Đang tải... (xem toàn văn)
Baøi 1 0 Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm TPHCM Khoa Coâng Ngheä Thöïc Phaåm BỘ MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM GIAÙO TRÌNH THÖÏC TAÄP COÂNG NGHEÄ ENZYME (Löu haønh noäi boä) 2020 1 Baøi 1 KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA YEÁU TOÁ NGOAÏI CAÛNH ÑEÁN HOAÏT TÍNH CUÛA ENZYME 1 Tính Ñaëc Hieäu Cuûa Enzyme 1 1 Nguyeân taéc Tính ñaëc hieäu cuûa enzyme theå hieän ôû ñieåm moãi enzyme chæ taùc duïng leân moät cô chaát nhaát ñònh Chaúng haïn amylase chæ thuûy phaân polysaccharide maø khoâng taùc duïng leân disaccharide Sac.
Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm BỘ MƠN HĨA SINH THỰC PHẨM GIÁO TRÌNH THỰC TẬP CÔNG NGHỆ ENZYME (Lưu hành nội bộ) 2020 Bài KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Tính Đặc Hiệu Của Enzyme 1.1 Nguyên tắc Tính đặc hiệu enzyme thể điểm enzyme tác dụng lên chất định Chẳng hạn amylase thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide Saccharose không cho phản ứng với Fehling phân tử nhóm cetose aldehide tự Phản ứng dương tính saccharose thủy phân thành glucose fructose 1.2 Hóa chất - dung dịch saccharose 1% - dung dịch tinh bột 1% - dung dịch Fehling A vaø B - dung dịch amylase Cho vaøo hai ống nghiệm, ống 0,5 ml dung dịch amylase Thêm ml dung dịch tinh bột 1% vào ống thứ ml dung dịch saccharose 1% vào ống thứ hai Đặt ống vào bồn ổn nhiệt 37 oC 5-10 phút Sau đem hai ống làm phản ứng Fehling So sánh kết giữ ống Nhận xét Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 2.1 Nguyên tắc Vận tốc phản ứng enzyme thường tăng khoảng hai lần nhiệt độ tăng khoảng 100C Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng oC, vận tốc xúc tác men thấp, coi không đáng kể Nhưng nhiệt độ này, enzyme bảo quản tốt Ở 40-50oC, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao 50 oC, enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60-80 oC, enzyme khả hoạt động Ở 100 oC, enzyme bắt đầu tác dụng 2.2 Hóa chất - dung dịch tinh bột 1% - dung dịch amylase 2.3 Tiến hành Lấy ống nghiệm, cho vào: - ống 1: ml dung dịch hồ tinh bột 1% - ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml dung dịch đệm pH Đặt ống vào bình ổn nhiệt 30 oC phút Sau trộn ống vào tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme ảnh hưởng nhiệt độ cách xác định thời gian thủy giải amylase Phương pháp xác định thời gian thủy giải amylase: Cứ sau phút, nhỏ giọt dung dịch lugol (hoặc iod) lên mặt kiếng, sau nhỏ vào giọt hỗn hợp dung dịch Khi không thấy màu xanh xuất lúc tinh bột bị thủy phân hoàn toàn amylase Tương tự vậy, khảo sát mức nhiệt độ khác như: 60 oC, 90oC Vẽ đường biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải (phút) nhiệt độ Nhận xét Giải thích Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 3.1 Nguyên tắc Hoạt tính enzyme thể vùng pH tương đối hẹp pH tối ưu pH tối ưu số enzyme pepsin 1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0… Mức độ ion hóa enzyme phụ thuộc vào mơi trường Enzyme có hoạt tính cao dạng tích điện dương hay tích điện âm trạng thái đẳng điện 3.2 Hóa chất - dung dịch tinh bột 1% - dung dòch amylase - dung dòch lugol (KI 2,65g; I 0,05g; nước cất vừa đủ 100ml) 3.3 Tiến hành Lấy ống nghiệm, cho vào: - ống 1: ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm pH - ống 2: ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm pH - ống 3: ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm pH Sau cho vào ống ml dung dịch enzyme amylase pha loãng Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme ảnh hưởng pH cách xác định thời gian thủy giải amylase (tương tự thí nghiệm 2) Vẽ đường biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải (phút) pH Nhận xét Giải thích Ảnh hưởng chất hoạt hóa chất ức chế đến hoạt tính enzyme Chất hoạt hóa chất có khả làm tăng cường tác dụng enzyme Chúng có chất hóa học khác Thí dụ ion Cl - - amylase, glutathion nhiều protease thực vật, cystein nhiều loại enzyme có nhóm –SH hoạt động… Chất ức chế chất kìm hãm phản ứng xúc tác enzyme, làm giảm lực enzyme chất làm enzyme khả kết hợp với chất Thí dụ ion Ag2+, Hg2+, Pb2+… chất ức chế hầu hết enzyme 4.1 Nguyên tắc Amylase nước bọt (- amylase) tăng hoạt động môi trường có NaCl, ngược lại CuSO4 ức chế tác dụng enzyme Trong ống nghiệm có chứa - amylase tinh bột Nếu ta cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, nước vào ống thứ sau thời gian tác dụng ta thấy: o ống 1: tinh bột thủy giải hồn tồn o ống 2: khơng có thủy phân tinh bột o ống 3: tinh bột thủy giải đến dextrin 4.2 Hóa chất - dung dịch tinh bột 1% - dung dịch amylase pha loãng - dung dịch NaCl 1% - dung dịch CuSO 1% 4.3 Tiến hành Lấy ống nghiệm, cho vào: - ống 1: 0,5 ml dung dịch amylase ñaõ pha loaõng 0,5 ml NaCl 1% - ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml CuSO4 1% - ống 3: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml nước cất Tiếp tục cho vào ống ml dung dịch hồ tinh bột 1% Để ống nhiệt độ phịng khoảng 3-5 phút Sau làm phản ứng Iod với tinh bột dextrin Nhận xét Giải thích Bài tường trình: - Tường trình trình thực hieän - Kết ghi nhận - Nhận xét kết - Giải thích kết Bài ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG SẢN XUẤT MẠCH NHA ENZYME AMYLASE 1.1 Giới thiệu enzyme amylase Amylase hệ enzyme phổ biến thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử polysacharide với tham gia nước Các enzyme amylase từ nguồn khác thường khác tính chất, chế tác dụng sản phẩm cuối thủy phân 1.1.1 Enzyme -amylase Enzyme -amylase thủy phân liên kết 1-4 bên dây amylose amylopectin vị trí để tạo hỗn hợp oligosaccharide ngắn hơn, phản ứng dừng lại gặp liên kết -1-6 điểm phân nhánh Enzyme -amylase phân lập từ Bacillus subtilis loại enzyme chịu nhiệt Đặc tính thuận lợi trình hồ hoá tinh bột để nấu bia tinh bột phải gia nhiệt đến 90oC nhằm mục đích gelatin hoá tinh bột, nhiệt độ thấp nhiệt độ tới hạn enzyme 1100 C Tinh bột thường pha loãng đến nồng độ thích hợp từ 30% đến 40% nấu 1000 C đến phút sau làm lạnh xuống 90 0C giữ yên từ đến để phản ứng đường hóa xảy hoàn toàn Sản phẩm tạo thành sau phản ứn g chủ yếu đườn g maltose olimer khác, chúng không dùng phổ biến kỹ nghệ đường hóa tinh bột sử dụng để thay enzyme -amylase trình sản xuất sirô maltose 1.1.2 Enzyme -amylase -amylase enzyme thuộc nhóm exo-acting phân cắt liên kết glycosid 1-4 tinh bột từ đầu không khử, sản phẩm tạo thành maltose -amylase không cắt liên kết glycosid 1-6 mạch nhánh, thông thường người ta hay sử dụng enzyme -amylase kết hợp với enzyme phân cắt mạch nhánh để thủy phân triệt để tinh bột thành dung dịch đường maltose hay gọi sirô maltose Sirô maltose có tính hút ẩm cao ổn định màu sirô glucose, sản phẩm chúng có dạng kết tinh dính Maltose nguyên liệu dùng chế biến tráng miệng, trang trí bánh hay chế biến bánh kẹo -amylase có nhiều mầm thóc, đại mạch nẩy mầm, chúng thường ứng dụng chế biến mạch nha, chế biến bia, nhiên sản xuất quy mô côn g nghiệp người ta thường sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật 1.2 Trích Enzyme Amilase từ mầm lúa Amylase enzyme tan nước Để trích Amylase từ mầm lúa, ta nghiền nát 10g lúa nẩy mầm với 30 ml nước cất Để yên 15 phút, lọc lấy nước qua lọc, thêm ml cồn tuyệt đối vào lắc để lắng lại Để phần cồn qua giấy lọc giữ chất trầm ống nghiệm Rửa lại 3-4 lần với cồn tuyệt đối, sau đổ tất trầm qua giấy lọc Khi tất nước chảy qua hết, để ống nghiệm phễu đổ giấy lọc 20ml nước để hòa tan chất trầm hiện, ta có dung dịch Amylase tinh 1.3 Trích Enzyme từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật Nghiền cẩn thận môi trường nuôi cấy bề mặt Cân 20g mẫu nghiền nhuyễn, cho vào bình tam giác bình cầu Thêm 500 ml dung dịch NaCl 1%, đặt vào máy lắc Lắc liên tục từ 1-2 nhiệt độ phòng Lọc ly tâm 6000v/phút phút để nhận dịch suốt Nếu môi trường lỏng, cần ly tâm để loại bỏ tế bào vi sinh vật Dịch suốt lọc dùng để phân tích QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MẠCH NHA 2.1 Nguyên lý Dùng enzyme –amylase (Termamyl) tác dụng lên mạch tinh bột khoai mì Loại enzyme có khả thủy phân nhanh tinh bột điều kiện nhiệt độ cao 2.2 Sản phẩm mạch nha Đường nha sản phẩm ứng dụng cho nhiều ngành sản xuất thực phẩm khác nhau, đặc biệt ngành công nghiệp sản xuất bánh kẹo Đường nha sản xuất chủ yếu phương pháp axit phương pháp enzyme Trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm, sản phẩm chế biến từ mạch nha bao gồm: Thực phẩm cho trẻ em; Các loại bánh mì loại sản phẩm khác: bánh bích quy, loại bánh kẹo dòn, kem lòng trắng trứng, bánh hạnh nhân, bánh quy, cookies…; Các loại thức uống lên men rượu, bia, thực phẩm điểm tâm, màu caramel, mát, kẹo chewingum, sữa đặc, bánh kẹo, … 2.3 Quy trình công nghệ Nước Enzyme Tinh bột Chuẩn bị dung dịch to = 100 – 105oC tlưu = phút Hồ hóa to = 95 – 100oC tlưu = 2h DE = - 16 Dịch hóa Enzyme Than hoạt tính Bột trợ lọc pH = 6,0 - 6,5 to = 55 – 60oC; tlöu = 12h pH = – 5,5 DE = 40 - 45 Đường hóa to = 55 – 60oC tlưu = 30 – 45 phút Tẩy màu Lọc Trao đổûi ion Pck = 650 – 700mmHg tos = 60 – 65oC DE = 40 - 45 Cô đặc Thành phẩm (Nguồn: Công ty Đường Biên Hòa, 1997) 2.4 Thuyết minh quy trình 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch Nguyên liệu tinh bột khoai mì hòa trộn với lượng nước thích hợp để tạo thành dung dịch huyền phù có hàm lượng chất khô khoảng 30 – 35% Để tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme, cần điều chỉnh pH dung dịch mức thích hợp (pH = 6,0 - 6,5) cách sử dụng NaOH 30% HCl 30% Lượng –amylase cần thiết để dịch hóa bổ sung vào giai đoạn (0,6 – 0,8 kg/tấn chất khô) 2.4.2 Hồ hóa Dưới tác động nhiệt độ cao, liên kết hạt tinh bột bị phá vỡ, tinh bột hút nước trương nở, tạo điều kiện cho phản ứng thủy phân tinh bột sau xảy dễ dàng Quá trình hồ hóa sử dụng nước trực tiếp phun vào dung dịch huyền phù để nâng nhiệt độ dung dịch lên 105 oC Duy trì nhiệt độ vòng phút để hồ hóa hoàn toàn tinh bột 2.4.3 Dịch hóa Dịch tinh bột hồ hóa làm nguội đến 90 – 95oC, tác dụng enzyme –amylase, tinh bột phân cắt thành đường dextrin hòa tan Quá trình dịch hóa diễn khoảng giờ, sau dịch hóa dung dịch có DE = – 16, pH = 5,5 – 6,0 Ở điều kiện vậy, enzyme bị giảm hoạt tính đáng kể, tiếp tụckéo dài thời gian dịch hóa không làm tăng hiệu suất chuyển hóa DE dung dịch, đồng thời lại làm tăng màu dung dịch biến đổi đường khử nhiệt độ cao 2.4.4 Đường hóa Dịch thủy phân sau dịch hóa tiếp tục đường hóa với enzyme –amylase để tạo thành Maltose Nhiệt độ dịch thủy phân làm nguội xuống 55 oC nước điều chỉnh pH khoảng 5,3 dung dịch HCl Lượng xác enzyme bổ sung vào dịch thủy phân thùng đường hóa (0,1 – 0,2 kg/tấn chất khô) Thời gian đường hóa khoảng 12 Sau đường hóa xong, dịch thủy phân gia nhiệt lên 70 oC để tiêu diệt enzyme 2.4.5 Tẩy màu lọc Dịch thủy phân sau diệt enzyme trộn với than hoat tính (khoảng kg/tấn chất khô) để hấp phụ tạp chất, chủ yếu chất màu Quá trình lấy màu diễn khoảng 30 - 45 phút Sau tẩy màu, dịch thủy phân cho thêm bột trợ lọc lọc thiết bị lọc ép Bột trợ lọc chuẩn bị trước cách hòa trộn với sirô với nước (nếu sản xuất Maltose Dextrin), sử dụng để làm áo cho bàn lọc giai đoạn chuẩn bị lọc Lớp bột trợ lọc giúp cho việc giữ lại tạp chất than để tạo thàn h dịch thủy phân 2.4.6 Trao đổi ion Siro sau lọc chứa tạp chất hữu vô hòa tan (chủ yếu muối khoáng) có nguyên liệu từ hóa chất bổ sung vào giai đoạn trước Phần lớn tạp chất tồn dạng ion cân phân ly Để khử tạp chất sirô đưa qua cột trao đổi ion Trong trao đổi cation, phần lớn ion kim loại loại khỏi sirô, ion H + giải phóng khỏi nhựa chuyển vào sirô Trong trao đổi anion, phần lớn anion Cl -, SO42+, amino acid hòa tan, chất màu loạ i khỏi sirô, ngược lại ion OH - tách khỏi nhựa vào sirô Ion OH- kết hợp với ion H+ tạo thành nước Sirô tiếp tục dẫn qua cột nhựa hỗn hợp để loại triệt để tạp chất hòa tan sót lại Hệ thống bao gồm hai thiết bị trao đổi ion Một hoạt động, lại tái sinh trạng thái chờ 2.4.7 Cô đặc thành phẩm Sirô cô đặc đến nồng độ chất khô khoảng 80% nồi cô đặc gia nhiệt gián tiếp buồng đốt điều kiện chân khoâng (pck = 650 – 700 mmHg, t os = 60 – 65oC) để bảo đảm chất lượng sản phẩm Sirô sau cô đặc đưa vào thùng bán thành phẩm can để tồn trữ xuất sản phẩm 2.4.8 Chỉ tiêu đánh giá chất lượng sản phẩm ❖ Cảm quan Chỉ tiêu Yêu cầu Trạng thái Sánh, kéo suốt Màu sắc Màu vàng rơm vàng nâu caramen Mùi vị Thơm đặc trưng, vị mặn (đối với nha sản xuất phương pháp thủy phân acid), vị lạ Tạp chất Không có tạp chất, cặn bẩn ❖ Hóa lý Chỉ tiêu Yêu cầu Độ khô (Bx), % 82 – 84 Đường khử (RS), % 36 – 39 Độ pH 5,0 – 5,5 Hàm lượng tro, % 0,6 Kim loại nặng, % 0,001 Tinh bột acid tự Không có Hàm lượng muối, % 0,5 Nhiệt độ cháy xém, oC 140 - 148 BÀI TƯỜNG TRÌNH - Tường trình trình thực - Nhận xét chất lượng sản phẩm Bài 3: ENZYME BROMELIN Trích ly Bromeline từ dứa Bromeline protease có nguồn gốc thực vật Bromeline có nhiều phần khác dứa: quả, chồi, thân, vỏ… Bromeline ly trích sau: Dứa xanh đem gọt vỏ dao inox, cân xác định trọng lượng lấy phần thịt, lõi Mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát Đổ vải màng, vắt thật kỹ, đem lọc để loại bỏ chất xơ Đo thể tích dịch chieát Ứng dụng enzyme bromelin làm mềm thịt Thịt nạc cắt thành lát mỏng giống theo chiều dọc để quan sát sớ thịt Chia thịt làm phần: Dĩa 1: bổ sung 20 ml nước dứa, ngâm Dĩa 2: bổ sung 20 ml enzyme protease pha lỗng 100 lần, ngâm Dĩa 3: không xử lý (đối chứng) Sau giờ, đun nóng thịt dĩa phút 100oC Quan sát, đánh giá so sánh mùi vị, cấu trúc thịt mẫu Bài tường trình - Tường trình trình thực - Tính toán hiệu suất thu hồi dung dịch enzyme thô (%) - Kết so sánh ứng dụng enzyme bromelin làm mềm thịt 10 Baøi 4: ENZYME PECTINASE Giới thiệu chung Pectinase tên gọi chung nhóm Enzyme có khả phân giải pectin, dạng glucid cao phân tử có nhiều thực vật Pectinase Enzyme có nhiều ứng dụng lớn thứ ba sau amylase protease Trong công nghiệp, đặc biệt công nghiệp thực phẩm, dùng nhiều để tăng hiệu suất ép, làm nước quả, rượu Pectinase dùng sản xuất bột cà phê hòa tan, để tách lớp nhớt chứa nhiều pectin hạt Pectinase vi sinh vật tổng hợp có tác dụng trình ngâm đay, gai để tách sợi xellose không phá huỷ sơ ïi Enzyme pectinase sử dụng rộng rãi sản xuất nước để làm tăng tốc độ lọc hiệu suất ép, đồng thời trình tồn trữ nước không bị đục pectin bị lắng trở lại Ngoài dùng Enzyme pectinase trích ly dược liệu với tỉ lệ thích hợp khắc phục nhược điểm tốn nhiều nguyên liệu thời gian, tách không kiệt chất bã thuốc, dược liệu bị keo nhầy không chiết được, sau thời gian thuo ác đục trở lại ❖ Pectin: Pectin chất Enzyme pectinase Trong thực vật, pectin có vai trò quan trọng tạo thành vách tế bào thực vật, gắn kết tế bào vào diện phức với cellulose, đóng vai trò thành phần chủ yếu lớp xơ cấu vách tế bào thực vật thượng đẳng Trong thực vật pectin tồn dạng: - Dạng protopectin không tan nước, tồn chủ yếu thành tế bào, thường dạng liên kết với polysacharide khác arabane, tinh bột, cellulose - Dạng pectin hòa tan chủ yếu dịch tế bào Cấu tạo pectin chủ yếu mạch chính, gồm gốc acide –galacturonic liên kết với liên kết 1,4-glucoside, gọi acide polygalacturonic hay acid pectic Pectin hòa tan tự nhiên ester metylic acid pectic Pectin hay pectin hòa tan ester metilic acid polygalacturonic cao phân tử Acid pectinic acid polygalacturonic có phần nhỏ nhóm cacboxy ester hóa metanol Acid pectic acid polygalacturonic cao phân tử hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy 11 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp so màu 2.1 Nguyên tắc Là phương pháp dựa việc so sánh cường độ màu dung dịch nghiên cứu với cường độ màu dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ chấ t phân tích Phương pháp thời gian so với phương pháp hóa học khác Nguyên tắc phương pháp xác định lượng acid galacturonic tạo trình thủy phân pectinase Cơ chất pectin không kết tủa ZnSO4 Định nghóa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính pectinase lượng Enzyme điều kiện tiêu chuẩn (ở nhiệt độ 30 C pH 3,9 – 4,1, thời gian phản ứng 60 phút với nồng độ pectin môi trường phản ứng 0,66%, mức độ thủy phân pectin 30%) có khả xúc tác, làm biến đổi 1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic 2.2 Hóa chất - Dung dịch pectin 1% - Dung dịch ZnSO4 15% - Dung dòch Enzyme 1% - Dung dòch Anthrone 0,2% (C6 H4 CO C6 H4 CH2) acid sulfuric đậm đặc 2.3 Tiến hành Cho 2ml dung dịch pectin 1% vào ống nghiệm cho 1ml dung dịch Enzyme 1%, lắc cho vào tủ ấm nhiệt độ 30 0C (dung dịch pectin có pH = 3,9-4,1) Sau 60 phút lấy thêm 2ml ZnSO4 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc đem pha loãng lần dùng cho phản ứng với Anthrone Lấy 2,5 ml dung dịch lọc pha loãng cho vào ống nghiệm cho 5ml Anthrone vào, lắc mạnh thời gian 10 phút Sau đặt nồi thủy nhiệt độ 70 0C thời gian 12 phút lấy làm nguội đến nhiệt độ phòng tiến hành đo giá trị OD bước sóng X = 584 nm Thực tương tự ống đối chứng (thay enzyme nước) Sau đó, tính giá trị OD = ODTN – ODĐC để sử dụng vào công thức tính hoạt tính ODTN : Giá trị đo OD thí nghiệm ODĐC : giá trị đo OD đối chứng 2.4 Tính hoạt độ Hoạt tính enzyme pectinase = 0,34 x OD – 0,0104 m Trong đó: m lượng enzyme lấy để tiến hành phản ứng (g hay ml) 12 Ứng dụng enzyme pectinase làm nước trái ép 3.1 Nguyên liệu - Hóa chất - Trái theo mùa (táo / ổi / xồi) - Dung dịch pectinase 1% 3.2 Tiến hành - Cân 50 g nguyên liệu quả, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100 ml với nước cất - Hút 18 ml dung dịch cho vào ống nghiệm ống nghiệm khác - Thêm dung dịch pectinase 1% vào ống nghiệm với thể tích ống 0; 0,5; 1; 1.5; ml - Sau thêm nước cất vào cho ống có đủ 20 ml - Để tất ống nghiệm 50-55 oC 60 phút - Sau lọc qua giấy lọc, ngâm ống nghiệm đựng dịch sau lọc nước lạnh 10 phút so sánh độ mẫu Giải thích Bài tường trình - Tường trình trình thực - Kết xác định hoạt độ Enzyme pectinase - Kết ứng dụng enzyme pectinase làm nước trái ép 13 Bài 5: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE Giới thiệu Enzyme Amylase Enzyme thủy phân tinh bột gồm: -Amylase, -Amylase, -Amylase… - Amylase xúc tác phản ứng cắt liên kết glycosid amylose Amylose pectin vị trí nào, kết ta phân tử dextrin Tiếp đến dextrin lại tiếp tục bị phân giải để cuối ta có đường maltose glucose - Amylase thủy phân liên kết glycosid 1-4, đầu không khử để tạo sản phẩm cuối đường maltose Các loại Amylase có thực vật, động vật vi sinh vật Khi hạt nảy mầm, hàm lượng Enzyme Amylase tăng lên để thủy phân tinh bột phôi nhũ thàn h đường cung cấp cho phát triển phôi Một số loại vi sinh vật có khả tạo Enzyme Amylase để thủy phân hydratcarbon phức tạp dạn g tinh bột khoai mì, cám, bắp thành hydratcarbon đơn giản maltose, glucose Các Enzyme ly trích từ mầm lúa hay từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng để chế biến sản phẩm mạch nha, glucose, syrup Phương pháp xác định hoạt lực Enzyme Amylase phương pháp Heinkel 2.1 Nguyên tắc Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch iốt Đơn vị hoạt động Enzyme lượng Enzyme có khả phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút 300C 2.2 Dụng cụ - Ống nghiệm - Pipette 1ml - Bếp đun cách thủy có điều chỉnh nhiệt độ - Máy so màu spectronic 20D+ 2.3 Hoá chất - Dung dịch NaCl 0,1% - Dung dòch acid sulfosalisilic 20% 14 - Dung dịch iod: Hoà tan 1g iod 5ml dung dịch có chứa 2g KI, thêm nước cất vào đến 300ml Khi dùng pha loãng dung dịch 150 lần - Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = - Dung dịch amylase 1% - Dung dịch tinh bột 1% dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = Cân 1g tinh bột trộn với khoảng 10ml dung dịch đệm, thêm vào 80ml dung dịch đệm sôi, để nguội thêm dung dịch đệm đến 100ml Để bảo quản dung dịch tinh bột thêm 1g natri benzoat - Dung dịch tinh bột 1%: Cân 1g tinh bột trộn với 10ml nước cất, thêm 80ml nước cất sôi khuấy cần tiếp tục đun để nhận dung dịch suốt, để nguội, cho vào bình định mức 100ml thêm nước cất vào vạch 2.4 Lập đồ thị chuẩn Từ dung dịch tinh bột 1%, chuẩn bị dung dịch có chứa 0, 2, 4, 6, 8, 10mg tinh bột 1ml cách lấy 0, 2, 4, 6, 8, 10ml tinh bột 1% thêm nước cất vào 10ml bảng sau: Ống Số ml tinh bột 1% 10 Số ml nước cất 10 Nồng độ tinh bột (mg/ml) 10 Tiếp tục lấy ống nghiệm khác, laáy 0,1ml ống dung dịch tinh bột chuẩn bị thêm 0,1ml dung dịch NaCl 0,1%, 0,2ml dung dịch đệm, 0,1ml nước cất, 0,5ml dung dịch acid sulfosalisilic 20% lắc đều, thêm 9ml dịch iod pha loãn g 150 lần So màu bước sóng 560mm Vẽ đồ thị đường chuẩn Trên trục hoành ghi số mg tinh bột, trục tung ghi số OD đọc máy tương ứng Ống 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Số mg tinh bột 0,2 0,4 0,6 0,8 A1 A2 A3 A4 A5 A6 OD560nm 2.5 Caùch tiến hành Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch tinh bột 1%, 1ml dung dịch NaCl 0,1% 2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6, lắc đều, giữ 30 0C 15-20 phút để dung dịch đạt 300C Thêm vào dung dịch 1ml dung dịch Enzyme đạt đến 300C, lắc đều, tiếp tục giữ 300C 30 phút Sau đó, lấy ống nghiệm khỏi tủ ấm cho vào 5ml dung dịch 15 acid sulfosalisilic 20% để làm ngừng phản ứng sau vài phút lọc Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra tương tự trê n cho dung dịch sulfosalisilic vào trước cho dung dịch Enzyme Lấy 1ml dịch lọc mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm 9ml dung dịch iod pha loãng 150 lần so màu bước sóng 560nm, lấy hiệu số số đọc máy mẫu kiểm tra mẫu thí nghiệm Đối chiếu đường cong chuẩn, tính số mg tinh bột bị phân giải Bài tường trình - Tường trình trình thực - Tính toán hiệu suất thu hồi Enzyme - Hoạt tính Enzyme: Tính số đơn vị hoạt động (ĐVHĐ)/1ml dịch Enzyme Đơn vị hoạt động/g nguyên liệu thô = ĐVHĐ x V m V : Tổng thể tích dịch Enzyme m : Trọng lượng nguyên liệu dùng trích Enzym 16 Bài 6: ENZYME PROTEASE Đại cương Pepsin protease acid có dịch vị màng nhầy dày động vật người Pepsin Spaleazani phát năm 1983 Theo bảng phân loại quốc tế pepsin thuộc loại hydrolase mã hoá EC.3.4.23.1 Pepsin hoạt động tốt pH acid từ 1.5 đến 2.2 Pepsin phân giải không hoàn toàn protein thành peptid ngắn từ đến acid amin gọi pepton Pepsin ứng dụng nhiều lónh vực: y dược, chăn nuôi, công nghệ thực phẩm Ví dụ pepsin làm thuốc trợ tiêu hoá, sản xuất dịch đạm thủy phân , sản xuất pepton làm môi trường nuôi cấy vi sinh, làm mềm thịt… Phương pháp thu nhận pepsin Khi tiến hành thí nghiệm chiết tách pepsin từ dày heo luôn phải giữ mẫu điều kiện lạnh - 40C • Dạ dày tươi mổ lộn ngược lại, nhẹ tay bỏ thức ăn dư, rửa nhẹ nước, tác h bỏ mỡ, đem cân trọng lượng dày • Nạo hết dịch nhầy bề mặt bóc niêm mạc khỏi dày, gồm vùng: vùng niêm mạc (thực quản thượng vị) dày màu trắng; vùng niêm mạc (thân vị hạ vị) mỏng màu sậm tiết nhiều Enzym pepsinozen HCl • Đem cắt xay nhỏ niêm mạc cân lượng xác định đem hoà với HCl 0,8% chỉnh pH = 1,5 – theo tỷ ệ 1:2 thể tích Đặt mẫu vào tủ ấm 40 0C vòng 24 để mẫu tự phân • Đem hỗn hợp lọc qua vải sau vải mịn nhiều lần để dịch lọc • Đo thể tích dịch lọc: Tủa NaCl theo tỷ lệ 25% muối, khuấy cho tan muối Để yên dịch lọc tủ lạnh cho kết tủa xảy nhanh chóng, sau 30 phút lấy đem ly tâm tốc độ 4000v/phút vòng 15 phút Thu kết tủa loại bỏ dung dịch Thêm lượng xác định chất độn tinh bột hòa tan để sấy cho mau khô Để hạn chế giảm hoạt tính Enzyme cần sấy mẫu 350C - 400C kèm quạt gió ta thu pepsin thô dạng bột - Cân trọng lượng pepsin thô thu - Bảo quản Enzyme bình hút ẩm có Silicagel 17 Xác định hoạt tính pepsin thô phương pháp Anson cải tiến 3.1 Nguyên tắc Casein pepsin phân giải môi trường acid tạo đoạn peptid ngắn không tủa T.C.A (trichloro acetic acid) lượng tyrosin, tryptophan xác định phản ứng màu với thuốc thử folin Đo mật độ quang dung dịch suy nồng độ sản phẩm tính hoạt tính protein 3.2 Hóa chất • Casein 2% • Acid trichloro acetic acid 5% • NaOH 0,5N • Thuốc thử Folin pha loãng lần bằn g nước cốt • Dung dịch Tyrosin chuẩn 1m (181,19mg Tyrosin 1l HCL 0,2N) 3.3 Xây dựng đường chuẩn Tyrosin Để xác định lượng Tyrosin dung dịch nghiên cứu ta phải xây dựng đường chuẩn với Tyrosin nguyên chất Cho vào ống nghiệm dung dịch Tyrosin chuẩn theo thứ tự sau Ống nghiệm Thể tích Tyrosin (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 HCl 0,2 N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Folin (ml) Để yên dung dịch 15 phút, đem đo mật độ quang bước sóng 660mm Vẽ đường chuẩn Tyrosin Một đơn vị Anson lượng Enzyme cần thiết để thủy phân chất phút tạo sản phẩm (không kết tủa TCA) tương đương 1 mol tyrosin 3.4 Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ Cho vào ống nghiệm A (1 & 2) ống B (đối chứng) ống 5ml dung dịch casein 2%, cân 0,1g Enzyme pepsin pha loãng nước cất Độ pha loãng tùy thuộc vào hoạt tính Enzyme mạnh hay yếu Lấy 1ml dịch Enzyme pha loãng cho vào ống nghiệm A giữ xác 10 phút nhiệt độ bình thường, sau cho 10ml TCA 5% Ống B thực ống A cho TCA vào trước sau cho Enzyme 18 Để yên ống 30 phút đem lọc Lấy 1ml dịch lọc thêm 2ml NaOH 0,5N 0,6ml thuốc thử Folin Sau 15 phút đo OD bước sóng 660nm Từ giá trị OD, dựa vào đường chuẩn Tyrosin mà xác định hàm lượng tyrosin mẫu thí nghiệm Theo công thức tính toán tính số đơn vị hoạt tính 3.5 Tính kết Tính hiệu số giá trị OD mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra OD = ODTN – ODĐC Từ OD dựa theo đồ thị chuẩn tính lượng mol tyrosin tương ứng Tính hoạt tính protease pepsin biểu thị số đơn vị Protease/1g chế phẩm theo công thức Hoạt độ protease/1ml enzyme = mol Tyr x V t Hoạt độ 1ml x V1 Hoạt độ protease/1g chế phẩm = m V : Thể tích toàn hỗn hợp (Cơ chất + Enzyme + TCA) t : Thời gian thủy giải 10 phút V1: Thể tích toàn Enzyme pha loãng m : Trọng lượng Enzyme đem thí nghiệm (0,1g) Bài tường trình - Tường trình trình thực - Tính toán hiệu suất kết tủa (%) - Xác định hoạt tính Enzyme thô (đơn vị hoạt động/ml Enzyme) 19 ... nhiệt độ này, enzyme bảo quản tốt Ở 40-50oC, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao 50 oC, enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60-80 oC, enzyme khả hoạt động Ở 100 oC, enzyme bắt đầu... tính enzyme 3.1 Nguyên tắc Hoạt tính enzyme thể vùng pH tương đối hẹp pH tối ưu pH tối ưu số enzyme pepsin 1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0… Mức độ ion hóa enzyme phụ thuộc vào mơi trường Enzyme. .. kết - Giải thích kết Bài ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG SẢN XUẤT MẠCH NHA ENZYME AMYLASE 1.1 Giới thiệu enzyme amylase Amylase hệ enzyme phổ biến thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải