Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá

Đồ án tốt nghiệp _ LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu riêng tơi với hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hai khoa CNSH-TP-MT trường Đại học Cơng Nghệ thành phố Hồ Chí Minh Mọi số liệu hình ảnh đồ án số liệu hình ảnh riêng tơi, khơng chép hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án tơi Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Phan Thị Gìn Đồ án tốt nghiệp _ LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai, người tận tình giúp đỡ, bảo em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành hỗ trợ trình em làm đồ án phịng thí nghiệm trường Đại học Cơng Nghệ Tp HCM Đồng thời em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm - Môi Trường trường đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Mnh truyền tải kiến thức cho em trình học tập trường để em có kiến thức để hồn thành đồ án tốt nghiệp minh Kiến thức khơng giúp em hồn thành đồ án tốt nghiệp mà cịn tảng hữu ích cho cơng việc em sau Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đinh em, người chỗ dựa tinh thần quý báo em giúp em vượt qua khó khăn cơng việc hoc hành sống Em xin gửi lời cám ơn đến bạn phịng thí nghiệm giúp đỡ, hỗ trợ em trình thực đồ án tốt nghiệp Và cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn đến Hộ đồng phản biện giành thời gian theo đọc nhận xét đồ án tốt nghiệp em Em xin kính chúc quý Thầy Cơ nhiều sức khỏe Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm2016 Sinh Viên thực Phan Thị Gìn Đồ án tốt nghiệp _ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Đặt vấn đề 2.Nội dung nghiên cứu 3.Mục đích nghiên cứu 4.Phương pháp nghiên cứu 5.Đối tượng phạm vi nghiên cứu 6.Ý nghĩa đề tài 7.Các kết đề tài 8.Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic Đặc điểm hình thái Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon 1.1.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ 1.1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng vitamin 1.1.2.4 Nhu cầu muối khoáng 1.2 Đặc điểm phân loại vi khuẩn lactic 1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình trao đổi chất vi khuẩn Lactic 10 Ảnh hưởng oxy 10 Ảnh hưởng nhiệt độ 11 Ảnh hưởng pH 12 Ảnh hưởng nồng độ NaCl 13 Ảnh hưởng nồng độ glucose 13 1.4 Lên men lactic vi khuẩn lactic 13 1.5 Sự phân bố vi khuẩn lactic tự nhiên 14 1.6 Môt số ứng dụng vi khuẩn lactic 14 i Đồ án tốt nghiệp _ Trong công nghiệp thực phẩm 14 Trong công nghiệp 15 Trong nông nghiệp môi trường 16 Trong chăn nuôi 16 1.7 Tình hình nghiên cứu giới 16 1.8 Tình hình nghiên cứu nước 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 Nguồn vật liệu nghiên cứu 20 Thời gian nghiên cứu: 20 Chủng vi khuẩn đối chứng 20 Dụng cụ thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 Phương pháp thu mẫu 21 Phương pháp phân lập mẫu 21 Phương pháp làm 21 Thử nghiệm sinh hóa 22 2.2.4.1 Thử nghiệm khả tiết enzyme catalse 22 2.2.4.2 Phương pháp nhuộm Gram 23 2.2.4.3 Phương pháp nhuộm bào tử 24 2.2.4.4 Phương pháp thử khả phân giải CaCO3 25 2.2.4.5 Phương pháp thử khả di động 25 2.2.4.6 Khảo sát khả lên men loại đường khác 26 2.2.4.7 Thử nghiệm idole 27 2.2.4.8 Thử nghiệm methyl red 28 2.2.4.9 Thử nghiệm voges proskauer 29 2.2.4.10 Thử nghiệm Simmon citrate 29 2.3 Sơ đồ quy trình phân lập mẫu 31 ii Đồ án tốt nghiệp _ 2.4 Khảo sát khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá 31 Khảo sát khả kháng khuẩn 31 Phương pháp nghiên cứu tính kháng lồi vi khuẩn lactic với chủng Bacillus phân lập từ ruột cá 32 Khảo sát khả sinh acid lactic mối liên hệ với mật độ tế bào 33 Khảo sát ảnh hưởng độ mặn đến tốc độ tăng trưởng tế bào 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn nghi ngờ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá 35 Hình thái khuẩn lạc 35 Kết nhuộm Gram 35 Kết nhuộm bào tử 35 Kết test sinh hóa 38 3.1.4.1 Kết thử catalase 38 3.1.4.2 Kết thử indole 39 3.1.4.3 Kết thử nghiệm Methyl Red 40 3.1.4.4 Kêt thử nghiệm Voges Proskauer (VP) 41 3.1.4.5 Kết thử nghiệmsimmon citrate 41 3.1.4.6 Kết khả di động 42 3.1.4.7 Kết lên men cacbohydrate 43 3.1.4.8 Kết lên men Glucose 43 3.1.4.9 Kết lên men Lactose 44 3.1.4.10 Lên men Sucrose 45 3.1.4.11 Lên men Arabinose 45 3.1.4.12 Kết khả phân giải CaCO3 46 3.2 Mối liên hệ mật độ tế bào khả sinh acid tổng 49 3.3 Khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic phân lập 50 kháng E.coli 50 Kết đối kháng với Salmonella 52 iii Đồ án tốt nghiệp _ 3.4 Kết khả đối kháng với vi khuẩn Staphylococcus 53 3.5 Kết khả đối kháng chủng Bacillus 55 3.6 Kết ảnh hưởng độ mặn đến tốc độ tăng trưởng tế bào vi khuẩn latic 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG THỬ SINH HĨA TRONG CÁC THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC B: ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP ĐƯỢC PHỤ LỤC C KẾT QUẢ MẬT ĐỘ TẾ BÀO TRONG CÁC ĐỘ MẶN KHÁC NHAU PHỤ LỤC D KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ PHỤ LỤC E: HÌNH ẢNH 21 iv Đồ án tốt nghiệp _ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho giống vi khuẩn lactic 11 Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp vi khuẩn lactic 12 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic nghi ngờ vi khuẩn lactic 36 Bảng 3.2 Đặc điểm vi khuẩn nghi ngờ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá 37 Bảng 3.3: khả phân giải CaCO3 môi trường MRS 46 Bảng 3.4 Kết test sinh hóa loại vi khuẩn lactic 47 Bảng 3.5 Hàm lượng acid tổng có vi khuẩn phân lập từ ruột cá 49 Bảng 3.6 Bảng kết đối kháng E.coli 51 Bảng 3.7 Kết đối kháng Salmonella 52 Bảng 3.8: Kết đối kháng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá với vi khuẩn Staphylococcus 54 Bảng 3.9: Kết đối kháng chủng vi khuẩn lactic vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột cá……………………………………………………………………………….54 v Đồ án tốt nghiệp _ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn lactic 31 Hình 3.1 Kết thử catalase chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá 39 Hình 3.2 kết thử nghiệm indole 40 Hình 3.4 kết thử nghiệm VP 41 Hình 3.5 Kết qua thử nghiệm simon citrate 42 Hình 3.6 Kết thử khả di động 43 Hình 3.7 Kết thử nghiệm lên men Glucose 44 Hình 3.8 Kết thử nghiệm lên men Lactose 44 Hình 3.9 Kết thử nghiệm lên men Sucrose 45 Hình 3.10 Kết thử nghiệm lên men Arabinose 44 Hình 3.11 Biểu đồ thể mối quan hệ hàm lượng % tổng OD hiệu chỉnh 48 Hình 3.12 Kết hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn E coli 51 Hình 3.13 Kết hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Salmonella 53 Hình 3.14 Kết hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus 54 Hình 3.15 Biểu đồ ảnh hưởng độ mặn đến tốc độ tăng trưởng vi sinh vật 58 vi Đồ án tốt nghiệp _ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU: Colony forming unit FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth OD: Optical Density VP – MR: Voges – Proskauer – Methyl Red VASEP: Hiệp hội Chế biến xuất Thuỷ sản Việt Nam (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers) vii Đồ án tốt nghiệp _ MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Vi khuẩn lactic vi khuẩn sử dụng nhiều quy mơ cơng nghiệp Chúng có khả sinh acid lactic sản phẩm phụ khác (Wood Holzapfel, 1995) Sản phẩm vi khuẩn lactic ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, môi trường nông nghiệp Nghiên cứu Galindo (2004) cho thấy loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus phân lập từ dày – ruột số lồi cá có khả ức chế mạnh số loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến cá số loài vi khuẩn gây bệnh khác (Schillinger Lucke, 1989; Lewus et al., 1991; Karthikeyan Santosh, 2009) Vì vậy, vi khuẩn lactic sử dụng rộng rãi sản xuất probiotic sử dụng nuôi trồng thuỷ sản Các nghiên cứu gần cho thấy, vi khuẩn lactic lại có tác dụng hổ trợ tốt việc sản xuất phân bón giàu đạm từ cá, Patrix ctv (2013) khuyến cáo sử dụng lactobacillus recipe lactobacillus recipe để sản xuất phân bón dạng lỏng từ cá Phân bón dạng lỏng từ cá cho biết có hiệu tốt kích thích tăng trưởng trồng (Murray and Anderson 2004) Việt Nam có hệ thống sơng ngịi dày đặc có đường bờ biển dài 3260km, với địa thuận lợi cho việc đánh bắt nuôi trồng thủy hải sản Hiện nghề đánh bắt ni trồng thủy hải sản nước ta phát triển mạnh Theo công bố FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy hải sản đạt 1,67 triệu tấn, xếp thứ Châu Á Ngày ý thức người dân sức khỏe nâng lên, người tiêu dùng chuyển sang dùng cá thay thịt cho bữa ăn ngày, cá có chứa acid béo khơng no, tốt cho sức khỏe mà lượng cá tiêu thụ lớn Đồ án tốt nghiệp _ LB1 BDH7 LB1 BDH4 LB3 BDH4 22 Đồ án tốt nghiệp _ LB1 BDH6 LB2 BDH8 LB3 BDH8 23 Đồ án tốt nghiệp _ LB4 BDH8 LB4 BDH7 LB4 BDH3 24 Đồ án tốt nghiệp _ E.2 KẾT QUẢ VỀ KHẢ NĂNG SỐNG HÒA HỢP Ủ VI KHUẨN LACTIC VÀ VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ RUỘT CÁ Ten Tên chủng g vi vi khuẩ khuẩn n Bacillu lactic s LB3 BDH2 LB3 BDH1 Mặt Mặt 25 Đồ án tốt nghiệp _ LB3 BDH5 LB4 BDH1 LB2 BDH7 26 Đồ án tốt nghiệp _ LB3 BDH7 LB2 BDH5 LB2 BDH6 27 Đồ án tốt nghiệp _ LB3 BDH6 LB2 BDH2 LB4 BDH4 28 Đồ án tốt nghiệp _ LB1 BDH1 LB2 BDH1 LB2 BDH4 29 Đồ án tốt nghiệp _ LB4 BDH2 LB3 BDH3 LB1 BDH3 30 Đồ án tốt nghiệp _ LB1 BDH5 LB1 BDH2 LB4 BDH1 31 Đồ án tốt nghiệp _ E.3.KẾT QUẢ KHÁNG KHUẨN E.coli LB1 LB2 LB3 32 Đồ án tốt nghiệp _ LB4 LB5 Salmonella LB1 33 Đồ án tốt nghiệp _ LB2 LB3 LB4 34 Đồ án tốt nghiệp _ LB5 Starphylococcus LB1 LB2 35 Đồ án tốt nghiệp _ LB3 LB4 LB5 36 ... Kết đối kháng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá với vi khuẩn Staphylococcus 54 Bảng 3.9: Kết đối kháng chủng vi khuẩn lactic vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột cá? ??…………………………………………………………………………….54... nghiên cứu:  Phân lập chủng vi khuẩn lactic  Định danh sơ chủng vi khuẩn lactic  Định lượng axít lactic sinh chủng vi khuẩn lactic phân lập  Đánh giá số đặc tính kháng khuẩn vi khuẩn lactic điều... chủng vi khuẩn nghi ngờ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá Hình thái khuẩn lạc Vi khuẩn lactic sau nuối cấy 48 mơi trường MRS agar có bổ sung thêm 5% CaCO3, chọn khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn lactic