GIÁO TRÌNH KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH (DÙNG CHO ðÀO TẠO CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM)

LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 BỘ Y TẾ GIÁO TRÌNH KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH (DÙNG CHO ðÀO TẠO CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM) Mà SỐ: ðK.01.Z.15 NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC HÀ NỘI – 2008 Chỉ ñạo biên soạn: VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO – BỘ Y TẾ file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 Chủ biên: PGS TS LÊ THỊ XUÂN Những người biên soạn: CN VÕ THỊ MỸ DUNG CN NGUYỄN THỊ HIỆN CN TRỊNH TUYẾT HUỆ CN NGUYỄN HỒ PHƯƠNG LIÊN PGS.TS LÊ THỊ XUÂN Tham gia tổ chức thảo: ThS PHÍ VĂN THÂM TS NGUYỄN MẠNH PHA LỜI GIỚI THIỆU Thực số ñiều Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & ðào tạo Bộ Y tế ñã ban hành chương trình khung đào tạo Cử nhân xét nghiệm Bộ Y tế tổ chức biên soạn tài liệu dạy – học môn sở chuyên môn theo chương trình nhằm bước xây dựng sách đạt chuẩn chun mơn cơng tác đào tạo nhân lực y tế Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH biên soạn dựa vào chương trình giáo dục Trường ðại học Y Dược TP Hồ Chí Minh sở chương trình khung phê duyệt Giáo trình PGS.TS Lê Thị Xn (Chủ biên), CN Võ Thị Mỹ Dung, CN Nguyễn Thị Hiện, CN Trịnh Tuyết Huệ, CN Nguyễn Hồ Phương Liên biên soạn theo phương châm: kiến thức bản, hệ thống; nội dung xác, khoa học; cập nhật tiến khoa học, kỹ thuật ñại thực tiễn Việt Nam file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH Hội đồng chun mơn thẩm định sách tài liệu dạy – học chuyên ngành Cử nhân xét nghiệm Bộ Y tế thẩm ñịnh năm 2008 Bộ Y tế ñịnh ban hành tài liệu dạy – học ñạt chuẩn chuyên mơn ngành giai đoạn Trong thời gian từ ñến năm, sách phải ñược chỉnh lý, bổ sung cập nhật Bộ Y tế chân thành cảm ơn tác giả Hội ñồng chuyên mơn thẩm định giúp hồn thành sách; cảm ơn PGS.TS Vũ ðức Chính, PGS.TS Hồng Tân Dần ñọc phản biện ñể sách sớm hoàn thành, kịp thời phục vụ cho cơng tác đào tạo nhân lực y tế Lần đầu xuất bản, chúng tơi mong nhận ý kiến đóng góp đồng nghiệp, bạn sinh viên ñộc giả ñể lần xuất sau sách hồn thiện VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO – BỘ Y TẾ LỜI NÓI ðẦU Giáo trình Ký sinh trùng thực hành biên soạn cho sinh viên khoa Kỹ thuật Y học có mục đích hướng dẫn cho sinh viên học mơn Ký sinh trùng nhằm hồn thiện khả chẩn đốn dựa số thông tin lâm sàng xét nghiệm bệnh phẩm cách xem kính hiển vi, cấy Một số kỹ thuật miễn dịch ñược ñề cập đến Giáo trình gồm có ba phần: Phần một: Phần kỹ thuật trình bày kỹ thuật xét nghiệm bao gồm phương pháp thu thập, bảo quản, xử lý bệnh phẩm Phần hai: ðịnh danh, gồm hình ảnh ký sinh trùng vi nấm gây bệnh thường gặp nước ta Ngoài việc sinh viên phải nắm vững kỹ thuật ñược giới thiệu, ñiều quan tâm sinh viên phải biết ñược ưu, nhược ñiểm phương pháp ñược chọn, phải hiểu ích lợi hạn chế Sinh viên cần phải biết lựa chọn phương pháp chẩn đốn phù hợp với loại ký sinh trùng loại bệnh phẩm Nội dung kỹ thuật trình bày giáo trình khơng ñược ñầy ñủ, chứa ñựng phương pháp phổ biến đủ dùng cho phịng xét nghiệm lâm sàng nước ta Trong giáo trình này, chúng tơi cố gắng trình bày ñiểm ñặc trưng hình thể ñể phân biệt ký sinh trùng giải thích làm để xác ñịnh chúng Phần ba: Phụ lục, giới thiệu hóa chất thường dùng xét nghiệm ký sinh trùng ñường ruột; hóa chất, thuốc nhuộm mơi trường xét nghiệm nấm Những hình ảnh minh họa, khơng hồn chỉnh đầy đủ số lượng chất lượng, cung cấp cách khái quát hình thái ký sinh trùng vi nấm kỹ thuật phát chúng Các tác giả người làm việc phịng thí nghiệm nhiều năm qua có kinh nghiệm giảng dạy môn Ký sinh trùng, hy vọng sách cung cấp thơng tin có giá trị cho sinh viên nhằm giúp họ có kiến thức thực tiễn chẩn đốn ký sinh trùng, giúp cho việc phịng, chữa bệnh đạt hiệu Do trình độ thời gian có hạn, chúng tơi khơng tránh khỏi thiếu sót chun mơn in ấn, mong nhận góp ý sinh viên đồng nghiệp để lần xuất sau giáo trình ñược hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 CÁC TÁC GIẢ PHẦN MỘT KỸ THUẬT Bài CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 ða số ký sinh trùng (KST) nhận thấy mắt thường mà cần có dụng cụ quang học để phóng đại chúng lên kính lúp, kính hiển vi Tùy theo yêu cầu kỹ thuật, kính hiển vi cịn cần có phụ tùng để đo kích thước KST, tụ quang đen,… NHẮC LẠI CẤU TRÚC CỦA KÍNH HIỂN VI Kính hiển vi cơng cụ thường dùng quan trọng phòng xét nghiệm KST Kính hiển vi có hình dạng khác tùy theo mẫu sản xuất, cấu tạo giống nhau, gồm có phận:
Thị kính thấu kính nằm phía để mắt nhìn ảnh qua vật kính Có loại thị kính x5, x10, x15; loại x10 thường dùng nhiều  Ống kính ống mà ánh sáng phải qua từ vật kính đến thị kính có chức giữ thị kính vật kính nằm cách khoảng ñịnh  ðĩa mang vật kính phận có lỗ để gắn vật kính, xoay đưa vật kính cần sử dụng vào ống kính  Vật kính: ánh sáng qua vật quan sát đến thấu kính Có loại vật kính, thường dùng loại: – Vật kính x10: có thị trường lớn nhất, sau ñiều chỉnh ñể thấy rõ mẫu vật, vật kính thường cách kính mang vật khoảng 16mm – Vật kính x 40: có độ phóng đại trung bình, sau ñiều chỉnh ñể thấy rõ mẫu vật, vật kính thường cách kính mang vật khoảng 4mm – Vật kính x100: có độ phóng đại lớn nhất, sau điều chỉnh để thấy rõ mẫu vật, vật kính thường cách kính mang vật khoảng 1mm Sử dụng vật kính với dầu soi kính dùng ốc vi cấp để ñiều chỉnh  Kính tụ quang: tập trung ánh sáng  Màng chắn ánh sáng: ñể cho ánh sáng qua nhiều hay để vào vật kính  Gương trịn dùng để lấy ánh sáng, thường có mặt: – Mặt lõm: sử dụng vật kính x10, x40 – Mặt phẳng: sử dụng vật kính x100 Những loại kính dùng ánh sáng bóng đèn gắn thân máy khơng có gương  Tiểu xa: dùng để giữ tiêu gắn với trục có ốc dùng ñể di chuyển sang trái, sang phải ốc dùng để di chuyển phía trước, sau Thân kính mang ống kính, bàn mang mẫu vật, kính tụ quang, ốc vi cấp, ốc thứ cấp gương Chân: có chức giữ cho kính vững ổn ñịnh file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 Cấu tạo kính hiển vi quang học CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI
ðặt tiêu lên bàn mang tiêu  ðiều chỉnh ánh sáng với gương trịn, kính tụ quang chắn sáng  Xoay trục mang vật kính x10 vào vị trí  Vặn ốc thứ cấp để thấy rõ vật  Nếu cần quan sát với độ phóng đại lớn đổi qua vật kính lớn x40, dùng ốc vi cấp ñể ñiều chỉnh ñến thấy rõ vật Khi sử dụng vật kính x100, ta phải dùng dầu soi kính Nhỏ giọt dầu lên tiêu đổi qua vật kính x100 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
ðặt kính hiển vi chỗ, xa nóng chỗ ẩm ướt  Cầm kính hiển vi thân kính, tay đỡ chân kính Phải để đứng kính hiển vi, khơng để kính nghiêng  Cẩn thận khơng làm rơi chất ăn mịn hay dung dịch lên bàn kính  Khơng để tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi  Lau thị kính vật kính giấy lau kính trước sau dùng Khi soi với vật kính dầu, thấm giấy lau kính với giọt xylen để lau vật kính Sau lau với xylen, phải lau khơ giấy lau kính, khơng xylen làm bong thấu kính gắn vật kính  Trước cất kính hiển vi, ñể vật kính nhỏ vị trí quan sát hạ thấp ống kính ốc lớn Vặn nhẹ nhàng, ñừng ấn mạnh ống kính Nếu cẩn thận hơn, hạ tụ quang kính xuống Nếu tụ quang kính bẩn, lau giấy lau kính khơ file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218  ðể gương nghiêng, mặt phẳng phía ngồi để tránh bụi  Che kính hiển vi bao kính Cất kính vào chỗ kính, để lui vào phía trong, đừng để mấp mé phía ngồi CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Trình bày cách sử dụng kính hiển vi để quan sát mẫu phân tươi Khi sử dụng kính hiển vi ñể soi lam máu, anh (chị) cần ý đến yếu tố để nhìn thấy rõ KST sốt rét (KST SR) phết máu nhuộm? Sau soi lam máu tìm KST SR, anh (chị) bảo quản kính hiển vi trước cất vào tủ kính? Bài CÁCH CHUẨN ðỘ KÍNH HIỂN VI Xác định lồi KST cần dựa vào nhiều tiêu chuẩn, có tiêu chuẩn kích thước KST Ta ước lượng kích thước KST cách so sánh với vật biết kích thước trước hồng cầu, cách không cho ta kết xác ðể đo xác kích thước KST, ta dùng thước trắc vi đặt thị kính DỤNG CỤ – Kính hiển vi mắt với vật kính x 10, x 40, x 100 – Dầu – Giấy lau kính – Thước trắc vi thị kính (chia thành 50 đơn vị) – Thước trắc vi với ñộ chia 0,1 0,01mm – Thị kính (nên sử dụng thị kính x10): + Thước trắc vi có kích thước lam kính bình thường có gạch cách 0,1 0,01mm + Thước trắc vi đặt thị kính ñường thẳng ñược chia thành 50 vạch Tùy theo độ phóng đại vật kính, vạch có số ño khác file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 QUY TRÌNH KỸ THUẬT
Tháo thị kính đặt thước trắc vi thị kính vào (mặt khắc vạch hướng xuống dưới) ðặt thị kính trở lại vị trí cũ  ðặt thước trắc vi lên bàn kính hiển vi  Di chuyển bàn kính cho thước nằm chồng lên nhau, vạch thước trắc vi thị kính trùng với vạch thước trắc vi  Nhìn phía bên phải vạch thước trắc vi ñể tìm điểm mà vạch thước trắc vi thị kính trùng với vạch thước trắc vi nền, ñiểm trùng gọi ñiểm Y Khoảng cách thay đổi tùy theo vật kính sử dụng (x10, x40, x100)  ðếm số vạch chia thước trắc vi thị kính, từ số đến vạch trùng lắp (Y) ðếm số vạch chia (0,1mm) thước trắc vi từ vạch đến vạch trùng lắp (Y), Tính ñoạn ñếm ñược thước trắc vi thị kính theo cơng thức sau: N = Số vạch đếm thước trắc vi (mm) n = Số vạch ñếm ñược thước trắc vi thị kính (mm) Ví dụ: Ở vật kính x10, ta có N = 0,3mm, n = 40 file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page of 218 Ví dụ: ðo chiều dài trứng giun kim ðặt tiêu lên bàn kính, quan sát trứng với vật kính ×10, chiều dài trứng giun kim tương ứng với khoảng chia thước trắc vi thị kính Ta có đơn vị thị kính vật kính x10 7,5mm, chiều dài trứng giun kim 7,5mm x = 60mm Lưu ý: – Mỗi độ phóng đại vật kính (x10, x40 x100) có đơn vị thị kính khác nhau, vạch thước trắc vi thay đổi kích thước vạch thước trắc vi thị kính trì kích thước cũ Vì vậy, cần phải chuẩn độ cho loại vật kính ghi lại đơn vị lên kính tờ giấy dán gần kính để dễ tra cứu – Khi muốn có số đo KST cần nhân số vạch đo với đơn vị thị kính để có kích thước thật – Sau vật kính chuẩn độ, ta khơng trao đổi thị kính chứa thước trắc vi vật kính kính hiển vi với thị kính vật kính kính hiển vi khác Phải sử dụng vật kính thị kính ñã ñược chuẩn ñộ – Nên chuẩn ñộ ñịnh kỳ ñể bảo ñảm tính xác CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Tạo cần phải biết kích thước KST? Trình bày cách tính đơn vị thị kính Làm để đo kích thước trứng giun ñũa? Bài THU THẬP VÀ BẢO QUẢN PHÂN ðỂ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 10 of 218 THU THẬP BỆNH PHẨM Có nhiều phương pháp lấy bệnh phẩm, việc định chọn phương pháp dựa vào giá trị giới hạn phương pháp Nếu bệnh phẩm khơng lấy xử lý ñúng yêu cầu kỹ thuật, khơng phát mầm bệnh 1.1 Chuẩn bị bệnh nhân trước lấy phân Nhiều kết xét nghiệm phân âm giả tạo bệnh nhân khơng hướng dẫn đầy đủ hay hướng dẫn khơng cách Phải hướng dẫn bệnh nhân cách cẩn thận; tốt phịng thí nghiệm đưa cho bác sĩ ñiều trị in sẵn chi tiết cần thiết ñể phát cho bệnh nhân ñược ñịnh xét nghiệm phân Dặn bệnh nhân ngày trước lấy bệnh phẩm, tránh dùng loại thuốc thực phẩm làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như: – Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuốc đặt vào hậu mơn có dầu, mỡ – Thực phẩm nhiều cặn bã: ngũ cốc, bắp cải, salad, có nhiều hạt nhỏ, nhiều chất béo, dầu, mỡ Bệnh nhân nên ăn chế độ chất bã như: bánh, ñồ ăn loãng, trứng, sữa, gan,… 1.2 Lấy bệnh phẩm 1.2.1 Tại phòng xét nghiệm Tốt nên lấy phân phịng xét nghiệm – Lọ đựng phân: + Cần phải khô sạch, nhựa giấy carton khơng thấm nước thủy tinh + Có miệng rộng, nắp vặn chặt + Có dán nhãn để ghi họ, tên, tuổi, ñịa bệnh nhân ghi ngày, lấy bệnh phẩm – Cách lấy phân: + Có thể lấy chỗ khn phân để tìm trứng giun, sán Nhưng để phát đơn bào, nên lấy phân chỗ bất thường máu, nhày, lỏng, bọt lấy phân trực tràng + Khơng lấy phân lẫn với nước tiểu, dầu, chất muối Mg, Al, Ba, Bi, Fe chất ñó làm biến dạng ñơn bào + Nếu cho bệnh nhân uống thuốc xổ, nên cho uống sulfat natri lấy phân bệnh nhân ngồi lần thứ hai hay thứ ba sau uống thuốc – Lượng phân cần lấy: + Thay ñổi tùy theo mục ñích kỹ thuật xét nghiệm, thường cần khoảng – 10 gam phân (khoảng hạt lạc) ñể đủ làm nhiều phương pháp + Trong số trường hợp tìm giun, đốt sán, bệnh tiêu hố phải lấy tồn số lượng phân thải để thấy KST màng nhày hay mơ bì bị tróc với phân file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 11 of 218 1.2.2 Ngồi phịng xét nghiệm Lấy phân ngồi phịng xét nghiệm điều bất đắc dĩ, cần tơn trọng ngun tắc sau: – Phải gửi đến phịng xét nghiệm thời gian ngắn nhất, ñặc biệt ñơn bào, phân phải ñược giữ ấm – Không ñược giữ nhiệt ñộ lạnh – Nếu xa: giữ hộp phân nước ấm 37oC ñồng thời lấy chút phân cho vào dung dịch cố ñịnh: + MIF: Merthiolate Iod Formol PVA: Polyvinyl Alcohol F2AM: Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene 1.3 Thời gian xét nghiệm phân Sau thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, sớm tốt Thời gian từ lấy mẫu ñến khảo sát: – Phân bình thường cần xét nghiệm vịng 12 – 24 để – ngày tủ lạnh – Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày máu cần phải xem vòng 30 phút sau lấy Trong trường hợp sau lấy phân mà chưa xét nghiệm lấy phân nhà xa, nên bảo quản phân cách để phân dung dịch định hình (fixative) để trứng giun, sán khơng phát triển, đơn bào khơng bị thối hóa HĨA CHẤT BẢO QUẢN PHÂN – ðể bảo quản hình thể ngăn phát triển tiếp tục trứng ấu trùng giun, sán, phân ñược ñựng chất bảo quản sau lấy (bệnh nhân lấy) phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm – Một số chất cố ñịnh ñược ưa dùng là: formol, sodium acetat–acetic acid–formol (SAF), dung dịch Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA) – Khi chọn phương pháp cố ñịnh, phải ñảm bảo chất cố ñịnh ñược chọn phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm làm Vì chất cố định có tính chất riêng, khơng thể dùng cho tất loại kỹ thuật xét nghiệm 2.1 Formol Formol đặc biệt thích hợp để cố định ấu trùng giun, sán bào nang ñơn bào Hai nồng ñộ thường dùng 5% cho bào nang ñơn bào 10% cho trứng ấu trùng giun, sán ðể giữ hình dạng đơn bào tốt, nên pha lỗng formol với dung dịch đệm phosphat, tạo thành formol trung hòa Ghi chú: Formaldehyd bán thị trường thường 37 – 40% HCHO, nhiên ñược xem 100% Bào nang ñơn bào, trứng nang trùng bào tử, trứng giun, sán ấu trùng ñược bảo quản lâu dài formol 10% Formol nóng (60OC) dùng bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì formol lạnh, vài loại trứng dày tiếp tục phát triển, gây nhiễm sống thời gian dài) Lấy vài gram phân trộn kỹ dung dịch formol – 10% Ưu ñiểm: – Cố ñịnh toàn phân – Pha chế dễ, bảo quản lâu – Cặn lắng làm thử nghiệm miễn dịch file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 12 of 218 Nhược điểm: – Khơng bảo quản thể hoạt động – Hình dạng KST khơng đẹp phết nhuộm cố định 2.2 Sodium acetat – acetic acid formol (SAF) SAF ñược dùng ñể bảo quản trứng ấu trùng giun, sán, bào nang thể hoạt ñộng ñơn bào, trứng nang trùng bào tử bào tử Microsporidia Bệnh phẩm cố ñịnh SAF ñều dùng ñược với phương pháp tập trung phân làm phết nhuộm cố ñịnh Khi làm phết phân ñể nhuộm, nên trộn thêm albumin vào phân ñể tăng độ dính bệnh phẩm vào lam kính SAF ñược coi chất cố ñịnh mềm thủy ngân clorua Hình dạng KST khơng sắc nét cố định dung dịch có thủy ngân clorua Kết hợp cố định SAF với nhuộm hematoxylin sắt cho hình dạng tốt nhuộm Trichrome – Thành phần: Pha chế Albumin Mayer: trộn thể tích lịng trắng trứng với thể tích glycerin Cho giọt hỗn hợp lên lam kính, cho thêm giọt cặn lắng phân SAF, trộn đều, để khơ nhiệt độ phịng 30 phút nhuộm Ưu ñiểm: – Dùng cho tiêu tập trung cố định – Khơng có hợp chất thủy ngân – Dễ pha chế, bảo quản lâu – Cặn lắng làm kỹ thuật miễn dịch men Nhược điểm: Bệnh phẩm bám vào lam kính 2.3 Dung dịch Schaudinn ðược dùng với phân tươi bệnh phẩm niêm mạc ruột, dùng cho tiêu nhuộm cố ñịnh phương pháp tập trung Cách pha chế: Dung dịch thủy ngân clorua bão hoà: Dùng cốc để chưng, đun sơi đến thủy ngân clorua tan ðể yên vài ñến tạo tinh thể Dung dịch cố ñịnh Schaudinn (dung dịch mẹ): Thêm 5ml acid acetic lạnh vào 100ml dung dịch mẹ sử dụng Ưu ñiểm: – Cố ñịnh tiêu từ mẫu phân tươi niêm mạc ruột file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 13 of 218 – Bảo quản tốt thể hoạt ñộng bào nang ñơn bào Nhược ñiểm: – Không khuyến cáo dùng phương pháp tập trung – Dung dịch có chứa thủy ngân clorua, nên đặt vấn đề xử lý nước thải – Ít dính với bệnh phẩm lỏng nhày 2.4 Polyvinyl alcohol (PVA) PVA nhựa dẻo phối hợp với dung dịch cố định Schaudinn Bột PVA dùng chất dính cho bệnh phẩm phân hỗn hợp phân – PVA trải lam kính, cịn việc cố định dung dịch Schaudinn Dung dịch cố ñịnh PVA ñược dùng ñể bảo quản tất thể KST ñường ruột, bào nang thể hoạt ñộng ñơn bào cho kỹ thuật chuyên sâu PVA ñược dùng ñể cố ñịnh bệnh phẩm cần gửi qua bưu điện đến phịng thí nghiệm chun sâu, tốt với bệnh phẩm lỏng pha theo tỷ lệ phần PVA với phần phân Cách pha chế: Trộn dịch lỏng vào cốc 500ml, thêm bột PVA vào (khơng khuấy) ðậy cốc đĩa Petri lớn, giấy sáp kim loại, ñể qua ñêm ðun từ từ ñến 75oC, lấy cốc khuấy khoảng 30 phút đến có dung dịch đồng sữa Ưu điểm: – Có thể làm tiêu cố ñịnh phương pháp tập trung – Bảo quản tốt bào nang thể hoạt ñộng ñơn bào – Bảo quản lâu (hàng năm) lọ kín nhiệt độ phịng – Bệnh phẩm gửi bưu điện đến phịng thí nghiệm chun sâu – Trứng Trichuris trichura bào nang Giardia lambia phương pháp tập trung dễ nhận phương pháp formol–ether Nhược ñiểm: – Hình dạng ấu trùng Strongyloides stercoralis khơng đẹp cố định formol Trứng nang Isospora belli khơng quan sát (formol tốt hơn) – Dung dịch có chứa thủy ngân, nên đặt vấn đề xử lý nước thải – Có thể trở nên trắng sệt nước hay làm lạnh – Khó pha chế phịng thí nghiệm – Khơng thể dùng tiêu ñể làm kỹ thuật miễn dịch men 2.5 PVA cải tiến PVA cải tiến khơng chứa thủy ngân, mà thay vào người ta dùng sulfat đồng sulfat kẽm Sulfat đồng khơng cho kết tốt thủy ngân clorua Sulfat kẽm ñược dùng nhuộm Trichrome Ưu ñiểm: – Dùng ñược cho phết nhuộm cố ñịnh phương pháp tập trung – Không chứa thủy ngân – Cố ñịnh sulfat kẽm cho kết tốt nhiều người thích dùng PVA có chứa sulfat kẽm file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 14 of 218 sulfat đồng Nhược điểm: – Hình dạng bào nang thể hoạt động đơn bào khó thấy cố ñịnh sulfat ñồng, ñặc biệt so sánh với thủy ngân clorua – ðặc ñiểm cấu tạo đơn bào nhuộm khơng ổn định: rõ, khơng rõ Vì vậy, việc định danh gặp khó khăn, đặc biệt bào nang ñơn bào nhỏ Endolimax nana KỸ THUẬT LƯU GIỮ KÝ SINH TRÙNG TRONG BỆNH PHẨM Giữ bệnh phẩm 40oC, giữ trứng giun, sán bào nang ñơn bào nhiều ngày, nhiều tuần mà định danh dễ dàng Muốn giữ lâu phải dùng dung dịch định hình 3.1 Trứng, ấu trùng giun, sán bào nang ñơn bào a) Lưu giữ tiêu làm từ phân ướt – ðể tránh loang phải dùng lam kính sạch, rửa mỡ dung dịch đồng thể tích cồn – ether – ðể tránh khô tiếp xúc với khơng khí, khơng bay hơi, người ta hàn tiêu bằng: + Vaselin: mẫu không giữ lâu vài giờ, dùng ñể quan sát KST sống + Paraffine: Loại paraffine dùng cho mơ học, hơ nóng chảy hay để tủ ấm 56oC Phương pháp dễ thực tiêu dễ bị vỡ va chạm + Thuốc sơn móng tay: * Phải để tiêu bốc hơi, khơ bớt viền hàn, ấn xem cịn hở khơng Sau hàn lần thứ để khơ Phương pháp giản dị khơng cần dụng cụ đặc biệt * Nếu hàn kín, mẫu lưu giữ tốt, trứng giun, sán nguyên vẹn; ngược lại bào nang dạng hoạt động lưu giữ khơng tốt b) Lưu giữ KST lâu dài Dùng dung dịch formol mà nồng ñộ tùy thuộc vào ñộ cứng phân (phân rắn dùng formol 5%; phân sệt: formol 10%), phân có trứng giun có sức chịu đựng cao (20%, F2AM) – Quy trình thực hiện:
Cho phân vào dung dịch cố ñịnh theo thể tích: thể tích phân + thể tích dung dịch bảo quản  Nghiền ñều, lược qua lưới kim loại ñể loại cặn bã lớn  ðể phút bình thủy tinh có chân để loại trừ phần tử nặng  ðổ phần vào chai có nút có nhãn  Ghi KST có mẫu, ngày lấy mẫu, nồng ñộ dung dịch cố ñịnh + KST ñược giữ tốt cặn lắng chai + ðể làm giảm bốc formol, thêm vào dung dịch bảo quản 10% glycerine ðối với dạng hoạt động amíp + Dùng dung dịch cố ñịnh lưu giữ kể trên, dung dịch formol 10% giữ amíp vài tuần, sau amíp bị ly giải + Dung dịch MIF: dung dịch ñắt tiền giữ ñược dạng hoạt ñộng amíp nhiều năm + Dung dịch PVA: giữ ñược dạng hoạt động amíp làm phết nhuộm Hematoxyline sắt ðối với dạng hoạt ñộng trùng roi ñường ruột: file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 15 of 218 Những cách kể dùng khơng tốt dạng hoạt động thường thu trịn lại, khơng thấy ñược quan sát trực tiếp Dung dịch tương ñối tốt MIF, F2AM 3.2 Giun, sán trưởng thành a) Giun, sán tìm thấy chết phân – Ít có giá trị chúng thường bị hủy hoại – Hóa chất thường dùng formol 5% cồn ethylic 700 b) Giun, sán sống phân – Rửa nước muối sinh lý – Phương thức cố ñịnh thay ñổi tùy theo loại giun, sán: + Giun: * Lấy giun khỏi nước rửa ñể hộp Petri hay bát sứ * ðổ cồn ethylic 700 sơi (đun sơi cồn bình Erlenmeyer có khuấy từ) Cách cố ñịnh làm giãn giun * Giữ bình thủy tinh có nút mài Khơng đậy nút bấc hay cao su làm hư mẫu mau chóng Lưu ý: * Khơng cố định cồn lạnh * Khơng làm chết giun NaCl 0,85% * Không dùng dung dịch formol + Sán dây sán lá: * Kẹp sán lam kính trạng thái trải rộng, để hộp Petri lớn * Cho dung dịch cố định: •Cồn ethylic 700 sơi • Dung dịch đồng thể tích dung dịch formol 10% cồn 700 sôi Ngâm sán tối thiểu nửa lấy sán Lưu mẫu: * Bỏ dung dịch cố ñịnh * Lưu mẫu cồn 700, chai thủy tinh nút mài nút cao su c) Loại giun có kích thước nhỏ – ðể lô giun ống nghiệm chứa cồn ethylic 700, đậy nút bơng gịn khơng thấm nước, bao miệng – Phải dán nhãn, viết ngày bút mực tàu, bút mỡ – ðể lơ vào bình có nắp, lót bơng thấm nước, đổ đầy cồn ethylic 700, đậy nắp Tránh cồn bay (nắp phải có vịng cao su) 3.3 Những ñiều cần biết lưu giữ KST lâu dài – Giun ñộ màu tự nhiên: bị cố ñịnh trở nên ñục trắng giữ ñược lâu cồn – Trứng giun, sán dễ nhận khơng giống hệt phân tươi Vài loại trứng trứng giun ñũa, trứng giun móc bị phân bào dung dịch cố định khơng đủ nồng độ (dạng phân bào không file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 16 of 218 gặp phân tươi) – Bào nang ñơn bào dạng tươi nhân có màu Sau thời gian lưu, nhân không nhuộm màu lại rõ trạng thái tươi – Dạng hoạt động amíp nhanh chóng độ chiết quang dung dịch formol – Trong MIF, amíp khơng bị ly giải, nhận dễ Ngược lại, sau ñể lam kính ñậy kính, màu chúng biến mất, khơng thể dùng làm mẫu để lâu dài lam kính kính CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Thế thu thập phân ñúng quy cách? ðối với anh (chị), điều quan trọng khâu thu thập phân? Theo anh (chị) nay, phòng xét nghiệm nước ta có trọng đến việc lấy bệnh phẩm? kết việc có/khơng trọng đến việc lấy bệnh phẩm gì? Bảo quản bệnh phẩm có ích lợi gì? Nêu tên hóa chất bảo quản phân thường ñược dùng, cho biết ưu nhược ñiểm hóa chất bảo quản ñược nêu Cách bảo quản ñơn bào khác với cách bảo quản giun, sán nào? Hóa chất bảo quản có ảnh hưởng đến KST KST ngâm thời gian lâu dài? Bài KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 17 of 218 I ðẠI CƯƠNG Trong phòng xét nghiệm, nhận bệnh phẩm, phân tươi khơng có chất bảo quản, cần quan sát mắt (đại thể) trước để có nhận xét sơ mẫu phân, ghi nhận đặc tính mẫu phân, phân loại bệnh phẩm ñể xét nghiệm: mẫu phân lỏng, có chất nhày, máu phải xét nghiệm Khơng nên để phân ngồi trời, khơng có nắp ñậy; không nên ñể lọ phân phiếu xét nghiệm ñể dồn mẫu vào cuối buổi xét nghiệm ðối với phân ñược bảo quản dung dịch cố định quan sát đại thể khơng thực ðể phát ñược KST cần phải dùng kính hiển vi để quan sát (vi thể) QUAN SÁT ðẠI THỂ Quan sát ñại thể (bằng mắt kính lúp) để ghi nhận trạng thái, màu sắc, chất lạ, tìm kiếm xác định loại giun, sán ñược thải theo phân 1.1 Trạng thái phân Phân trạng thái: – Cứng rắn (khó đâm thủng) – Cứng (đâm thủng được) – Mềm (cắt được) – Nhão (có thể biến dạng) – Lỏng – Lỏng nước 1.2 Màu sắc Thay ñổi từ ñen, nâu ñậm, nâu, nâu nhạt, vàng, xanh, màu ñất sét hay đơi đỏ, trắng 1.3 Các chất lạ – Chất nhày: thường đục, kết thành sợi, hình dáng giống ký sinh trùng Chất xem xét cẩn thận để tìm đơn bào, trứng Schistosoma – Mô liên kết: màu trắng xà cừ Xem kính hiển vi sau làm với acid acetic thấy sợi dài – Máu: cần ghi nhận diện máu tươi ñã ñược tiêu hóa làm phân có màu ñen ñều – Mủ: gồm có nhiều bạch cầu biến dạng – Các cặn bã thực vật chưa tiêu hóa, thường hình thức sợi QUAN SÁT VI THỂ Quan sát vi thể thực với kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp, tập trung KST phân, kỹ thuật chuyên biệt, cấy nhuộm cố ñịnh II KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TRỰC TIẾP Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp sử dụng phân hòa tan nước muối cho phép phát di ñộng thể hoạt ñộng ñơn bào, trứng giun, sán, ấu trùng giun vật thể bất thường phân (hồng file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 18 of 218 cầu, bạch cầu,…) DỤNG CỤ – Kính hiển vi – Lam kính, kính – Viết (bút) chì sáp – Que gỗ – Khăn vải – Bình đựng dung dịch sát trùng – Kẹp HÓA CHẤT QUY TRÌNH LÀM TIÊU BẢN PHÂN
Lấy lam kính sạch, khơ Dùng viết chì sáp chia lam kính làm phần Ghi tên bệnh nhân vào ô nhỏ đầu lam kính  Nhỏ lên lam kính giọt NaCl 0,85% vào ô giữa, giọt Lugol cuối  Dùng que gỗ lấy phân đầu que diêm, hịa tan phân vào giọt NaCl 0,85%  Lấy phân lần thứ hai hòa tan phân vào giọt Lugol  Bỏ que gỗ vào dung dịch sát trùng  ðậy kính lên giọt phân  Khảo sát tiêu kính hiển file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 19 of 218 TIÊU CHUẨN CỦA MỘT TIÊU BẢN TỐT – Không dày: phân nhiều làm tiêu ñục tối, che lấp KST, khó phát – Khơng q mỏng: phân q khơng tìm thấy KST, trừ chúng q nhiều – Tiêu có độ dày vừa phải thấy ñược chữ in tờ báo ñặt tiêu – Tiêu khơng có bọt khí, dung dịch phân khơng tràn quanh kính KHẢO SÁT TIÊU BẢN DƯỚI KÍNH HIỂN VI – Khảo sát tiêu phân vật kính x10, muốn nhìn rõ chi tiết chuyển sang vật kính x40 – Khảo sát mẫu phân theo hình chữ chi (zic zac) để khơng bỏ sót vi trường file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009 LỜI GIỚI THIỆU Page 20 of 218 Lưu ý: – Nên ñể ánh sáng vừa phải – Mẫu phân ñược xét nghiệm sớm tốt, ñể lâu KST chết thay đổi hình dạng, khó xác định – Mẫu phân tìm trứng giun, sán: khơng để q 10 – Mẫu phân tìm đơn bào: khơng để q NHỮNG SAI LẦM NÊN TRÁNH – Phết phân khơng đều, chỗ dày, chỗ mỏng – Nếu phết phân lỗng q đặc q, nên bỏ đi, làm lại phết phân khác – ðậy kính làm tiêu có bọt khí – Dung dịch phân tràn xung quanh kính – Qn khơng đặt kính lên phết phân phết phân chóng khơ, vật kính bị bẩn màu nhuộm nhạt nhanh – Dùng nước thường để hịa tan phân thay dùng dung dịch NaCl 0,85%, nước thường làm biến dạng hay hủy hoại thể hoạt ñộng ñơn bào – Dùng nhiều ánh sáng q Nên để tụ kính gần với bàn kính Giảm ánh sáng cách đóng bớt màng chắn sáng hay dùng kính lọc màu xanh da trời lấy ánh sáng CÁCH TRẢ LỜI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM PHÂN Trên phiếu trả lời kết xét nghiệm phân, phải ghi nội dung sau: – ðặc tính phân: phân cứng, mềm, nhão, có khn, lỏng,… – Màu sắc phân: vàng, xanh, nâu, ñen,… – Các yếu tố bất thường thấy ñược mắt: chất nhày, máu, ñốt sán,… – Kỹ thuật sử dụng: soi trực tiếp, kỹ thuật tập trung Willis,… – Kết quả: + Âm tính: tìm khơng thấy trứng bào nang KST đường ruột + Dương tính, viết chi tiết sau: * Tên tiếng Việt tên khoa học KST * Trứng, thể hoạt ñộng, bào nang, ấu trùng * Mật độ nhiễm tiêu bản: Ví dụ: Tìm thấy trứng giun đũa (Ascaris lumbricoides): (+) file://C:\Windows\Temp\nbgaubudjw\Kysinhtrung_bk.htm 30/09/2009