CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Bước 1: Chuẩn bị cột
Sử dụng cột có đường kính 10 cm, chiều dài 50 cm được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 150 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Bước 2: Đưa chất lên cột
97,1 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 / n-hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 90 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.12).
Hình 3.12. Cột tổng silica gel cặn n-hexane
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane gradient (0- 100%).
Hứng dung dịch rửa giải khoảng 80-100 mL vào mỗi bình nón (Hình 3.13).
Hình 3.13. Quá trình sắc ký cột tổng n-hexane
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các bình có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng dung môi MeOH. Kết quả thu được 9 phân đoạn kí hiệu từ F1-F9 (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng n-Hexane
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân
đoạn Khối lượng (gam) 1 1÷12 1200mL CH2Cl2/n-Hexane 15:85 F1 40,7 2 13÷20 800 mL CH2Cl2/n-Hexane 15:85 F2 4,3 3 21÷59 3300mL CH2Cl2/n-Hexane 15:85 600mL CH2Cl2/n-Hexane 20:80 F3 22,8 4 60÷89 400mL CH2Cl2/n-Hexane 20:80 1000mL CH2Cl2/n-Hexane 25:75 1000mL CH2Cl2/n-Hexane 35:65 F4 7,3
600mL CH2Cl2/n-Hexane 45:55 5 90÷118 400mL CH2Cl2/n-Hexane 45:55 1000mL CH2Cl2/n-Hexane 50:50 1000mL CH2Cl2/n-Hexane 55:45 500mL CH2Cl2/n-Hexane 60:40 F5 5,8 6 119÷132 500mL CH2Cl2/n-Hexane 60:40 900 mL CH2Cl2/n-Hexane 75:25 F6 3,8 7 133÷140 100 mL CH2Cl2/n-Hexane 75:25 700mL CH2Cl2/n-Hexane 85:15 F7 3,0 8 141÷166 300mL CH2Cl2/n-Hexane 85:15 1000mL CH2Cl2/n-Hexane 95:5 1300mL CH2Cl2/n-Hexane 100:0 F8 3,0 9 167÷177 1100mL CH2Cl2/n-Hexane 100:0 F9 1,9
Các phân đoạn F1-F9 được khảo sát lại TLC với các hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane (3:1)(V), EtOAc /CH2Cl2( 1:9) (VIII)cho kết quả như trong Hình 3.14.
(I) (II)
Hình 3.14. Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F9
Bước4: Phân lập các chất từ các phân đoạn nhỏ
Từ phân đoạn F3, sử dụng cột có đường kính 4 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 150 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí.Rót từ từ hỗn hợp
silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 22,8 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu
FPLH F3) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 20 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.11.)
Hình 3.15. Cột silica gel FPLH F3
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane gradient 0%- 100%. Hứng dung dịch rửa giải khoảng 10-20 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chết tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 12 phân đoạn kí hiệu F3.1-F3.12. Các phân đoạn F3.1-3.12 được khảo sát lại TLC với các hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane (3:2) (IX) và EtOAc /CH2Cl2 (1:19) (X) cho kết quả như trong Hình 3.16.
(IX) (X)
Hình 3.16. Hình ảnh TLC các phân đoạn FPLH F3.1 –F3.12
Từ phân đoạn F3.7, sử dụng cột có đường kính 4 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 150 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí.Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 4 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH F3.7) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 5 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.17.)
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane gradient 20%- 100%. Hứng dung dịch rửa giải khoảng 10-20 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chết tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 8 phân đoạn kí hiệu F3.7.1-F3.7.8.
Từ phân đoa ̣n F3.7.4, sử dụng cột có đường kính 1 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 25 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí.Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 0,83 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH F3.7.4) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 1 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột Hình 3.18.
Tiến hành rửa giải bằng hê ̣ dung môi CH2Cl2/n-hexane gradient 30%- 100% , hứng dung dịch rửa giải khoảng 5-10 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chết tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 7 phân đoạn kí hiệu F3.7.4.1-F3.7.4.7.
Từ phân đoạn FPLH F3.7.4.4, tiến hành kết tinh trong CH2Cl2/n-hexane 1:1 thu được 61mg chất FH1 dưới da ̣ng tinh thể hình kim màu trắng. Quá trình phân lập chất FH1 được trình bày trên Hình 3.19.
Hình 3.19. Sơ đồ phân lập hợp chất FH1
Hợp chất FH1 không hiện màu dưới đèn tử ngoại ở các bước sóng 254, 366 nm và hiện màu với thuốc thử Ce(SO4)2 (Hình 3.20.)
Hình 3.20. Hình ảnh chất FH1 và sắc ký đồ TLC