Người lành mang gen bệnh là người mang gen đột biến di truyền lặn ở trạng thái dị hợp tử, không biểu hiện bệnh. Bài viết trình bày xác định tỷ lệ người lành mang gen bệnh của các đột biến gen alpha- và beta-Thalassemia, thiếu hụt citrin, bệnh Wilson và bệnh xơ nang trong các cặp vợ chồng điều trị TTTON.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Y học TỶ LỆ NGƢỜI LÀNH MANG GEN BỆNH ALPHAVÀ BETA-THALASSEMIA, THIẾU HỤT CITRIN, BỆNH WILSON VÀ BỆNH XƠ NANG TRONG CÁC CẶP VỢ CHỒNG CĨ TẦM SỐT TRƢỚC ĐIỀU TRỊ THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Đặng Thị Huyền Trang1, Lưu Thị Minh Tâm1, Phan Thị Kim Anh1, Mã Phạm Quế Mai1, Hồ Mạnh Tường1,2, Vương Thị Ngọc Lan3 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Người lành mang gen bệnh người mang gen đột biến di truyền lặn trạng thái dị hợp tử, không biểu bệnh Chưa có báo cáo tỷ lệ người lành mang gen bệnh alpha- beta-Thalassemia, thiếu hụt citrin, bệnh Wilson bệnh xơ nang cặp vợ chồng người Việt Nam điều trị thụ tinh ống nghiệm (TTTON) Mục tiêu: Xác định tỷ lệ người lành mang gen bệnh đột biến gen alpha- beta-Thalassemia, thiếu hụt citrin, bệnh Wilson bệnh xơ nang cặp vợ chồng điều trị TTTON Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang thực IVFMD, bệnh viện Mỹ Đức, TPHCM Các cặp vợ chồng thực TTTON xét ghiệm tầm soát người lành mang gen bệnh với tên gọi Carrier5, phân tích bệnh lý di truyền: α-Thalassemia, β-Thalassemia, hội chứng thiếu hụt Citrin, hội chứng xơ nang bệnh lý Wilson Cặp vợ chồng mang gen đột biến bệnh lý can thiệp điều trị TTTON kết hợp sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ phát đột biến đơn gen (PGT-M) Kết quả: Từ tháng 04/2020 đến tháng 05/2021 có 321 bệnh nhân thực Carrier5 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh chiếm 43,9% (141/321) cho bệnh lý Tỷ lệ cặp vợ chồng mang gen đột biến bệnh lý 10,5% (15/143) Sau PGT-M, tỷ lệ phôi không mang đột biến đồng hợp lặn 90% Sau chuyển phôi, tỷ lệ hCG 60%, tỷ lệ làm tổ thai lâm sàng 60%, tỷ lệ thai diễn tiến 60% Kết luận: Tầm soát người lành mang gen bệnh kết hợp TTTON PGT-M giúp cặp vợ chồng sinh trẻ khoẻ mạnh, loại bỏ gen đột biến di truyền qua nhiều hệ Từ khoá: người lành mang gen bệnh, tầm soát người lành mang gen bệnh, PGT-M, thụ tinh ống nghiệm (TTTON) ABSTRACT THE PREVALENCE OF CARRIER OF ALPHA- THALASSEMIA, BETA-THALASSEMIA, CITRIN DEFICIENCY, CYSTIC FIBROSIS AND WILSON DISEASE IN AN INFERTILE POPULATION Dang Thi Huyen Trang, Luu Thi Minh Tam, Phan Thi Kim Anh, Ma Pham Que Mai, Ho Manh Tuong, Vuong Thi Ngoc Lan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 26 - No - 2022: 50-57 Background: A carrier is an individual who does not have any overt phenotype for a genetic disorder but may have one variant allele within a gene(s) associated with a diagnosis There has been no report on the prevalence of carriers of apha-, beta-Thalassemia, citrin deficiency, cystic fibrosis and Wilson disease in Vietnamese population Đơn Vị Hỗ Trợ Sinh Sản, Bệnh viện Đa Khoa Mỹ Đức Trung Tâm Nghiên Cứu HOPE, Bệnh viện Đa Khoa Mỹ Đức 3Bộ môn Phụ Sản, Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS Đặng Thị Huyền Trang ĐT: 0963212316 Tác giả liên lạc: TS BS Phạm Diệp Thùy Dương ĐT: 0908143227 50 Email: trang.dth@myduchospital.vn Email: thuyduongpd@ump.edu.vn Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Objectives: To determine the prevalence of carriers of apha-, beta-Thalassemia, citrin deficiency, cystic fibrosis and Wilson disease in an infertile population Methods: A cross-sectional study was carried out at IVFMD, My Duc Hospital The infertile couples had screening using the carrier screening test named “Carrier5” which analysed genetic diseases α-Thalassemia, βThalassemia, Citrin Deficiency, Cystic Fibrosis and Wilson Disease Carrier couples underwent in-vitro fertilization (IVF) treatment with Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disorders (PGT-M) if they carried the same gene mutation Results: Between April 2020 and May 2021, a total 321 patients performed Carrier5 test The carrier rate was 43.9% (141/321) and carrier couple rate was 10.5% (15/143) The homozygous dominant and heterozygous embryo rate was 90% After having IVF and PGT-M treatment, -hCG was 60%, clinical pregnancy rate and on-going pregnancy rate were all 60% Conclusion: Screening for carriers of Carrier5 combined with IVF and PGT-M helps the couples to have healthy babies and eliminates the passing of the gene mutation through generations Keywords: carrier, carrier screening, preimplantation genetic testing for monogeneic disorders (PGT-M), in-vitro fertilization (IVF) mang thai(3) ĐẶT VẤN ĐỀ Chương trình tầm sốt cá thể người lành mang gen bệnh lý di truyền lặn đề cập từ năm 1970 với mục tiêu ban đầu cung cấp thơng tin cho cặp vợ chồng có thai kỳ nguy cao bị ảnh hưởng rối loạn di truyền Mendel đột biến lặn nhiễm sắc thể (NST) thường bệnh lý liên kết NST giới tính X(1) Từ năm 1990 trở đi, việc tầm soát mở rộng thêm cho nhiều bệnh lý khác nhờ tiến kỹ thuật di truyền Chương trình tầm sốt người lành mang gen bệnh khuyến cáo thực nhiều quốc gia, đưa đến đời chiến lược tầm soát mở rộng đa chủng tộc (Expanded Carrier Screening ECS)(2) Đa số cá thể người lành mang gen bệnh đến rối loạn di truyền (trừ trường hợp có tiền sử gia đình trước đó) hầu hết cá thể mang bệnh lý không biểu triệu chứng, trạng thái dị hợp tử Bất thường di truyền có mức độ ảnh hưởng đa dạng, từ nhẹ gần không phát mức nặng nguy hiểm đến tính mạng, người mang bệnh suốt đời phải điều trị với chi phí chăm sóc vơ tốn Bệnh khó chữa, hồn tồn chủ động phịng tránh xét nghiệm sàng lọc trước Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Năm 2015, Hiệp hội Di truyền Y học Hoa Kỳ (American College of Medical Genetics and Genomics – ACMGG), Hiệp hội sản phụ khoa Hoa Kỳ (American College of Obstetricians and Gynecologists - ACOG), Hiệp hội Cố vấn di truyền quốc gia (National Society of Genetic Counselors – NSGC), Hiệp hội y học Bà mẹ thai nhi (Society for Maternal-Fetal Medicine – SMFM) tổ chức chất lượng chu sinh (Perinatal Quality Foundation – PQF) đưa khuyến cáo bệnh lý nên tầm soát Theo đó, bệnh lý cần tầm sốt người lành mang gen bệnh phải thoả yếu tố: gây rối loạn nhận thức, cần can thiệp y khoa đặc biệt hay ảnh hưởng đến chất lượng sống người bệnh Ngoài ra, bệnh lý ảnh hưởng thai kỳ dẫn đến can thiệp đặc biệt trước sinh hay cần chăm sóc đặc biệt sau sinh cần tầm sốt(4) Cũng theo ACOG thời điểm lý tưởng để đánh giá cá thể mang gen trước mang thai nên cân nhắc tất lựa chọn hỗ trợ sản khoa, ví dụ xét nghiệm di truyền phôi tiền làm tổ (Preimplantation Genetic Testing PGT) xin noãn(3) Tiềm ECS thể hiệu lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm giúp cặp vợ chồng người lành mang gen 51 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 bệnh bệnh lý tìm phương pháp can thiệp sớm làm xét nghiệm di truyền phôi tiền làm tổ cho rối loạn đơn gen Theo thống kê Hiệp hội chẩn đoán di truyền tiền làm tổ quốc tế (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society – PGDIS) tỷ lệ thực PGT-M sau có kết ECS tăng từ 35,1% năm 2016 đến 54,6% năm 2018(5) Từ quần thể bệnh nhân thực ESC định PGT-M, giúp can thiệp sớm loại bỏ gen lặn gây bệnh từ phôi giai đoạn sớm tạo từ IVF Năm bệnh lý di truyền có tần suất xuất cao Châu Á ảnh hưởng nặng nề đến sức khoẻ người bệnh thai kỳ tiến hành tầm soát gồm: α-Thalassemia, β-Thalassemia, hội chứng thiếu hụt Citrin (Citrin Deficiency), hội chứng xơ nang (Cystic Fibrosis) bệnh lý Wilson (Wilson disease) Theo cặp vợ chồng người lành mang gen lặn bệnh lý di truyền tư vấn điều trị IVF kết hợp kỹ thuật PGT-M Từ năm 2020, bệnh viện Mỹ Đức, chương trình tầm soát người lành mang gen bệnh loại bệnh di truyền này, tên Carrier5 triển khai thường quy cho bệnh nhân có tiền sử gia đình có gợi ý mang gen bệnh hay bệnh nhân có nguyện vọng thực Chưa có báo cáo Việt Nam tỷ lệ người mang lành mang gen bệnh loại bệnh di truyền Nghiên cứu xác định tỷ lệ người lành mang gen bệnh đột biến gen alpha- beta-Thalassemia, thiếu hụt citrin, bệnh Wilson bệnh xơ nang cặp vợ chồng điều trị TTTON ĐỐI TƢỢNG- phƣơng phápNGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Các cặp vợ chồng điều trị TTTON thực tầm soát Carrier5 (gồm bệnh αThalassemia, β-Thalassemia, hội chứng thiếu hụt Citrin, hội chứng xơ nang bệnh lý Wilson) Nghiên cứu thực đơn vị hỗ trợ sinh sản bệnh viện Mỹ Đức TP HCM, từ tháng 04 năm 2020 đến tháng 05 năm 2021 52 Nghiên cứu Y học Phƣơng pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang Cỡ mẫu Cỡ mẫu xác định theo công thức tính tỷ lệ quần thể Với ước tính cho tỉ lệ lưu hành với ước số khơng 6% so với tỉ lệ bệnh thật toàn dân số Các nghiên cứu trước cho thấy tỉ lệ lưu hành bệnh khoảng 40% khoảng tin cậy 95% số lượng người tối thiểu cần khảo sát 256 người Để đề phòng trường hợp mẫu, cỡ mẫu ước tính tăng 10%, số người tối thiểu cần tham gia nghiên cứu 281 người Cách chọn mẫu Chọn mẫu toàn Phương pháp tiến hành Cặp vợ chồng tư vấn việc thu thập số liệu liên quan đến nghiên cứu, đồng ý tham gia nghiên cứu, cặp vợ chồng ký cam kết đồng thuận tham gia nghiên cứu Sau đó, cặp vợ chồng thực tầm soát Carrier5 Xét nghiệm Carrier5: Bệnh nhân thu 2ml máu ngoại vi cho vào ống EDTA chống đông gửi đến công ty phân tích di truyền HopeGene 24 - 48 4℃ DNA máu tách chiết chuẩn bị thư viện giải trình tự kit New England Biolabs (Hoa Kì) Các phân mảnh DNA vùng gen mục tiêu làm giàu sử dụng mẫu dị đặc hiệu IDTDNA (Hoa Kì), sau giải trình tự hệ thống giải trình tự hệ NextSeq, Illumina (Hoa Kì) với độ phủ trung bình khoảng 100X Tối thiểu 95% vùng gen mục tiêu có độ phủ 10X Kết giải trình tự so sánh với gen tham chiếu GRCh38 để xác định biến thể di truyền Dựa sở liệu di truyền có (bao gồm liệu 1000 gen, ESP), biến thể với tần suất 1% quần thể tiếp tục phân lớp Các biến thể phân loại dựa sở liệu ClinVar Viện sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ (US National Institutes of Health) cập nhật tới thời điểm trả kết Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Chỉ biến thể gây bệnh (còn gọi đột biến gây bệnh) thông báo phần trả kết Kết cho biết bệnh nhân có hay không mang gen đột biến gen bệnh lý gói xét nghiệm Carrier5 Cặp vợ chồng xác nhận người lành mang gen bệnh bệnh lý di truyền tư vấn điều trị thụ tinh ống nghiệm kết hợp thực kỹ thuật PGT-M sau Chọn lựa phơi chuyển theo dõi thai kỳ: Dựa vào kết di truyền phôi, bệnh nhân bác sỹ tư vấn thứ tự ưu tiên chọn lựa phôi để chuyển Theo đó, phơi khơng mang gen bệnh hay trạng thái dị hợp tử sử dụng để chuyển vào buồng tử cung người vợ Sau chuyển phôi 14 ngày, bệnh nhân thử thai theo dõi thai kỳ thường quy có thai Thụ tinh ống nghiệm PGT-M: Vào ngày hay ngày chu kỳ kinh, người vợ kích thích buồng trứng thuốc nội tiết ngoại sinh Khi có nang nỗn với kích thước 17mm trở lên, bệnh nhân tiêm thuốc khởi động trưởng thành noãn Cụm noãn thu nhận thơng qua chọc hút lúc 36 sau Nỗn trưởng thành thực kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection - ICSI) nuôi cấy điều kiện 37 , 6% CO2, 5%O2 đến giai đoạn ngày tiến hành đánh giá chất lượng, chọn lựa phôi sinh thiết Mỗi phôi thu nhận khoảng 5-10 tế bào nuôi phôi (Trophectoderm - TE) rửa cho vào ống PCR có chứa 25 PBS (dung dịch đệm phosphate) kí hiệu riêng mã số cho bệnh nhân phôi riêng biệt Các tube PCR bảo quản giá đỡ lạnh -80 vận chuyển trung tâm phân tích di truyền Phôi đông lạnh sau sinh thiết chờ kết phân tích di truyền Kết cục nghiên cứu Kết cục chính: Tỷ lệ người lành mang gen bệnh sau thực tầm soát Carrier5 Kết cục phụ: Kết cục điều trị TTTON PGT-M trường hợp cặp vợ chồng có mang đột biến gen gây bệnh xét nghiệm Carrier5 Phân tích di truyền phơi: Các tế bào phôi phá vỡ màng tế bào, khuếch đại gen (Whole Genome Amplification – WGA) kit Picoplex WGA (Takara Bio, Hoa Kỳ) Dữ liệu WGA phân tích bước hệ thống NextSeq NGS, Illumina, Hoa Kỳ Kết phân tích giúp xác định tình trạng bất thường số lượng hay cấu trúc hay khảm NST Sau có kết phơi ngun bội sau bước liệu WGA tiếp tục phân tích bước giúp phát đột biến đơn gen phôi Kết di truyền bệnh nhân chuyển trung tâm hỗ trợ sinh sản Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Quản lý xử lý số liệu Các số liệu phân tích gồm tỷ lệ người lành mang gen bệnh tổng số bệnh nhân thực Carrier5, tỷ lệ người lành mang gen bệnh phân bổ theo bệnh lý, tỷ lệ bệnh nhân thực PGT-M, số noãn chọc hút, số noãn trưởng thành, số noãn thụ tinh, số phôi tốt ngày 5/6, số phôi sinh thiết, tỷ lệ phôi nguyên bội, tỷ lệ phôi lệch bội, tỷ lệ phôi bất thường cấu trúc NST/tỷ lệ phôi khảm, tỷ lệ phôi đồng hợp lặn, tỷ lệ phôi không mang đồng hợp lặn, tỷ lệ betahCG, tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ thai lâm sàng, tỷ lệ thai diễn tiến Các số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn hay dạng phần trăm Sự khác biệt giá trị trung bình kiểm định Student’s t-test cho liệu theo luật phân phối chuẩn, giá trị phần trăm kiểm định khác biệt Chi-square test, khác biệt có ý nghĩa thống kê xác định p