Nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự phương pháp sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột là loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giống như buret để định phân trong phòng thí nghiệm. Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di
chuyển từ trên đầu cột xuống dưới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh, rồi ra khỏi cột và được hứng trong những ống nghiệm, mỗi ống nghiệm một thể tích như nhau. Nhờ thiết bị thu nhận mẫu tự động có thể hoạt động trong một thời gian dài, người ta có thể triển khai sắc ký cột để tự động qua đêm rất thuận tiện [5]. Hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn. Kích cỡ của cột sắc ký tùy thuộc vào lượng mẫu chất cần phân tích.
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70- 230 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone, CH2Cl2/MeOH,…với tỉ lệ thích hợp [5].
2.3.4Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên
2.3.4.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Hạt nhân của nguyên tử 1H và một số nguyên tử khác cũng có số khối lẻ như 13C, 19F ..., đều có momen từ. Nếu đặt proton chẳng hạn trong từ trường không đổi thì momen từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường [6]. Do đó cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài.
Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR):
- Số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) trên phổ cộng hưởng từ nhân proton xác nhận các loại proton khác nhau và môi trường bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Để biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc một, bậc hai, bậc ba,…ta dựa vào vị trí của tín hiệu. Các proton khác nhau này có các môi trường electron bao quanh khác nhau, và chính môi trường electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ [7].
Trên phổ 1H-NMR tín hiệu các proton được ghi nhận thông qua độ chuyển dịch hóa học. Độ dịch chuyển hóa học được xác định bằng quãng cách giữa tín hiệu của nhóm những tín hiệu của proton (hay hạt nhân) được khảo sát và tín hiệu của proton hay hạt nhân ở chất chuẩn. Chất chuẩn thường dùng là TMS được gán = 0 ppm. Độ dịch chuyển hóa học của một số loại proton được trình bày trong Bảng 2.1 [6].
Bảng 2.1. Độ chuyển dịch hóa học của proton
Loại proton (ppm) Loại proton (ppm)
R-CH3 R-CH2-R R3CH R2C=CH2 0,8÷1,0 1,2÷1,4 1,4÷1,6 4,5÷6,5 Ar-H R-OH R-CH=O R-COOH 6,5÷8,5 0,5÷5,0 9÷10 10,5÷12 - Để biết số proton cùng loại ta dựa vào cường độ tín hiệu.
- Người ta thường dựa vào sự tương tác (tách vạch phổ) và hằng số tương tác spin – spin (J) để biết proton nào tương tác với proton nào.
+ Hằng số tương tác spin – spinJ: Một proton hoặc một nhóm proton có thể cho tín hiệu cộng hưởng đặc trưng chỉ có một vạch đơn (singlet) hoặc một nhóm nhiều vạch (multiplet). Quãng cách giữa các vạch kề nhau của một nhóm nhiều vạch được gọi là hằng số tương tác spin – spin (J) với đơn vị Hz[6]. Hằng số tương tác J cho biết một cách chính xác loại thông tin về cấu trúc phân tử. Hằng số J không phụ thuộc vào từ trường cảm ứng. Giá trị hằng số J được đo bằng Hz luôn bằng nhau dù từ trường ngoài thế nào. Độ lớn của hằng số tương tác phụ thuộc vào mối liên quan cấu trúc giữa các proton có tương tác [7].
+ Sự tách vạch phổ gây nên bởi sự tương tác tương tác J. Sự tách vạch phản ánh môi trường bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Số vạch phổ được tách theo qui tắc n+1 với n là số proton có tương tác. Cường độ các vạch
phổ được tách tỉ lệ theo qui tắc tam giá Pascal. Hình 2.7 minh họa về sự tách vạch phổ.