Aspergillus flavus 23 3.6.4.1.2 Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus…………………………………………………………………… 24 3.6.4.2 Phƣơng pháp thu hoạch xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 24 3.6.4.2.1 Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩnBacillus subtilis…24 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.6.4.2.2 Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 25 3.6.4.3 Bố trí thí nghiệm 26 3.6.4.3.1 Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trƣớc tiến hành thí nghiệm……….26 3.6.4.3.2 Ni cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis bào tử nấm Aspergillus flavus môi trƣờng nguyên liệu bắp 26 3.6.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi khuẩn sản sinh aflatoxin 27 3.6.5.1 Phƣơng pháp thu hoạch xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus 28 3.6.5.2 Phƣơng pháp thu hoạch xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 28 3.6.5.3 Bố trí thí nghiệm 28 3.6.6 Thí nghiệm 4: Thử mức độ an toàn ngƣyên liệu bắp nhiễm aflatoxin sau xử lý vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả ức chế aflatoxin) vịt 29 3.7 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU……………………………………… 30 3.8 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………………… 31 4.1 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS……… 31 4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis…………… … 31 4.1.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis sau nhuộm Gram………………………………………………………………………….32 4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn nghi ngờ Bacillussubtilis 32 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỂM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC .35 4.2.1 Kiểm tra khả sinh khả sinh aflatoxin chủng nấm mốc Aspergillus flavus 35 4.2.2 Thí nghiệm đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc…………………………………………… … ……35 4.3 THÍ NGHIỆM : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIẢM AFLATOXIN SẢN SINH TRÊN MÔI TRƢỜNG BẮP CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC…………………………………… …………… 38 4.4 THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ BÀO TỬ NẤM MỐC/BÀO TỬ VI KHUẨN ĐỐI VỚI SỰ SẢN SINH AFLATOXIN…….40 4.5 THÍ NGHIỆM 4: THỬ MỨC ĐỘ AN TOÀN CỦA NGHUYÊN LIỆU BẮP ĐÃ NHIỄM AFLATOXIN SAU KHI XỬ LÝ BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS (CĨ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN) TRÊN VỊT NI 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………… ……….… 48 5.1 KẾT LUẬN…………………………………………………………… ……… 48 5.2 ĐỀ NGHỊ………………………………………………………………… …….48 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… ……49 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần Tiếng Việt Bùi Xuân Đồng, 2004 Nguyên lý phòng chống nấm mốc mycotoxin NXB khoa học kỹ thuật Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp, 2003 Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nơng nghiệp Kiều Hữu Cảnh, 1999 Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp NXB khoa học kỹ thuật Tơ Minh Châu, 2000 Giáo trình vi sinh vật ứng dụng chăn nuôi Tủ sách Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, 2002 Thức ăn dinh dưỡng động vật NXB nông nghiệp Nguyễn Huỳnh Nam, 2006 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis phân heo thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy heo Luận văn tốt nghiệp Khoa cơng nghệ sinh học Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm propiotic Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi-Thú Y Trường Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2001 Vi sinh vật học NXB giáo dục Dương Thanh Liêm, 2002 Giáo trình độc chất học.Tủ sách Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh 10 Trần Linh Phước, 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB giáo dục 11 Lê Anh Phụng, 2001 Bệnh nhiễm độc aflatoxin phương pháp phát aflatoxin Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 12 Nguyễn Duy Khánh, 2000 Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Luân văn kỹ sư chuyên ngành công nghệ sinh học 13 Nguyễn Khắc Tuấn, 1996 Vi sinh vật học NXB nông nghiệp 14 Trần Bắc Vi, 2005 Phân lặp Aspergillus flavus bánh dầu phộng bị mốc khảo sát khả sinh aflatoxin chủng phân lặp Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Ni Thú Y Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh 15 Lê Anh Phụng, 2001 Nấm mốc sinh độc tố ảnh hưởng độc tố nấm mốc động vật Hướng khắc phục độc tố nấm mốc Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo tiếng Anh 16 A CIEGLER, E B LILLEHOJ, R E PETERSON, AND H H HALL Microbial detoxification of aflatoxin May 1966 17 J W BENNETT and KLICH Mycotoxins CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Junly 2003 18 A M Fakhoury and C P Woloshuk Inhibition of Growth of Aspergillus flavus and Fungal a-Amylases by a Lectun-Like Protein from Lablab purpureus January 2001 Tài liệu tham khảo internet 19 http://www.upwardquest.com/crit1.html 20 http://www.premierhort.com 21 http://en.wikipedia.org/wiki/Sporulation LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC I CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 1.1 Phản ứng catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30 % Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis phết lên lam kính khơ Sau nhỏ giọt H202 30% lên vết phết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây Kết Phản ứng catalase dương tính: có tượng sủi bọt Phản ứng catalase âm tính: khơng có tượng sủi bọt 1.2 Phản ứng lecithinase Chuẩn bị Mơi trường lịng đỏ trứng Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn lên đĩa mơi trường lòng đỏ trứng, ủ đĩa 37 oC/24 Kết Phản ứng catalase dương tính: có vịng xung quanh khuẩn lạc Phản ứng catalase âm tính: khơng có vòng xung quanh khuẩn lạc 1.3 Phản ứng nitrate Chuẩn bị Môi trường nitrate Dung dịch thuốc thử giess A, giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tiến hành: dùng que cấy thẳng, thao tác vô trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm mơi trường nitrate, ủ 37 oC/24 Sau 24 nhỏ vào mơi trường 2-3 giọt giess A, sau nhỏ tiếp 2-3 giọt giess B Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu đỏ cam Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng 1.4 Phản ứng Metyl-Red (MR) Chuẩn bị Môi trường clark lubs Thuốc thử: metyl red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng, lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống mơi trường clark lubs, ủ 37 oC/24 Sau nhỏ 2-3 giọt thuốc thử metyl red, đọc kết Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu có màu đỏ cam Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng 1.5 Phản ứng Voges-Proskauer (VP) Chuẩn bị Môi trường clurk lubs Thuốc thử: NaOH 40 %; -naphtol 10 % Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng, lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống mơi trường clurk lubs, ủ 37 oC/24 Sau nhỏ 3-5 giọt NaOH 40 % 3-5 -naphtol 10 %, đọc kết sau 15 phút Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu đỏ Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.6 Phản ứng citrate Chuẩn bị Môi trường Simmon citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống môi trường citrate, ủ 37 oC/24 Kết Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển sang màu xanh dương Phản ứng âm tính: mơi trường có màu xanh mạ non 1.7 Phản ứng lên men đƣờng maltose Chuẩn bị Môi trường maltose Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vịng, lấy cấy mọt sinh khối vi khuẩn vào môi trường đường maltose, ủ 37 oC/24 Kết Phản ứng dương tính: mơi trường có màu vàng Phản ứng âm tính: mơi trường có màu đỏ II PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Các bƣớc tiến hành: - Chuẩn bị vết bơi: cho lên lame kính giọt nước cất vơ trùng, dùng que cấy vịng vơ trùng lấy vi khuẩn mọc mọc bề mặt mơi trường hịa vào giọt nước cất dàn - Cố định vết bơi: hơ lame kính cách đưa qua lại 3-4 lửa đèn cồn - Nhuộm tiêu bản: đặt giấy lọc lên vết bôi, nhỏ thuốc nhuộm crystal violet lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bôi, để 1-2 phút rửa nước Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi vừa nhuộm, để phút rửa nước Tẩy màu nhanh cồn 96o, khoảng 15-30 giây, rửa nước Đặt mảnh giấy lọc khác lên vết bôi nhỏ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bôi, để khoảng phút rửa nước Thấm khơ tiêu xem kính hiển vi III CÔNG THỨC ĐẾM KHUẨN LẠC TRÊN MÔI TRƢỜNG THẠCH ĐĨA - Số khuẩn lạc trung bình 1ml dịch mẫu độ pha loãng liên tiếp x1+x2+x3 Cơng thức: Y= Trong đó: Y: số khuẩn lạc trung bình độ pha lỗng x1,x2,x3: số khuẩn lạc trung bình có 1g mẫu hay 1ml dịch mẫu nồng độ pha loãng - Số khuẩn lạc 1ml dịch mẫu độ pha lỗng Cơng thức: X= A x x h V Trong đó: X: số khuẩn lạc có 1ml dịch mẫu A: số khuẩn lạc trung bình có đĩa (trong tổng số đĩa nồng độ pha loãng) h: độ pha loãng (10-5, 10-6, 10-7,….) V: thể tích dịch mẫu cấy đĩa IV CƠNG THỨC ĐẾM VI KHUẨN BẰNG BUỒNG ĐẾM Cơng thức: Avsv/ml = a x 4000 x 1000 x H Trong đó: a: số vsv trung bình có ô nhỏ = n ai: số vsv đếm ô nhỏ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com n: số ô nhỏ đếm H: hệ số pha loãng = Độ pha loãng 1000: hệ số chuyển thành ml (1 ml = 1000 mm3) 4000: hệ số chuyển thành mm3 = = Thể tích ô nhỏ 4000 mm3 V THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG 5.1 Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Agar 18 g Nước cất PH = 7,3 1000 ml 0,2 5.2 Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Nước cất PH = 7,3 1000ml 0,2 5.3 Môi trƣờng Clark Lubs Peptone bột 7g Glucose 5g KH2PO4 5g Nước cất 1000 ml PH = 6,7 - 7,1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5.4 Môi trƣờng lên men đƣờng maltose Cao thịt 5g Peptone bột 10 g Đường maltose 10 g Phenol red 0,01 g Nước cất 1000 ml PH = 6,7 - 7,1 5.5 Môi trƣờng Simmon Citrate Agar Sodium citrate 2g K2HPO4 1g MgSO4 0,2 g Brothymol blue 0,008 g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18 g Nước cất 1000ml PH = 6,9 0,2 5.6 Môi trƣờng khử nitrate Cao thịt 3g Peptone bột 5g NaNO3 1g Agar 7g Nước cất PH = 7,0 1000ml 0,2 5.7 Mơi trƣờng lịng đỏ trứng Cao thịt 1g LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Peptone bột 10 g Mannitol 10 g NaCl 10 g Phenol red 0,0025 g Agar 15 g Nước cất PH = 7,2 1000 ml 0,2 Phân 225 ml môi trường vào bình tam giác Khử trùng 121 oC / 15-20 phút Khi môi trường nguội đến 50 oC thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà Trộn phân vào đĩa petri vô trùng Cách pha lịng đỏ trứng: rửa trứng, sát trùng bên ngồi trứng cồn Dùng kẹt đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lịng đỏ vào becher có chứa 25-30 ml nước mối sinh lý vô trùng Bảo quản dung dịch oC để dùng 5.8 Môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa Nước cốt dừa 500 ml Nước cất 500 ml Cloramphenicol 0,1 g Agar 15 g Thành phần nƣớc cốt dừa (Nước cốt dừa đóng hộp sản xuất công ty CNCB thực phẩm quốc tế số 9, đường 5, phường Tân Tiến, Biên Hòa, Đồng Nai) Béo 15 g Carbohyrat 3g Protein 2g Sodium 33 g 5.9 Môi trƣờng thạch khoai tây Khoai tây 200 g Saccharose 20 g Cloramphenicol 1-2 g/l LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Agar Nước cất 18 g 1000 ml PH = 6,5 VI HÓA CHẤT 6.1 Nƣớc mối sinh lý 0,9 % NaCl Nước cất 9g 1000 ml 6.2 NaOH 40 % NaOH Nước cất 40 g 1000 ml Cân 40 g NaOH tinh thể hòa tan vào 50 ml nước cất, lắc đều, để yên 24 giờ, gạn lấy nước bổ xung thêm nước cất cho đủ 1000 ml 6.3 Dung dịch Iod 0,02 N Cân g KI hòa tan vaò ml nước cất, lắc cho tan, thêm nước cất vào cho đủ 100 ml VII THUỐC THỬ VÀ CHẤT CHỈ THỊ MÀU 7.1 Thuốc thử Methyl-red Methyl-red 0,1 g Ethanol 96o 300 ml Nước cất vừa đủ 500 ml 7.2 Thuốc thử a-naphtol 10% -naphtol Cồn 96o vừa đủ 10 g 100 ml 7.3 Thuốc thử xác định khả khử nitrate giess A: Axit sunfanilis 0,5 g Axit acetic 30 g Nước cất 100 ml giess B: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com -naphthylamin Axit acetic Nước cất 0,8 g 30 g 100 ml Hòa tan 0,8 g -naphthylamin 100 ml nước đun sôi để nguội bổ sung thêm 30 ml axit acetic, đem lọc Đựng chai màu, bảo quản tủ lạnh để sử dụng VIII THUỐC NHUỘM 8.1 Crystal violet (C25H30N3Cl.9H2O = 570,11) a) Crystal violet Cồn 96o b) Phenol Nước cất 0,4 g 10 ml 1g 100 ml Trộn hai dung dịch a b với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản dung dịch chai màu, tránh ánh sáng 8.2 Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 ml Hòa g KI vào ml nước cất, sau thêm g iod, chờ cho iod tan hết thêm nước vừa đủ 300 ml 8.3 Fuchsine kiềm loãng (C9H18N3Cl = 323,82) a) Fuchsine kiềm Cồn 96o b) Phenol Nước cất 0,3 g 10 ml l5g 35 ml Trộn dung dịch a b với khuấy cho tan đều, đem lọc, bảo quản chai màu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com IX SỐ LƢỢNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐẾM BẰNG PHƢƠNG PHÁP TRANG ĐĨA TRONG THÍ NGHIỆM Chủng phân lập Số lƣợng bào tử (CFU/ml) 22,94.108 71,32.108 14,38.108 52,64.108 50,79.108 7,02.108 89,30.108 31,80.108 X KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 10.1 Kết xử lý thống kê thí nghiệm ————— 21/08/2007 15:08:22 ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help One-way ANOVA: KQTN2 versus MTN2 Analysis of Variance for KQTN2 Source DF SS MS MTN2 560623644 70077956 Error 1206400 134044 Total 17 561830044 Level Asp N 2 2 2 2 Pooled StDev = Mean 4250 15800 5250 15000 4660 5410 18200 2750 6300 366 StDev 778 495 85 552 212 F 522,80 P 0,000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ (-*) (-*) (-*) (*) (*) (*) (*-) (-*) (-*) + -+ -+ -+ 5000 10000 15000 20000 Tukey's pairwise comparisons LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Family error rate = 0,0500 Individual error rate = 0,00331 Critical value = 5,60 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -13000 -10100 -2450 450 9100 12000 -12200 -9300 -650 2250 -11200 -8300 -1860 1040 9690 12590 -860 2040 8890 11790 -2610 290 8940 11840 -1610 1290 8140 11040 -2200 700 -15400 -12500 -3850 -950 -14400 -11500 -4650 -1750 -14990 -12090 -14240 -11340 50 2950 11600 14500 1050 3950 10800 13700 460 3360 1210 4110 -3500 -600 8050 10950 -2500 400 7250 10150 -3090 -190 -2340 560 Asp 14000 16900 Asp 10450 13350 -5000 -2100 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10.2 Kết xử lý thống kê thí nghiệm ————— 16/08/2007 13:42:06 ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help One-way ANOVA: KQTN3 versus MTN3 Analysis of Variance for KQTN3 Source DF SS MS MTN3 35435250 11811750 Error 15700 3925 Total 35450950 Level C8(10^7) C8(10^8) C8(10^9) DC(Asp) N 2 2 Mean 2155,0 1960,0 715,0 6300,0 Pooled StDev = StDev 77,8 84,9 49,5 0,0 62,6 F 3009,36 P 0,000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ *) (*) *) *) -+ -+ -+ 1600 3200 4800 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0,0500 Individual error rate = 0,0152 Critical value = 5,76 Intervals for (column level mean) - (row level mean) C8(10^7) C8(10^8) C8(10^8) -60,2 450,2 C8(10^9) 1184,8 1695,2 989,8 1500,2 -4400,2 -3889,8 -4595,2 -4084,8 DC(Asp) C8(10^9) -5840,2 -5329,8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10.3 Kết xử lý thống kê thí nghiệm ————— 01/09/2007 20:42:38 ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Chi-Square Test: SONG; CHET Expected counts are printed below observed counts SONG 10 5,50 CHET 4,50 Total 10 5,50 10 4,50 10 5,50 4,50 10 5,50 4,50 10 Total 22 18 40 Chi-Sq = 3,682 + 4,500 + 5,500 + 6,722 + 0,045 + 0,056 + 0,409 + 0,500 = 21,414 DF = 3, P-Value = 0,000 cells with expected counts less than 5,0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... đề tài: “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập đƣợc. ” 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập, tìm chủng Bacillus subtilis có khả ức chế afltoxin... liệu, thức ăn gia súc thành phẩm 1.3 YÊU CẦU ĐỀ TÀI - Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất - Khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng vi khuẩn phân lập - Khảo sát khả ức chế aflatoxin. .. CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƢỢC Giáo vi? ?n hƣớng dẫn: Sinh vi? ?n thực