Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ ruột cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS TỪ RUỘT CÁ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực MSSV: 1211100074 : HỒNG SẾCH HẾNH Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Hồng Sếch Hếnh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai tận tình hướng dẫn, bảo em suốt thời gian xây dựng đề cương, thực hoàn thành đồ án Em xin cám ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt suốt trình em thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Mơi trường tận tình bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập để vận dụng kiến thức tảng vào thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình chăm sóc, dạy dỗ làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em suốt năm qua trình thực đồ án Em xin cám ơn đến bạn thực đề tài phịng thí nghiệm quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp Cuối em xin cám ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến q Thầy Cơ Tp Hồ Chí Minh, 19 tháng năm 2016 Sinh viên thực Hồng Sếch Hếnh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .1 LỜI CẢM ƠN .2 MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 3 Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu .4 Ý nghĩa đề tài khoa học Các kết đạt đề tài Kết cấu đồ án tốt nghiệp .5 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 Đại cương Bacillus subtilis 1.1.Lịch sử phát 1.2.Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1.Đặc điểm phân loại 1.2.2.Phân bố 1.3.Đặc điểm hình thái [36] 1.4.Đặc điểm phân lập, nuôi cấy 1.4.1.Đặc điểm phân lập 1.4.2.Đặc điểm sinh hóa 1.5.Đặc điểm tế bào khả sinh bào tử 1.5.1.Đặc điểm tế bào 1.5.2.Cấu tạo bào tử 10 1.6.Tính đối kháng khả sinh bacteriocin 11 1.7.Ứng dụng Bacillus sản xuất đời sống [9] 11 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.8.Giới thiệu enzyme amylase protease tế bào 12 1.8.1.Enzyme amylase [12] 12 1.8.2.Enzyme protease 15 1.9.Một số enzyme cá 19 1.10.1.Thành phần cá, phụ phế phẩm cá 20 1.10.2.Tình hình đánh bắt, sản xuất Việt Nam 21 1.11.Phân bón có nguồn gốc từ cá 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.Thời gian địa điểm thực đề tài 24 2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: 24 2.1.2.Thời gian nghiên cứu 24 2.2.Vật liệu nghiên cứu: 24 2.2.3.Thiết bị dụng cụ 25 2.3.Bố trí thí nghiệm .26 2.3.1.Bố trí thí nghiệm chung 26 2.3.2.Bố trí thí nghiệm chi tiết 26 2.4.Phương pháp nghiên cứu .30 2.4.1.Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 30 2.4.2.Phương pháp tăng sinh 30 2.4.3.Phương pháp pha loãng mẫu 30 2.4.4.Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein [14] 31 2.4.5.Phương pháp định tính khả sinh protease chủng vi khuẩn phân lập 31 2.4.6.Kiểm tra độ khiết giống : 32 2.4.8.Phương pháp cấy chuyền [38] 32 2.4.9.Phương pháp bảo quản lạnh sâu : 32 2.4.10.Các phương pháp xác định đặc điểm hình thái 33 2.4.11.Các thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ Bacillus subtilis 34 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.12.Phương pháp đục lỗ thạch 37 2.4.13.Phương pháp nghiên cứu khả phân giải tinh bột, protein 38 2.4.14.Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1.Kết phân lập lựa chọn chủng có khả Bacillus subtilis 39 3.2.Kết thử nghiệm sinh hóa 42 3.2.1.Kết test catalase 42 3.2.2.Nhuộm gram 42 3.2.3.Nhuộm bào tử 44 3.2.4.Kết thử nghiệm Citrate 45 3.2.5.Kết thử nghiệm Nitrate 46 3.2.6.Thử nghiệm MR - VP 47 3.2.7.Thử nghiệm indole 49 3.2.8.Thử nghiệm di động 50 3.2.9.Thử nghiệm lên men Carbohydrate 51 3.2.10.Khảo sát khả sinh enzyme protease amylase ngoại bào chủng vi khuẩn đề tài phân lập 52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 4.1.Kết luận 58 4.2.Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Kết định danh Bacillus subtiblis Bảng Phân loại protease theo Barret, 1984 18 Bảng Thành phần khối lượng cá tra số loài cá khác 22 Bảng Đặc điểm hình thái cụ thể chủng vi khuẩn đồ án phân lập .39 Bảng Kết định tính enzyme ngoại bào amylase protease chủng vi khuẩn phân lập 53 Bảng 3 Kết định danh sơ test sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá 55 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1 Tế bào Bacillus subtilis .6 Hình Sản lượng khai thác ni trồng thủy sản Việt Nam từ 1995 - 2015 22 Hình Sơ đồ bố trí bước thí nghiệm 26 Hình 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis có ruột cá .27 Hình Quy trình dịnh danh sơ chủng phân lập 29 Hình Kết thử nghiệm catalase .42 Hình Hình thái tế bào chủng vi khuẩn phân lập nhuộm Gram 44 Hình 3 Kết nhuộm soi bào tử chủng phân lập 45 Hình 4.Thử nghiệm Citrate chủng phân lập 46 Hình 3.5 Kết khảo sát khả khử nitrate chủng vi khuẩn phân lập .47 Hình Hình ảnh test Methyl red chủng phân lập 48 Hình 3.7 Kết phản ứng VP chủng vi khuẩn phân lập 49 Hình Phản ứng test indol chủng phân lập 50 Hình Khả di động chủng phân lập 51 Hình 10 Hình ảnh đặc trưng mơi trường khảo sát khả lên men đường .52 Hình 11 Khảo sát định tính protease Casein agar với thuốc thử TCA 10 % 54 Hình 12 Kết test định tính enzyme amylase chủng vi khuẩn phân lập 55 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NA Nutrient agar NB Nutient broth MR Methyl red VP Voges Progkauer FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations TCA Trichloroacetic acid vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngành chế biến thủy sản nước ta sản lượng ngày tăng, mang lại nguồn lợi lớn cho quốc gia, song bên cạnh đó, việc chế biến thủy sản khơng sử dụng hết tồn phần chúng mà để lại nguồn phụ phế phẩm lớn, khơng xử lý lãng phí gây nhiễm mơi trường q trình phân giải protein, lipid…theo Trần Duy 2014, tồn cầu có khoảng 70 triệu thủy sản chế biến dạng phi lê, đơng lạnh, đóng hộp ngâm tẩm Trong năm 2011, sản lượng cá ngừ toàn cầu đạt 4,6 triệu tấn, nhiên sản phẩm cá ngừ đóng hộp có gần triệu [32], điều có nghĩa lượng phụ phẩm cá ngừ thải từ công nghiệp chế biến cá ngừ lên đến triệu Việc đánh bắt, chế biến thủy sản xuất kèm theo lượng phụ phế phẩm lớn, theo thống kê Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) lượng phụ phế phẩm bao gồm: đầu, xương, da, vây, vẩy, thịt vụn nội tạng cá thải trình chế biến đồ hộp chiếm từ 30 – 65 %, sản xuất cá phi lê, cá khô, cá muối, cá xơng khói lượng phụ phế phẩm thải chiếm từ 50 – 75 % Sản xuất chế biến cá lấy phi lê, dùng đóng hộp thường lấy phần cơ, phụ phế phẩm sản xuất cá ngừ đóng hộp chiếm khoảng 65 % lượng nguyên liệu ban đầu, ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50 % tổng nguyên liệu ban đầu, cá basa phụ phế phẩm chế biến cá phi lê gồm đầu, xương, mỡ, da, nội tạng, thịt vụn… chúng chiếm khoảng 65 – 70 % lượng nguyên liệu ban đầu [19] Phụ phế phẩm sản xuất chế biến thủy sản cá có thành phần chất hữu giàu Nitơ, sử dụng khơng mục đích xử lý không tốt chúng dễ bị phân hủy thành chất gây nhiễm khơng khí (các protein bị vi sinh vật phân giải hình thành H2S, NH3…) nhiều chất khác gây ô nhiễm nguồn đất, nguồn nước, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống, sức khỏe người mơi trường, cần có giải pháp khắc phục vần đề Tìm chủng vi sinh vật có khả phân giải protein giải pháp hữu hiệu, an toàn, tận dụng hiệu nguồn phụ phế phẩm từ ngành cơng nghiệp chế biến thủy sản nói chung chế biến cá nói riêng, từ có cách tận dụng hiệu Trong ruột cá có diện vi khuẩn có khả sinh enzyme protease phân giải tốt protein cá, đặc biệt chủng Bacillus [19] Nhiều chủng Bacillus ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: công nghiệp thực phẩm, sản xuất enzyme, probiotic… Và sản xuất phân bón vi sinh phân giải lân, silicat, ức chế vi sinh vật gây bệnh, phân giải cellulose… (Lê Thị Hồng Nhung, 2015) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phản ứng test indol chủng phân lập 3.2.8 Thử nghiệm di động Các chủng vi khuẩn khảo sát có khả di động thực nghiệm cấy môi trường thạch mềm NA 0,5 % cấy đâm sâu có vi khuẩn mọc lan đường cấy làm đục môi trường Các đường cấy mọc xoắn quanh trục cấy điều khẳng định chủng phân lập có khả di động 50 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Khả di động chủng phân lập 3.2.9 Thử nghiệm lên men Carbohydrate Kết thử nghiệm lên men Carbohydrate chủng vi khuẩn có khả phát triển làm đục mơi trường thạch nghiêng có chất tương ứng, chúng làm mơi trường kiềm hóa phía mặt nghiêng làm cho thị Phenol red chuyển môi trường sang màu đỏ phần môi trường đục chuyển từ vàng cam sang màu vàng, riêng lên men Lactose mơi trường phía thạch sâu vi khuẩn khơng phát triển Những thử nghiệm đóng góp nhiều vào q trình khẳng định Bacillus subtilis Hình đặc trưng cho loại khác 51 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 10 Hình ảnh đặc trưng môi trường khảo sát khả lên men đường 3.2.10.Khảo sát khả sinh enzyme protease amylase ngoại bào chủng vi khuẩn đề tài phân lập Các chủng vi khuẩn phân lập ruột cá nên nghi ngờ chúng có khả tiết enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa cho vật chủ (cá) tiêu hóa thức ăn có thành phần protein, tinh bột, cellulose… nhiên hạn hẹp thời gian 52 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nên đề tài nghiên cứu khả sinh enzyme protease amylase ngoại bào chủng vi khuẩn phân lập Do nghiên cứu đề tài khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào protease amylase chủng vi khuẩn phân lập môi trường Starch agar % Casein agar % Bảng Kết định tính enzyme ngoại bào amylase protease chủng vi khuẩn phân lập Chủng vi khuẩn Amylase protease BDH1 + + BDH2 + + BDH3 + + BDH4 + + BDH5 + + BDH6 + + BDH7 + + BDH8 + + 3.2.10.1 Thử nghiệm protease Các chủng vi khuẩn phân lập được đem thử nghiệm hoạt tính protease với chất Casein sử dụng thuốc thử TCA 10 % để rõ vòng phân giải đĩa thạch Kết thử nghiệm cho thấy chủng phân giải protease với đường kính vòng phân giải lớn chứng minh chủng vi khuẩn có khả tiết protease mạnh Điều giải thích sau: chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá ăn nhiều thức ăn protein nên chúng có hệ enzyme protease phong phú, hoạt tính mạnh Hình ảnh test thử nghiệm kiểm tra định tính khả sinh enzyme protease: 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 11 Khảo sát định tính protease Casein agar với thuốc thử TCA 10 % Tất chủng phân lập có khả tiết enzyme protease ngoại bào mạnh đường kính vòng phân giải lớn chủng BDH3 với đường kính 14 mm đường kính vịng phân giải nhỏ chủng BDH2 với đường kính vịng phân giải mm Kết vòng phân giải protein chủng cao hẳn so với kết vòng phân giải amylase chúng chủng sống đường ruột cá ăn nhiều thịt nên hệ enzyme protease chúng mạnh Vì chủng vi khuẩn tiết mạnh protease nên đề tài chọn chủng để khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme protease 3.2.10.2 Thử nghiệm Amylase Sử dụng thuốc nhuộm Lugol cho chất tinh bột, khuẩn lạc vi khuẩn phân lập phân giải chất tinh bột đường kính vịng phân giải lại yếu Các chủng có sinh enzyme tạo vịng phân giải suốt xung quanh điểm cấy 54 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BDH6 BDH8 BDH10 Hình 12 Kết test định tính enzyme amylase chủng vi khuẩn phân lập Các chủng phân lập có khả sinh enzyme amylase gần nhiên lại có đường kính vịng phân giải khơng lớn, đường kính vịng phân giải từ - mm Nguyên nhân chủng vi khuẩn có khả sinh amylase mà vịng phân giải lại yếu chúng phân lập từ nguồn ruột cá, mà lồi cá lại có thức ăn chủ yếu tinh bột (cá ngừ, cá nục, cá diêu hồng) Sau thực loạt test thử nghiệm sinh hóa, kết định danh sơ chủng nghi ngờ Bacillus subtilis có kết bảng sau: Bảng 3 Kết định danh sơ test sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá 55 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chủng Thử nghiệm BDH BDH BDH BDH BDH BDH BDH BDH Nhuộm Gram + + + + + + + + Nhuộm Bào tử + + + + + + + + Di động + + + + + + + + Indole - - - - - - - - Simmon citrate + + + + + + + + Nitrate + + + + + + + + VP + + + + + + + + MR + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + Thủy phân + Casein + + + + + + + Thủy phân + + + + + + + + Lên men + glucose + + + + + + + Lên men + mannitol + + + + + + + Lên men + maltose + + + + + + + Lên men lactose - - - - - - - Lên men + Cylose + + + + + + + Tinh bột Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kết khảo sát cho thấy chủng vi khuẩn Gram dương, có khả sinh bào tử, thử nghiệm Catalase dương tính, có khả phân giải Casein tinh bột Vi khuẩn có khả tiết enzyme amylase, protease để thủy phân chất môi trường thành amino acid phân tử nhỏ tế bào sử dụng cho q trình trao đổi chất để sinh trưởng phát triển Theo nghiên cứu Holt (1994) (trích Lý Kim Hữu, 2005) Bacillus subtilis vi khuẩn gram dương, có khả sinh bào tử, có thử nghiệm Catalase, Amylase, protease, MR - VP, Nitrate, Citrate dương tính, indol âm tính, có khả lên men loại đường Glucose, Sucrose, Maltose, Mannitol Trên sở kết dịnh danh sơ cho thấy chủng phân lập có khả Bacillus subtilis [14] 57 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài phân lập Bacillus subtilis ruột cá đạt số kết sau: Từ mẫu ruột cá thu thập từ chợ phân lập chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái, sinh hóa Bacillus subtilis Từ chủng phân lập chủng có khả phân giải protein tốt 4.2 Đề nghị Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp nên đề tài dừng lại việc phân lập khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân giải protein chủng Một số hướng nghiên cứu tiếp cho đề tài hồn thiện thêm là: Nghiên cứu yếu tố mơi trường ảnh hưởng đến tăng trưởng thu enzyme chủng Nghiên cứu phối hợp chủng với với chủng khác nhằm thủy phân phụ phế phẩm giàu protein Tiếp tục phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn có khả phân giải protein mạnh ruột cá 58 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1].Nguyễn Thị Bảo Khánh, Huỳnh Thị Bích Hạnh, Nguyễn Thị Kim Hương, Phan Thị Bich Nga, Lâm Nguyễn Duy Anh, Phạm Huyền Ngân, Lê Thị Kiều, 2014 Báo cáo nghiên cứu phát triển sản phẩm tận dụng phụ phế phẩm cá tra - basa [2].Đỗ Thị Thanh Hương Trương Thị Mộng Thu, Giá trị dinh dưỡng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) khai thác sản phẩm giá trị gia tăng Bộ môn Dinh dưỡng Chế biến Thủy sản Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ [3].Phạm Thị Hải Âu, 2011 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme để sản xuất sản phẩm protein thủy phân từ cá tạp phế liệu nhà máy chế biến cá [4].Lê Văn Hưng, 2003 Phát triển Nông nghiệp hữu giới hướng phát triển Việt Nam Hội thảo “Thông tin quản lý vườn ăn theo hướng hữu cơ” [5].Nguyễn Văn Bộ, 2000 Nông nghiệp hữu Việt Nam - thách thức hội Báo cáo hội thảo “Hướng tới hội mở rộng xuất sản phẩm Nông nghiệp hữu Việt Nam” [6].Lê Quốc Phong, Phạm Anh Cường, Mai Văn Quyền, 2014 Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất phân hữu [7].Huy Thông, 2015 Hiệu sử dụng đất nơng nghiệp Việt Nam cịn thấp [8].Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic LVTN, khoa chăn nuôi thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM [9].Bùi Thị Phi, 2007 Phân lập, khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu khả sinh enzyme vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học [10].Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm [11].Giáo trình vi sinh đại cương BSTY Nguyễn Xuân Hòa - PGS TS Phạm Hồng Sơn Trường Đại Học Nông Lâm Huế - Khoa Chăn Nuôi –Thú Y - Bộ môn Ký sinh – Truyền nhiễm [12].Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn, 2009 Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [13].Nguyễn Hồi Hương Cơng nghệ enzyme Giáo trình giảng dạy [14].Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015 Phân lập số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả phân hủy protein nước thải chế biến thủy sản [15].Phạm Minh Nhựt Các phương pháp phân tích vi sinh vật Giáo trình giảng dạy [16] Phạm Minh Nhựt Thực hành vi sinh đại cương Giáo trình giảng dạy [17].Thời thị Bích Nga, 2011 Phương pháp bảo quản chế biến cá [18].Giá trị dinh dưỡng cá tra (pangasianodon hypophthalmus) khai thác sản phẩm giá trị gia tăng Đỗ Thanh Hương Trương Thị Mộng Thu Bộ môn dinh dưỡng chế biến thủy sản khoa thủy sản đại học Cần thơ [19].Nguyễn Thị Hồng Đậm, 2015 Nghiên cứu sử dụng enzyme protease thương mại việc sản xuất nước mắm cá đù Tài liệu tiếng anh [20].Rahul Krishnan, 2014 Probiotic potential of Bacillus species isolated from freshwater fish Anabas testudineus in Labeo rohita [21].Cohn, ferdinand (1872) Uber Untersuchungen Bacterien Beitrage zur Biologie der PFLANZEN.1.pp.127-224 [22].Nakano, Michiko M ; Zuber, Peter (1998) "Anaerobic Growth of A "Strict Aerobe" (Bacillus Subtilis)" Annual Review of Microbiology 52(1) 165-90 doi 10,1146 / annurev Micro.52.1.165.PMID 9.891.797 [23] Odisha, India Mrunmaya kumar panda, 2013 Isolation and characterization of a thermophilic Bacillus sp with protease activity isolated from hot spring of Tarabalo [24].Isolation and identification of Bacillus subtilis as probiotic from intestinal microflora of common carp Cyprinus carpio L 2012 [25].Eric Weinert, Jr.1, Sherri A Miller1, David M Ikeda1, Kim C S Chang1, Joseph M McGinn1, and Michael W DuPonte2, 2014 Natural Farming: Fish Amino Acid [26].P ESAKKIRAJ, G Immanuel, S.M Sowmya, P lyapparaj, A.Palavesam, 2009 Evaluation of Protease-producing Ability of Fish Gut Isolate Bacillus cereus for Aqua Feed Tài liệu internet 60 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [27].https://websrv1.ctu.edu.vn/coursewares/thuysan/dinhduongthucanthuysan/ddvathucan/CHUONG1.htm [28].http://www.mard.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=42956 [29] http://www.mard.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=44797 [30] http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-tan-dung-phe-lieu-tu-ca-37945/ [31] http://vasep.com.vn/1192/OneContent/tong-quan-nganh.htm [32].https://voer.edu.vn/m/thanh-phan-hoa-hoc-va-tinh-chat-cua-dong-vat-thuysan/b9fbb727 [33] http://tomvang.com/tin-tuc/tan-dung-phu-pham-tu-che-bien-thuy-san/ [34].http://tailieu.vn/doc/bao-cao-nghien-cuu-ung-dung-enzyme-protease-tu-vikhuan-bacillus-subtilis-de-thuy-phan-phu-pham 1494062.html [35].http://doan.edu.vn/do-an/luan-van-nghien-cuu-thu-nhan-enzyme-tu-phe-lieuca-24959/ [36] http://web.mst.edu/~microbio/BIO221_2009/B_subtilis.html [37] https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis [38].http://luanvan.co/luan-van/de-tai-xac-dinh-moi-truong-toi-uu-de-thu-sinh-khoiva-enzyme-cua-vi-khuan-bacillus-subtilis-lactobacillus-acidophilus-27984/ [39] https://en.wikipedia.org/wiki/Glycerol [40]http://www.iasj.net/iasj?func=fulltext&aId=66521 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG THỬ NGHIỆM SINH HĨA TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A1 Thành phần mơi trường NB tăng sinh Pepton/trypton 7,5 g/l Meat extract 3g/l Yeast extract 5g/l NaCl 5g/l Succrose 5g/l Nước cất 1000 ml A2 Thành phần môi trường NA Pepton 7,5 g/l Meat extract 3g/l Yeast extract 5g/l NaCl 5g/l Sucrose 5g/l Agar 20g/l Nước cất 1000 ml A3 Môi trường lên men carbohydrate Pepton 7,5 g/l Meat extract 3g/l Yeast extract 5g/l NaCl 5g/l Carbohydrate 10g/l Methyl red 0.002g/l Agar 20g/l ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nước cất 1000 ml A4 Môi trường thử nghiệm hoạt tính protease Casein 10g/l Agar 20g/l Nước cất 1000 ml A5 Môi trường thử nghiệm hoạt tính Amylase Starch 10g/l Agar 20g/l Nước cất 1000 ml PHỤ LỤC B : BẢNG KẾT QUẢ VÒNG PHÂN GIẢI CASEIN pH tên chủng Lần lặp Lần lặp Lần lặp Giá trị Trung bình pH4 BDH1 17,00 12,00 15,00 14,67 pH4 BDH2 18,00 19,00 18,00 18,33 pH4 BDH3 12,00 13,00 13,50 12,83 pH4 BDH4 20,00 19,00 19,00 19,33 pH4 BDH5 18,00 15,00 18,00 17,00 pH4 BDH6 14,00 13,50 16,50 14,67 pH4 BDH7 17,00 18,00 17,00 17,33 pH4 BDH8 15,00 15,00 14,50 14,83 pH5 BDH1 18,00 17,00 19,00 18,00 pH5 BDH2 18,00 16,00 19,00 17,67 pH5 BDH3 13,00 11,00 13,50 12,50 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP pH5 BDH4 15,00 16,00 16,50 15,83 pH5 BDH5 17,00 18,00 15,00 16,67 pH5 BDH6 12,00 14,00 15,00 13,67 pH5 BDH7 19,00 19,00 16,00 18,00 pH5 BDH8 13,00 14,50 13,00 13,50 pH6 BDH1 17,00 20,00 19,00 18,67 pH6 BDH2 17,00 16,00 15,00 16,00 pH6 BDH3 15,00 14,00 17,00 15,33 pH6 BDH4 16,00 16,00 18,00 16,67 pH6 BDH5 19,00 19,00 17,50 18,50 pH6 pH6 pH6 pH7 pH7 pH7 pH7 pH7 pH7 pH7 pH7 pH8 pH8 pH8 pH8 pH8 pH8 pH8 pH8 BDH6 BDH7 BDH8 BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BDH6 BDH7 BDH8 BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BDH6 BDH7 BDH8 12,00 16,00 14,00 16,00 17,00 19,00 19,00 16,00 13,00 17,00 17,00 16,00 16,00 24,00 22,00 17,00 15,50 14,50 16,00 16,00 18,00 18,00 16,00 16,50 18,50 20,00 15,50 14,00 16,00 15,00 18,00 19,00 21,50 25,00 18,00 16,00 14,00 17,00 12,00 16,00 11,00 13,00 16,00 16,00 18,00 16,00 13,00 17,00 15,50 17,00 17,00 21,00 22,00 15,00 16,00 14,50 20,00 13,33 16,67 14,33 15,00 16,50 17,83 19,00 15,83 13,33 16,67 15,83 17,00 17,33 22,17 23,00 16,67 15,83 14,33 17,67 ... tiết Phân lập định danh sơ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Các bước tăng sinh phân lập Bacillus subtilis trình bày hình 26 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mẫu ruột cá Rửa... phân lập Bacillus subtilis từ ruột cá Jamal K.H Al Faragi Sundus A.A Alsaphar, 2012 hay Rahul Krishnan phân lập từ cá nước ngọt, 2014 Mục đích nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. .. tạo sản phẩm phân bón tận dụng phụ phế phẩm từ cá bảo vệ môi trường Các kết đạt đề tài - Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme protease phân giải protein từ cá, từ kết phân lập sau định