Báo cáo thực hành CN ENZYME

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME GVHD TS Nguyễn Minh Xuân Hồng Nhóm thực hiện 14 Thời gian Thứ 6 ca 1+2, ngày 11 tháng 12 năm 2020 Danh sách thành viên 1 Võ Thị Hồng Ngọc 18125220 DH18BQ 2 Đàng Thị Phi Nhung 18125523 DH18BQ 3 Lý Tài Quang 18125283 DH18BQ 4 Nguyễn Thị Kiều Trang 18125385 DH18BQ 5 Nguyễn Thị Thùy Trang 18125387 DH18BQ 6 Nguyễn Minh Ty 18125464 DH18BQ 7 Hà Lâm Tiểu Uyên 18125405 DH18BQ TP HCM, ngày 12 thán.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH CƠNG NGHỆ ENZYME GVHD: TS Nguyễn Minh Xn Hồng Nhóm thực hiện: 14 Thời gian: Thứ ca 1+2, ngày 11 tháng 12 năm 2020 Danh sách thành viên: Võ Thị Hồng Ngọc Đàng Thị Phi Nhung Lý Tài Quang Nguyễn Thị Kiều Trang Nguyễn Thị Thùy Trang Nguyễn Minh Ty Hà Lâm Tiểu Uyên 18125220 18125523 18125283 18125385 18125387 18125464 18125405 DH18BQ DH18BQ DH18BQ DH18BQ DH18BQ DH18BQ DH18BQ TP.HCM, ngày 12 tháng 12 năm 2020 BÀI 1: KHẢO SÁT TÍNH ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Tính đặc hiệu enzyme 1.1 Nguyên tắc Tính đặc hiệu enzyme thể điểm enzyme tác dụng lên chất định Chẳng hạn amylase thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide Saccharide khơng cho phản ứng với Fehling phân tử khơng có nhóm cetose aldehide tự Phản ứng dương tính saccharose thủy phân thành glucose fructose 1.2 Hóa chất - Dung dịch saccharose 1% - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch Fehling A B - Dung dịch amylase 1.3 Tiến hành - Chuẩn bị ống nghiệm: + Ống 1: Cho vào 0.5 ml dung dịch amylase, thêm ml dung dịch tinh bột 1% + Ống 2: Cho vào 0.5 ml dung dịch amylase, thêm ml dung dịch saccharose 1% - Đặt ống vào bồn ổn định nhiệt 37C 5-10 phút - Đem ống làm phản ứng Fehling So sánh kết ống Nhận xét 1.4 Kết Hình 1.1 Kết thí nghiệm tính đặc hiệu enzyme Cả ống nghiệm xuất kết tủa đỏ gạch, ống có nhiều kết tủa so với ống 1.5 Giải thích kết luận  Giải thích: - Amylase thủy phân Polysaccharide thành Monosaccharide mà không thủy phân saccharose - Fehling phản ứng với phân tử có nhóm cetose aldehide tự do, ống chứa saccharose khơng đổi màu Còn ống chứa tinh bột bị đổi màu nhiều tinh bột thủy phân thành glucose  Kết luận: Enzyme có tính đặc hiệu, thể điểm tác dụng lên chất định Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 2.1 Nguyên tắc Vận tốc phản ứng enzyme thường tăng khoảng lần nhiệt độ tăng khoảng 100C Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng 00C, vận tốc xúc tác men thấp, coi không đáng kể Nhưng nhiệt độ này, enzyme bảo quản tốt Ở 40 – 500C, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao 500C enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60 – 800C, enzyme khả hoạt động Ở 1000C, enzyme bắt đầu tác dụng 2.2 Hóa chất - Dung dịch hồ tinh bột 1% - Dung dịch amylase - Dung dịch đệm pH 2.3 Tiến hành Lấy ống nghiệm, cho vào: + Ống 1: ml dung dịch hồ tinh bột 1% + Ống 2: 0.5 ml dung dịch amylase pha loãng 0.5 ml dung dịch đệm pH Đặt ống vào bình ổn nhiệt 300C phút Sau trộn ống vào tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme ảnh hưởng nhiệt độ cách xác định thời gian thủy giải amylase 2.4 Kết Hình 1.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme Bảng Thời gian thủy giải tinh bột enzyme α-amylase nhiệt độ khác Nhiệt độ Thời gian thủy giải 300C >10 phút 600C phút 900C phút Hình 1.3 Biểu đồ biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải nhiệt độ 2.5 Giải thích kết luận  Giải thích - Ở nhiệt độ 30°C, sau 10 phút màu xanh chưa biến → ln có tinh bột phản ứng với Iod tạo màu xanh → tinh bột không bị thủy giải - Ở nhiệt độ 60°C, màu xanh biến sau phút → tinh bột bị thủy giải chậm - Ở nhiệt độ 90°C, màu xanh biến nhanh chóng sau phút → enzyme phân giải gần hoàn toàn tinh bột  Kết luận: - Enzyme α-amylase enzyme thủy phân liên kết α-1,4 tinh bột dẫn đến hình thành maltodextrin hòa tan, maltose glucose - Nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase 90°C Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 3.1 Nguyên tắc Hoạt tính enzyme thể vùng pH tương đối hẹp pH tối ưu pH tối ưu số enzyme pepsin 1,2 - 2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0 - 9,0 Mức độ ion hóa enzyme phụ thuộc vào mơi trường Enzyme có hoạt tính pH cao dạng điện tích dương hay âm trạng thái đẳng điện 3.2 Hóa chất - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch amylase - Dung dịch lugol (KI 2.65g; I2 0,05g; nước cất vừa đủ 100ml ) 3.3 Tiến hành Lấy ống nghiệm, cho vào: + Ống 1: 1ml dung dịch tinh bột 1% 1ml dung dịch đệm pH + Ống 2: 1ml dung dịch tinh bột 1% 1ml dung dịch đệm pH + Ống 3: 1ml dung dịch tinh bột 1% 1ml dung dịch đệm pH Sau cho vào ống 1ml dung dịch enzyme amylase pha loãng Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme ảnh hưởng pH cách xác định thời gian thủy giải enzyme amylase ( tương tự thí nghiệm 2) Vẽ đường biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải ( phút) pH Nhận xét giải thích 3.4 Kết Hình 1.4 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Bảng Thời gian thủy giải tinh bột enzyme α-amylase độ pH khác pH Thời gian thủy giải phút 4.5 phút >10 phút Hình 1.4 Biểu đồ biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải pH 3.5 Giải thích kết luận  Giải thích: - Ở pH=4, lugol dần màu phút pH enzyme amylase bắt đầu phân giải tinh bột - Ở pH=6, lugol màu 4,5 phút, tinh bột bị phân giải dần enzyme amylase - Ở pH=8, màu lugol khơng thay đổi, môi trường pH tinh bột không bị phân giải nên lugol tạo màu xanh với tinh bột  Kết luận: Enzyme amylase hoạt động tối ưu pH=8 Ảnh hưởng chất hoạt hóa chất ức chế đến hoạt tính enzyme Chất hoạt hóa chất có khả làm tăng cường tác dụng enzyme Chúng có chất hóa học khác Thí dụ ion Cl- α-amylase, glutathion nhiều protease thực vật, cystein nhiều loại enzyme có nhóm -SH hoạt động… Chất ức chế chất kìm hãm phản ứng xúc tác enzyme, làm giảm lực enzyme chất làm enzyme khả kết hợp với chất Thí dụ ion Ag2+, Hg2+, Pb2+… chất ức chế hầu hết enzyme 4.1 Nguyên tắc Amylase nước bọt (α-amylase) tăng hoạt động môi trường có NaCl, ngược lại CuSO4 ức chế tác dụng enzyme Trong ống nghiệm có chứa α- amylase tinh bột Nếu ta cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, nước vào ống thứ ba sau thời gian tác dụng ta thấy:  Ống 1: tinh bột thủy giải hồn tồn  Ống 2: khơng có thủy phân tinh bột  Ống 3: tinh bột thủy giải đến dextrin 4.2 Hóa chất - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch amylase pha loãng - Dung dịch NaCl 10% - Dung dịch CuSO4 1% 4.3 Tiến hành Lấy ống nghiệm, cho vào: + Ống 1: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml NaCl 10% + Ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml CuSO4 10% + Ống 3: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml nước cất Tiếp tục cho vào ống ml dung dịch hồ tinh bột 1% Để ống nhiệt độ phòng khoảng 3-5 phút Sau làm phản ứng Iod với tinh bột dextrin Nhận xét giải thích 4.4 Kết Hình 1.5 Trước phản ứng Iod Hình 1.6 Sau phản ứng Iod Sau nhỏ Iod vào ống nghiệm, ta thấy: - Ống chuyển sang màu vàng nâu - Ống chuyển sang màu xanh đen - Ống chuyển sang màu xanh dương đậm 4.5 Giải thích kết luận  Giải thích - Ống 1: có màu vàng nâu enzyme amylase tăng hoạt động mơi trường có NaCl, tinh bột thủy phân hồn tồn, khơng cịn tinh bột để tác dụng với Iod lại màu nâu Iod - Ống 2: Có màu xanh đen enzyme amylase bị ức chế CuSO4 thủy phân tinh bột, lượng tinh bột tác dụng với Iod tạo màu xanh đen - Ống 3: có màu xanh dương đậm, enzyme amylase thủy giải phần tinh bột thành dextrin, lượng tinh bột dư tác dụng với Iod tạo màu xanh dương đậm  Kết luận: NaCl làm tăng khả hoạt động enzyme amylase CuSO4 làm ức chế khả hoạt động BÀI 3: ENZYME BROMELIN Giới thiệu chung Bromelin Protease có nguồn gốc thực vật Bromelin có nhiều phận khác dứa: thân, vỏ, chồi, quả, Bromelin ly trích sau: Dứa xanh đem gọt vỏ dao inox, cân xác định trọng lượng lấy phần thịt, lõi Mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát Đổ vải màng, vắt thật kỹ, đem lọc để loại bỏ chất xơ Ứng dụng enzyme bromelin làm mềm thịt 2.1 Nguyên liệu Thịt bò Úc 2.2 Tiến hành - Thịt cắt thành lát mỏng giống theo chiều dọc để quan sát sớ thịt - Chuẩn bị dĩa, bỏ phần thịt cắt vào dĩa bổ sung  Dĩa 1: Bổ sung 20 ml nước dứa trích ly, ngâm  Dĩa 2: Bổ sung 20 ml enzyme protease pha loãng 100 lần, ngâm  Dĩa 3: Khơng xử lý (đối chứng) - Sau giờ, đun nóng thịt dĩa phút 100°C Quan sát, đánh giá so sánh mùi vị, cấu trúc thịt mẫu 2.3 Kết Hình 3.1 Thịt sau ngâm Hình 3.2 Thịt sau đun sôi - Dĩa 1: khơng thấy rõ sớ thịt bở nhẹ, có mùi nhẹ thịt mùi thơm dứa, vị chua - Dĩa 2: thấy rõ sớ thịt, mùi tanh, độ mềm vừa phải - Dĩa 3: thấy sớ thịt khơng rõ dĩa 2, có mùi đặc trưng thịt, mềm 2.4 Giải thích kết luận  Giải thích - Dĩa 1: dứa có enzyme Bromeline làm thủy phân phần protein thịt thành acid amin phá vỡ thành phần cấu trúc làm thịt mềm hơn, giảm độ thịt - Dĩa 2: enzyme protease tạo độ mềm vừa phải cho thịt, góp phần làm tăng hương vị thịt - Dĩa 3: khơng có tác dụng enzyme nên thịt giữ nguyên độ mềm hương vị tự nhiên  Kết luận Enzyme Bromeline có tác dụng làm mềm thịt nên thường ứng dụng nấu ăn Bài 4: ENZYME PECTINASE Giới thiệu chung Pectinase tên gọi chung nhóm enzyme có khả phân giải pectin, dạng glucid cao phân tử có nhiều thực vật Pectinase enzyme có nhiều ứng dụng lớn thứ bas au amylase protease Trong công nghiệp, đặc biệt cơng nghiệp thực phẩm, dùng nhiều để tang hiệu suất ép, làm nước quả, rượu Pectinase đưuọc dùng sản xuất bột cà phê hòa tan, để tách lớp nhớt chứa nhiều pectin hạt Pectinase vi sinh vật tổng hợp có tác dụng q trình ngâm đay, gai để tách sợi xellose không phá hủy sợi Enzym pectinase đưuọc sử dụng rộng rãi sản xuất nước để làm tang tốc độ lọc hiệu suất ép, đồng thời trình tồn trữ khơng bị đục pectin lắng trở lại Ngồi dùng enzyme pectinase trích li dược liệu với tỉ lệ thích hợp khắc phục nhược điểm tốn nhiều nguyên liệu thời gian, tách không kiệt chất bã thuốc, dược liệu bị keo nhầy không chiết được, sau thời gian thuốc đục trở lại  Pectin Pecin chất enzyme pectinase Trong thực vật, pectin có vai trị quan trọng tạo thành vách tế bào thực vật, gắn kết tế bào vào diện phức với cellulose, đóng vai trị thành phần chủ yếu lớp xơ cấu vách tế bào thực vật thượng đẳng Trong thực vật, pectin tồn dạng: - Dạng protopectin không tan nước, tồn chủ yếu thành tế bào, thường dạng liên kết với polysaccharide khác arabane, tinh bột, cellulose - Dạng pectin hòa tan chủ yếu dịch tế bào Cấu tạo pectin chủ ếu mạch chính, gồm gốc acide-galacturonic liên kết với liên kết 1,4-glucoside, gọi pectin Pectin hòa tan tự nhiên ester metilic chủa acid pectic Pectin hay pectin hòa tan ester metylic acid polygalacturonic cao phân tử acid pectinic acid polygalacturonic có phần nhỏ nhóm cacboxy ester hóa methanol Acid pectin acid polygalacturonic cao phân tử hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy Xác định hoạt tính pectinase phương pháp so màu 2.1 Nguyên tắc Là phương pháp dựa việc so sánh cường độ màu dung dịch nghiên cứu với cường độ màu dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ chất phân tích Phương pháp thời gian so với phương pháp hóa học khác Nguyên tắc phương pháp xác định lượng acid galacturonic tạo trình thủy phâm pectinase Cơ chất pectin không kết tủa ZnSO4 Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính pectinase lượng enzyme điều kiện tiêu chuẩn (ở nhiệt độ 30℃, pH 3,9 – 4,1), thời gian phản ứng 60 phút với nồng độ pectin môi trường phản ứng 0,66%, mức độ thủy phân pectin 30%) có khả xúc tác, làm biến đổi 1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic 2.2 Hóa chất - Dung dịch pectin 1% - Dung dịch ZnSO4 15% - Dung dịch enzyme pectinase 1.5% - Dung dịch Anthrone 0.2% (C6H4COC6H4CH2) acid sulfuric đậm đặc 2.3 Tiến hành - Chuẩn bị ống nghiệm (1 ống thí nghiệm, ống đối chứng) - Cho 2ml dung dịch pectin 1% vào ống nghiệm - Cho 1ml dung dịch enzyme pectinase vào ống thí nghiệm 1ml nước vào ống đối chứng - Lắc ống cho vào tủ ấm nhiệt độ 30℃ (nhiệt độ phòng) - Sau 60 phút lấy thêm vào ống 2ml ZnSO4 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc đem pha loãng 50 lần dùng cho phản ứng với Anthrone - Lấy 2,5ml dung dịch lọc pha loãng ống cho vào ống nghiệm, cho 5ml Anthrone vào ống, lắc mạnh 10 phút Sau đặt ống nồi thủy nhiệt độ 70℃ thời gian 12 phút lấy làm nguội đến nhiệt độ phịng - Pha lỗng dung dịch ống 10 lần (vì màu đậm, đo khơng nên pha loãng dung dịch thêm lần nữa) - Tiến hành đo giá trị OD bước sóng X = 584nm 2.4 Kết Hình 4.1 Trước lọc Hình 4.2 Sau pha lỗng 60 lần Tính hoạt độ: Giá trị đo OD thí nghiệm: ODTN = 0,31 Giá trị đo OD đối chứng: ODĐC = 0,17 ∆𝑂𝐷 = ODTN - ODĐC = 0.31- 0.17 = 0,14 Hoạt tính enzyme pectinase = 0,34 × ∆𝑂𝐷−0,0104 𝑚 = 0,34×0,14−0,0104 = 0,0186 Trong đó: m lượng enzyme lấy để tiến hành phản ứng (g hay ml) 2.5 Kết luận ODTN > ODĐC hoạt tính enzyme pectinase = 0,0186 → Enzyme pectinase có khả xúc tác, làm pectin bị thủy phân cho acid galactorunic Acid galactorunic tác dụng với ZnSO4 dung dịch Anthrone acid sulfuric đậm đặc, tạo kết tủa Ứng dụng enzyme pectinase làm nước ép trái 3.1 Nguyên liệu - Hóa chất - Trái theo mùa (táo) - Dung dịch pectinase 1% 3.2 Tiến hành - Cân 50g táo, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100ml với nước cất - Hút 18ml dung dịch táo cho vào ống nghiệm ống nghiệm khác - Thêm dung dịch pectinase 1% vào ống nghiệm với thể tích ống 0; 0,5; 1; 1,5 ml Đánh dấu ống nghiệm - Sau thêm nước cất vào cho ống cho đủ 20 ml (theo thứ tự ống 2; 1,5; 1; 0,5; ml nước cất ) - Để tất ống nghiệm 50-55 oC 60 phút - Lọc qua giấy lọc, ngâm ống nghiệm đựng dung dịch lọc nước lạnh 10 phút so sánh độ mẫu Giải thích 3.3 Kết Hình 4.3 Nước ép có chứa enzyme Hình 4.4 Nước ép sau qua xử lí nhiệt Hình 4.5 Nước ép sau lọc - Trước lọc: + Ống 1: đục + Ống 2, 3, 4, 5: có cặn ống, độ cặn tăng dần từ ống tới ống - Sau lọc: + Ống 1: đục + Ống 2, 3, 4, 5: suốt, độ tăng dần từ ống tới ống 5, nhiên khác biệt khơng đáng kể 3.4 Giải thích kết luận  Giải thích - Ống 1: Trong táo có chứa pectin làm dung dịch có trạng thái keo, đục khó lọc - Ống 2, 3, 4, 5: Sự có mặt enzyme pectinase, sau đun 50oC thời gian 60 phút phân giải pectin giúp cho trình lọc trở nên dễ dàng Mặt khác, có nồng độ enzyme pectinase khác nhau, sau lọc ống nghiệm có độ khơng q khác biệt  Kết luận - Enzyme pectinase có khả làm nước quả, tăng tốc độ q trình lọc, giúp dịch ép khơng bị vẩn đục trở lại, góp phần tăng hiệu suất thu hồi dịch - Ta nên lựa chọn lượng thấp để hạn chế tồn dư enzyme pectinase nước đồng thời giúp tiết kiệm chi phí sản xuất ứng dụng làm nước trái ép  ... nhiệt độ này, enzyme bảo quản tốt Ở 40 – 500C, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao 500C enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60 – 800C, enzyme khả hoạt động Ở 1000C, enzyme bắt đầu... glutathion nhiều protease thực vật, cystein nhiều loại enzyme có nhóm -SH hoạt động… Chất ức chế chất kìm hãm phản ứng xúc tác enzyme, làm giảm lực enzyme chất làm enzyme khả kết hợp với chất...  Pectin Pecin chất enzyme pectinase Trong thực vật, pectin có vai trị quan trọng tạo thành vách tế bào thực vật, gắn kết tế bào vào diện phức với cellulose, đóng vai trò thành phần chủ yếu lớp