Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Trong giai đoạn từ 2016 đến 2018, nhiều địa phương trên toàn quốc đã báo cáo tình hình bệnh LMLM Đặc biệt, vào năm 2018, một số khu vực đã tiến hành tiêm phòng vắc xin LMLM cho gia súc nhằm ngăn chặn sự lây lan của bệnh.
Các hoạt động nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại các đơn vị thuộc Cục Thú y, với Phòng thí nghiệm Cơ quan Thú y vùng VI là phòng thí nghiệm chủ đạo quốc gia Các mẫu vi rút LMLM sau đó được gửi đi phân tích tại Phòng thí nghiệm tham chiếu của FAO và OIE tại Pirbright, Anh và Senasa, Argentina.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 12/2018 đến tháng 09/2019.
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
- Các ổ dịch và loài gia súc mắc bệnh LMLM tại các địa phương trong thời gian từ 2016 - 2018
- Các chủng vi rút LMLM phân lập được tại các địa phương trong phạm vi cả nước trong giai đoạn 2016 - 2018
- Gia súc (trâu, bò) được tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018 tại một số địa phương
- Số liệu dịch bệnh LMLM chi tiết đến cấp xã do Chi cục Thú y/Chăn nuôi và Thú y các tỉnh, thành phố báo cáo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018
- Kết quả xét nghiệm, xác định serotype và topotype LMLM do các Chi cục Thú y vùng tổng hợp và báo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018
Dữ liệu địa lý và phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích thống kê, đặc biệt là với các gói phân tích như epiR (Stevenson, 2012a) và Spatstat (Baddeley và Turner, 2005) Những công cụ này giúp nâng cao khả năng phân tích và trực quan hóa dữ liệu dịch tễ học.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018
- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh trong năm 2018.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study)
Phương pháp phân tích theo đối tượng mắc bệnh
Tỷ lệ mắc bệnh LMLM ở các loài gia súc như trâu, bò, lợn, dê và cừu đã được tổng hợp theo từng tỉnh nghiên cứu Ngoài ra, cũng đã thống kê tỷ lệ các loài gia súc bị chết trong các ổ dịch bệnh LMLM.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo thời gian
Phương pháp xây dựng biểu đồ dịch tễ bao gồm việc đếm tổng số ổ dịch, trong đó có các xã có gia súc mắc bệnh và chết do LMLM, cho mỗi ngày kể từ khi xuất hiện ca bệnh đầu tiên Dữ liệu này được thể hiện dưới dạng biểu đồ dịch tễ để dễ dàng theo dõi và phân tích sự phát triển của dịch bệnh.
Tỷ số lây lan ước tính (EDR) là chỉ số quan trọng để đánh giá tình hình dịch bệnh LMLM, được tính bằng cách chia số ổ dịch trong một khoảng thời gian (ví dụ 5 ngày) cho số ổ dịch trong khoảng thời gian tương tự trước đó Cụ thể, nếu số ổ dịch từ ngày 11-15/1/2016 là 17 và số ổ dịch từ ngày 06-10/1/2016 là 3, thì EDR = 17/3 > 1 cho thấy dịch đang lây lan mạnh Ngược lại, nếu EDR < 1, dịch có xu hướng giảm, và EDR = 1 cho thấy dịch ổn định.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo không gian
Nguy cơ mới mắc (Incidence Risk) được xác định là tỷ lệ số xã có dịch bệnh LMLM so với tổng số xã có nguy cơ tại mỗi tỉnh trong từng năm, cũng như trong toàn bộ giai đoạn từ 2016 đến 2018.
Tọa độ địa lý X và Y được ghi nhận cho từng ổ dịch bệnh LMLM, do các ổ dịch này thường xảy ra với số lượng lớn và lặp đi lặp lại tại các xã Để thể hiện dữ liệu dạng điểm, bản đồ Kernel (Pfeiffer et al., 2008; Stevenson, 2012b; Nguyễn Văn Long và cs., 2012) được sử dụng để ước tính mật độ điểm dịch, còn gọi là ước tính mật độ Kernel.
Nguyên tắc ước tính mật độ Kernel bao gồm hai bước chính: đầu tiên, các vùng dịch được chia thành các ô vuông có kích thước đồng nhất, chẳng hạn như 200 x 200m², và tạo ra một vùng xung quanh mỗi điểm dịch, được gọi là vùng Kernel Tiếp theo, số điểm dịch trong mỗi ô vuông được đếm, từ đó tính tổng số điểm dịch trong vùng Kernel Cụ thể, nếu y' đại diện cho một điểm chung, thì y1, y2, …, yn là các điểm dịch quan sát được Mật độ điểm dịch cho mỗi vùng Kernel (f(y, h)) được ước tính tại mỗi điểm y theo Công thức 1.
K là ước tính mật độ Kernel đối xứng tại mỗi điểm y, trong khi h đại diện cho bandwidth (thông số smoothing) - bán kính của vùng Kernel xung quanh mỗi điểm dịch Số lượng điểm dịch trong mỗi vùng này được ký hiệu là n.
Phân bố không gian của dịch bệnh LMLM được xác định bằng tỷ số nguy cơ, trong đó số xã có dịch bệnh LMLM chia cho tổng số xã có nguy cơ trong khu vực được chuẩn hóa theo mỗi km² Mỗi năm, tổng số xã có nguy cơ là tổng số xã của từng tỉnh, do bệnh LMLM có khả năng lây lan mạnh mẽ Mặc dù nước ta đã thực hiện các biện pháp kiểm dịch nghiêm ngặt, nhưng vẫn còn nhiều thách thức, dẫn đến khả năng lây lan dịch bệnh từ một xã có dịch sang các xã khác trong tỉnh là rất cao.
3.5.2 Phương pháp giải trình tự gien
Cục Thú y hàng năm thực hiện việc lấy mẫu gia súc từ các ổ dịch và chương trình giám sát chủ động để chẩn đoán, xét nghiệm và phân lập virus LMLM Các mẫu virus đại diện được lựa chọn dựa trên không gian, thời gian và đối tượng động vật nhiễm virus, sau đó được gửi đến phòng thí nghiệm OIE tại Pirbright, Vương Quốc Anh để thực hiện giải trình tự gen, xác định chủng virus và phân tích cây phả hệ.
Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright đã giải trình tự gien vi rút LMLM với quy trình được tóm tắt như sau:
- Mẫu được tách chiết thu hoạch RNA/DNA
- Thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn gien chứa vùng VP1 với kích thước sản phẩm 1300 bp bằng cặp mồi đặc hiệu
- Tinh sạch sản phẩm DNA bằng kít chuyên dụng
- Đưa vào máy giải trình gien để bắt đầu chạy theo chương trình cài đặt của từng loại máy nhằm thu được kết quả trình tự cuối cùng
- Kết quả là những chuỗi nucleotic, các trình tự nucleotic được xuất ra máy vi tính
Kết quả giải mã gien sẽ được so sánh với các trình tự gien của các nhóm vi rút khác đã được công bố trên Ngân hàng gien NCBI Việc này nhằm tìm hiểu mối liên hệ với các chủng vi rút trên thế giới cũng như so sánh với các chủng trong nước đã có kết quả trước đó Phần mềm MEGA sẽ được sử dụng để thể hiện cây phả hệ sinh dòng, giúp phân tích và hiểu rõ hơn về sự tiến hóa của các chủng vi rút.
3.5.3 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa kháng nguyên của vắc xin và kháng nguyên của vi rút thực địa
Dựa trên kết quả giải trình tự và phân tích gen các chủng vi rút LMLM tại Việt Nam từ năm 2016 đến 2018, Phòng thí nghiệm OIE tại Pirbright, Vương Quốc Anh và Senasa của Argentina đã tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa vi rút vắc xin và vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam thông qua giá trị r1 - mối quan hệ kháng nguyên Các loại vắc xin LMLM này đã được OIE khuyến cáo và được nhiều quốc gia sử dụng trong nhiều năm qua.
Theo khuyến cáo của Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE cho thấy, mức tương đồng kháng nguyên được đánh giá dựa trên giá trị r1, cụ thể như sau:
Khi r1 ≥ 0,3, cho thấy sự tương đồng cao giữa chủng virus thực địa và chủng virus vắc xin đang được sử dụng tại Việt Nam, điều này cho thấy vắc xin có khả năng bảo vệ gia súc khỏi sự nhiễm trùng do chủng virus thực địa này.
Khi chỉ số r1 < 0,3, điều này cho thấy mức độ tương đồng giữa chủng vi rút thực địa và chủng vi rút vắc xin đang sử dụng tại Việt Nam là thấp Điều này có nghĩa là vắc xin hiện tại không có khả năng bảo vệ gia súc khỏi sự nhiễm trùng do chủng vi rút thực địa này gây ra.
3.5.4 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh
Dựa trên phân tích dịch tễ học không gian và sự phân bố các chủng vi rút LMLM, bài viết đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa vi rút vắc xin và vi rút lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2016 - 2018 Nghiên cứu lựa chọn một số địa phương thuộc vùng khống chế và vùng đệm theo Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020, nhằm đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018.
3.5.3.1 Thời gian và tần suất lấy mẫu
Lấy 01 (một) lần duy nhất sau khi kết thúc tiêm phòng mũi tiêm cuối cùng từ 04 tuần trở lên kể từ ngày tiêm phòng
Huyết thanh từ trâu, bò đã được tiêm vắc xin LMLM, loại vắc xin được Bộ NN&PTNT và Bộ Tài chính cấp phát cho các địa phương Các cơ quan chuyên môn thú y địa phương cũng được hướng dẫn kỹ thuật để mua và sử dụng vắc xin, nhằm đảm bảo thống nhất với Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020.
Quản lý và phân tích số liệu
Sử dụng các phương pháp thống kê sinh học và chương trình phân tích dịch tễ như ArcGIS 10.3, R, BioEdit và MEGA để xử lý và phân tích dữ liệu, vẽ bản đồ dịch tễ và xây dựng cây phả hệ sinh dòng.
- Kết quả xét nghiệm và dữ liệu thu từ thực địa được nhập vào file MS Excel 2010
Phân tích dịch tễ học mô tả bao gồm việc khảo sát sự phân bố của các chủng vi rút theo không gian, thời gian và đối tượng Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp dịch tễ và thống kê thông thường, cùng với các bộ công cụ phân tích dịch tễ trong phần mềm R, như đã được trình bày bởi Stevenson (2012a).
Tỷ lệ gia súc mắc bệnh và tử vong do bệnh LMLM đang gia tăng, đồng thời nguy cơ bùng phát dịch cũng trở nên nghiêm trọng hơn Đặc biệt, tỷ lệ dương tính với kháng thể của vắc xin được xác định theo phương pháp Fleiss (Fleiss, 1981), cho thấy hiệu quả và tầm quan trọng của việc tiêm phòng trong việc kiểm soát dịch bệnh.
