XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (SAINTPAULIA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Hiện nay, các loại hoa trồng chậu trang trí ngày càng được ưa chuộng và phổ biến, đặc biệt ở các nước phát triển. Khi cuộc sống đang ngày càng được đô thị hoá, các loại hoa trồng chậu đã góp phần đáng kể trong việc cải tạo môi trường sống, đáp ứng nhu cầu trang trí, thay đổi không gian sống và làm cho cuộc sống con người gần gũi với thiên nhiên hơn. Có rất nhiều loại hoa trồng chậu phổ biến và được người tiêu dùng ưa chuộng như Begonia, Cineraria, Geranium, Saintpaulia,... Trong đó, cây Saintpaulia hay còn gọi là Violet Châu Phi là loại cây đẹp, đa dạng về màu sắc, có tác dụng lọc không khí, trang trí, điều hòa tinh thần và giải tỏa áp lực. Dù trong bất cứ không gian nào thì cây cũng sẽ đem lại cho chúng ta một cảm giác dễ chịu. Cây không những có tác dụng lọc không khí mạnh mà còn có thể hút các loại chất có hại trong không khí như Aldehyde, amoniac, trichloroethylene... Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp ngành nông nghiệp sản xuất được một lượng lớn cây giống, đồng đều về mặt di truyền, trong thời gian ngắn, tiết kiệm được chi phí mua giống. Việc nhân giống trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào giúp chúng ta kiểm soát dịch bệnh cây giống và đáp ứng đủ nhu cầu trang trí cho người tiêu dùng. Để đáp ứng việc cung cấp giống cho sản xuất với số lượng lớn, cây con khỏe và sạch bệnh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân nhanh giống violet Châu Phi (Saintpaulia) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC YERSIN ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC MÔI TRƯỜNG -o0o XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (SAINTPAULIA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan violet (Saintpaulia) 1.2 Các phương pháp nhân giống 1.3 Đặc điểm sinh thái 1.4 Đặc điểm hình thái 1.5 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.5.1 Sơ lược lịch sử nuôi mô tế bào thực vật 1.5.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.5.3 Tầm quan trọng nuôi cấy mô tế bào 1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.6.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy 1.6.2 Ảnh hưởng yếu tố vật lý 1.7 Vai trò chất điều hòa sinh trưởng 1.7.1 Auxin 1.7.2 Cytokinin 10 1.7.3 Giberellin 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Nguồn mẫu thực vật 14 2.1.2 Hóa chất: 14 2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ: 14 2.2 Phương pháp 14 2.2.1 Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 14 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 15 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 15 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 15 2.2.5 Thu thập xử lý số liệu 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 17 3.1 Kết khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 17 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 20 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 21 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24 4.1 Kết luận 24 4.2 Kiến nghị 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS: môi trường Murashige Skoog (1962) ¾ MS: mơi trường MS với thành phần khống đa lượng giảm ¾ vi lượng giữ ngun ½ MS: mơi trường MS với thành phần khống đa lng gim ẵ v vi lng gi nguyờn ẳ MS: mơi trường MS với thành phần khống đa lượng giảm ¼ vi lượng giữ nguyên NAA: α-naphthaleneacetic acid GA3: gibberellic acid IAA : idole-3-acetic acid TB: trung bình NXB : nhà xuất DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 17 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 18 Bảng 3.3 Kết khảo sát Gibberillic lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 20 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 22 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Khảo sát mơi trường khống thích hợp cho Violet Châu Phi sinh trưởng phát triển 18 Hình 3.2 Kết khảo sát Kinetin lên sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 19 Hình 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 21 Hình 3.4 Kết khảo sát đến khả rễ violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 23 Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, loại hoa trồng chậu trang trí ngày ưa chuộng phổ biến, đặc biệt nước phát triển Khi sống ngày thị hố, loại hoa trồng chậu góp phần đáng kể việc cải tạo mơi trường sống, đáp ứng nhu cầu trang trí, thay đổi không gian sống làm cho sống người gần gũi với thiên nhiên Có nhiều loại hoa trồng chậu phổ biến người tiêu dùng ưa chuộng Begonia, Cineraria, Geranium, Saintpaulia, Trong đó, Saintpaulia hay cịn gọi Violet Châu Phi loại đẹp, đa dạng màu sắc, có tác dụng lọc khơng khí, trang trí, điều hịa tinh thần giải tỏa áp lực Dù khơng gian đem lại cho cảm giác dễ chịu Cây có tác dụng lọc khơng khí mạnh mà cịn hút loại chất có hại khơng khí Aldehyde, amoniac, trichloroethylene Phương pháp ni cấy mô tế bào thực vật giúp ngành nông nghiệp sản xuất lượng lớn giống, đồng mặt di truyền, thời gian ngắn, tiết kiệm chi phí mua giống Việc nhân giống phịng thí nghiệm phương pháp nuôi cấy mô tế bào giúp kiểm soát dịch bệnh giống đáp ứng đủ nhu cầu trang trí cho người tiêu dùng Để đáp ứng việc cung cấp giống cho sản xuất với số lượng lớn, khỏe bệnh, tiến hành thực đề tài “Xây dựng quy trình nhân nhanh giống violet Châu Phi (Saintpaulia) phương pháp nuôi cấy mô tế bào” Chương Tổng quan CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan violet (Saintpaulia) – Tên khoa học: Saintpaulia – Tên gọi khác: violet Châu Phi – Bộ: Lamiales – Họ: Gesneriaceae (tai voi) – Chi: Saintpaulia Nguồn gốc phân bố: Violet Châu Phi (Saintpaulia) có nguồn góc từ Tanzania Đơng Nam giáp Kenya nhiệt đới phía đơng châu phi Loài hoa ưa chuộng châu Âu, châu Mỹ Violet loài hoa đẹp dễ trồng dễ trang trí có nguy tuyệt chủng cao Với giá trị kinh tế cao thị trường trồng chậu Hoa Kỳ đạt giá trị 788 triệu đô la Mỹ năm 2014 ; 810 triệu đô la Mỹ năm 2015 (USDA, 2016); hoa violet Châu Phi chiếm 4,07 triệu đô la Mỹ (4,16 triệu đô la Mỹ năm 2015; với mức tăng 1% so với năm 2013 (USDA, 2015) 1.2 Các phương pháp nhân giống Violet châu Phi (Saintpaulia ionantha H Wendl) loại cảnh trồng chậu phổ biến, dễ trồng ex vitro in vitro so với loài cảnh thân thảo khác Chất lượng làm cho trở thành đối tượng lý tưởng cho thí nghiệm tái sinh in vitro 1.3 Đặc điểm sinh thái Violet châu Phi (Saintpaulia ionantha H Wendl.) có nguồn gốc từ Tanzania Đông Nam giáp Kenya nhiệt đới phía đơng Châu Phi Saintpaulias mọc cao từ 6-15 cm rộng từ 6-30 cm Các thn trịn thành hình bầu dục, dài 2,5-8,5 cm với cuống 2-10 cm, lông mịn với kết cấu nhiều thịt Các hoa có đường kính 2-3 cm, với thùy tràng hoa có 3-10 bơng nhiều cành hoa mảnh mai Màu hoa lồi hoang dã là: tím, xanh nhạt trắng Cây không chịu ánh sáng trực tiếp, sau đến tháng trồng bắt đầu cho nụ trổ hoa 1.4 Đặc điểm hình thái Violet châu Phi (Saintpaulia ionantha H Wendl.) chi bao gồm khoảng 20 lồi biến thể Có nhiều loại khác bao gồm kích cỡ, màu sắc hoa kiểu tán Chương Tổng quan Trên thực tế có hàng ngàn lai với nhiều màu sắc, dạng hoa kiểu khác Tuy nhiên, chúng có số đặc điểm loại kích thước Tiêu chuẩn: loại tiêu chuẩn thường phát triển với đường kính khoảng 8-16 inch hiển thị hầu hết màu mà loại hoa violet Châu Phi nở Cánh hoa lá: có nhiều kết hợp màu sắc khác dành cho cánh hoa, từ hồng đến hoa Candy Dandy kép nhiều màu Các cánh hoa có hình dạng, cánh, số lượng khác hoa kép Ngồi cịn có nhiều loại khác bao gồm tên gọi hình cậu bé, gái, hình loang lổ (xanh trắng), hình thìa, nhựa ruồi, hình cưa hình mũi mác Thân: Violet Châu Phi thuộc dòng thân bụi nhỏ, chiều cao trưởng thành khoảng 30-40cm Rễ: Hoa violet Châu Phi thuộc dòng rễ cọc Hoa: Đây điểm nhấn đặc biệt violet Châu Phi, cánh hoa mềm mại, đa dạng nhiều màu sắc từ tím mộng mơ, hồng ngây thơ, trắng ban mai Sự nở hoa: Những hoa nở khoảng 10 tháng năm, với việc sử dụng ánh sáng nhân tạo, nhiệt độ điều kiện phù hợp Về bản, chúng hoa quanh năm nhưng: tùy thuộc vào mức độ chăm sóc 1.5 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.5.1 Sơ lược lịch sử nuôi mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden Schwan đề xướng thuyết tế bào nêu rõ: “Mọi thể sinh vật phức tạp gồm nhiều đơn vị nhỏ, tế bào hợp thành Các tế bào phân hóa mang thơng tin di truyền có tế bào đầu tiên, trứng sau thụ tinh, đơn vị độc lập, từ xây dựng lại tồn thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000) Năm 1902, Harberland người quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hồn chỉnh Ơng cho “Bằng nuôi cấy mô tế bào phân lập, người ta tạo phơi nhân tạo từ tế bào sinh dưỡng” Ơng tiến hành ni cấy mẫu số mầm như: Erythronium, Tradescantia, nhiên không thành công (Vũ Văn Vụ cs, 2009) Chương Tổng quan Năm 1922, Kotte, học trò Harberland Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ hồ thảo Trong mơi trường lỏng gồm có muối khống glucose, đầu rễ sinh trưởng mạnh, tạo nên hệ rễ nhỏ mang rễ phụ Tuy nhiên, sinh trưởng tồn thời gian sau chậm dần dừng lại, tác giả chuyển sang môi trường (Nguyễn Đức Thành, 2000) Năm 1934, xem giai đoạn thứ hai nuôi cấy mô tế bào thực vật White thành cơng việc trì mơ rễ cà chua mơi trường lỏng có chứa muối khống, đường saccarozơ dịch chiết nấm men Qua thí nghiệm, ơng thấy thay dịch chiết nấm men vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J H., Roberts L W, 1999) Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret trì sinh trưởng mơ sẹo cà rốt thời gian dài Năm 1941, Van Overbeek cộng phát thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến phát sinh phôi tạo mô sẹo họ cà (Dodd J H., Roberts L W, 1999) Cũng thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin NAA, 2,4-D tổng hợp Nhiều tác giả xác nhận với nước dừa, 2,4-D NAA giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào nhiều đối tượng thực vật mà trước khó ni cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005) Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân thuốc Ơng nhận thấy chế phẩm có tác dụng kích thích sinh trưởng mơ ni cấy rõ rệt Một năm sau, Skoog cộng xác nhận chất gây tượng 6-furfuryl amino purine đặt tên kinetin Sau người ta tìm tổng hợp số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự kinetin với kinetin gọi chung nhóm cytokinin Cytokinin tách chiết từ thực vật bậc cao zeatin có mầm ngơ Các hợp chất có khả kích thích phân chia tế bào mơ biệt hố cao tế bào thịt nội nhũ hạt phơi khô (Dodd J H., Roberts L W, 1999) Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) tạo protocorm (mô sẹo) từ địa lan Khi để điều kiện định, protocorm phát triển thành lan hoàn toàn bệnh Cùng năm đó, Cocking trường đại học tổng hợp Nottingham thu tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô Chương Tổng quan polyribosome nên làm tăng q trình chuyển hóa acid nucleic protein (Vũ Văn Vụ et al., 2001) Cytokinin giúp cho nảy mầm, mở rộng tế bào quan, kích thích mở rộng tế bào trục hạ diệp cắt từ củ cải, bí đỏ, lanh nhiều song tử diệp khác Sự mở rộng tế bào hấp thu nước gây ra, làm giảm thế thẩm thấu tế bào kích thích biến đổi trở lại lipid dự trữ trục hạ diệp thành đường khử (glucose fructose) Cytokinin kích thích ức chế khởi đầu phát triển rễ tùy theo nồng độ thời gian xử lý KIN kích thích tăng trọng lượng khơ vươn dài rễ đậu lupin con, trái lại hai yếu tố bị ức chế nồng độ KIN cao Khi KIN xử lý lên rễ nồng độ thấp kích thích quang hợp sinh trưởng Tuy nhiên, nếu rễ tiếp xúc với KIN nồng độ cao hai ngày sinh trưởng phát triển rễ giảm rõ rệt Cytokinin có khả kích thích chồi bên đặc biệt vượt qua ảnh hưởng ưu thế Ưu thế điều khiển cân mức độ cytokinin auxin nội sinh Cytokinin giúp làm giảm q trình lão hóa tách khỏi thân hoạt động chất thay thế cho cần thiết rễ để làm giảm lão hóa Cytokinin có khả thay thế ảnh hưởng ánh sáng làm giảm lão hóa cách trì ngun vẹn màng tonoplast (màng bán thấm bao quanh khơng bào) KIN có khả kích thích vận chuyển chất hữu cắt giữ tối Khả cytokinin kích thích vận chuyển dinh dưỡng tạo sức chứa biết nhiều loài Ngồi ra, cytokinin cịn có chức làm tăng diện tích phiến lá, làm tăng mở khí khổng số loài, tạo chồi bất định nồng độ cao (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2003) 1.7.3 Giberellin Giberellin nhóm phytohormone thứ hai phát vào năm 1955—1956 Khi nghiên cứu chế gây nên bệnh lúa von (cây lúa sinh trưởng chiều cao mức gây nên bệnh lí), nhà khoa học chiết tách chất gây nên sinh trưởng mạnh lúa bị bệnh Đó axit Gibberillic (GA3) Giberelin xem phytohormone quan trọng thế giới thực vật 11 Chương Tổng quan Ngày nay, người ta phát 60 loại giberellin kí hiệu GA1; GA2, GA3,… GA60 ; GA3 có hoạt tính sinh lí mạnh dạng GA sản xuất sử dụng sản xuất GA;, sản xuất đường lên men chiết xuất sản phẩm từ dịch nuôi cấy nấm Giberellin tổng hợp chủ yếu non, số quan non sinh trưởng phôi hạt nảy mầm, non, rễ non Sự vận chuyển theo hệ thống mạch dẫn không phân cực auxin GA dạng tự dạng liên kết với hợp chất khác Hiệu rõ rệt GA kích thích mạnh mẽ sinh trưởng chiều cao thân, chiều dài cành, rễ, kéo dài lóng hồ thảo Hiệu có ảnh hưởng kích thích đặc trưng GA lên dãn theo chiều dọc tê bào Trong tự nhiên, tồn đột biến lùn Các đột biến có chiều cao thấp nhiều so với bình thường Đây đột biến gen đơn giản, thiếu gen trình tổng hợp giberellin Với đột biến này, việc xử lí GA hiệu Trong sản xuất, nếu muốn tăng chiều cao, tăng sinh khối, người ta xử lí GA GA kích thích nảy mầm hạt, củ, nên có tác dụng đặc trưng việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ chúng GA có tác dụng hoạt hố hình thành enzim thuỷ phân hạt a-amylaza Enzim xúc tác phản ứng biến đổi tinh bột thành đường, tạo điều kiện cho nảy mầm Trong sản xuất, muốn phá trạng thái ngủ nghỉ, tăng tỉ lệ nảy mầm hạt, củ xử lí GA3 cho chúng Trong nhiều trường hợp, GA có hiệu kích thích hoa Theo học thuyết hoa Trailakhian GA hai thành viên hoocmon hoa (florigen) GA antesin GA cần cho hình thành phát triển trụ hoa (cuống hoa), antesin cần cho phát triển hoa Xử lý GA làm cho dài ngày hoa điều kiện ngày ngắn làm cho bắp cải, su hào hoa điều kiện Việt Nam 12 Chương Tổng quan GA có hiệu việc phân hố giới tính đực Nó ức chế hình thành hoa kích thích hình thành hoa đực Có thể sử dụng GA để tăng tỉ lệ hoa đực cho có hoa đực, hoa riêng biệt bầu bí GA có ảnh hưởng kích thích lên hình thành tạo khơng hạt Hiệu tương tự auxin, số trồng có phản ứng đặc hiệu với GA nho, anh đào Trong việc sản xuất nho, biện pháp xử lí GA có ý nghĩa quan trọng việc tăng tỉ lệ đậu không hạt, tăng suất nho Ngồi ra, GA có ảnh hưởng điều chỉnh lên số trình trao đổi chất hoạt động sinh lí GA chất có ứng dụng hiệu sản xuất 13 Chương Vật liệu phương pháp CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguồn mẫu thực vật Nguồn mẫu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi Sử dụng nguồn mẫu cụm phơi Violet Châu Phi có sẵn phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật Đại học Yersin Đà Lạt làm vật liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi Nguồn mẫu cho thí nghiệm rễ in vitro Các chồi thu sau giai đoạn nhân nhanh có kích thước ≥ 5mm, có 4-5 sử dụng làm vật liệu ni cấy cho thí nghiệm rễ in vitro 2.1.2 Hóa chất: Mơi trường MS Saccharose Các chất kích thích sinh trưởng: Kinetin, Giberellin, Auxin 2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ: Tủ cấy, cân phân tích, máy đo pH Dụng cụ: Dao cấy, đĩa cấy, pank cấy, kéo, túi nuôi cấy nylon 120 x 250 mm khơng thống khí, cốc đong 20 mL 50 mL, 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện ni cấy mơ - Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất khoáng lên khả nhân nhanh chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) nuôi cấy in vitro - Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng cụm phơi Violet Châu Phi (Saintpaulia) chưa hình thành hồn chỉnh cấy vào túi ni cấy nylon có chứa mơi trường khống khác (MS, ¾ MS, ẵ MS, ẳ MS), 7g agar v 30g sucrose, pH = Đã vô trùng 121oC thời gian 30 phút Mật độ nuôi cấy cụm phơi/ túi - Chỉ tiêu theo dõi: số chồi hồn chỉnh, chiều cao chồi (mm), số lá/chồi Thu kết sau tuần nuôi cấy 14 Chương Vật liệu phương pháp 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô - Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên khả sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) ni cấy in vitro - Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng cụm phôi Violet Châu Phi (Saintpaulia) chưa hình thành chồi hồn chỉnh cấy sang mơi trường MS bổ sung Kinetin nồng độ khác (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2)mg/l, 7g agar 30g sucrose, pH điều chỉnh 5.8, sau đem vô trùng 121oC thời gian 30 phút Mật độ nuôi cấy cụm phôi/ túi - Chỉ tiêu theo dõi: số chồi hoàn chỉnh, chiều cao chồi (mm), số lá/chồi Thu kết sau tuần nuôi cấy 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện ni cấy mơ - Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên khả sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) - Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng cụm phơi Violet Châu Phi (Saintpaulia) chưa hình thành hồn chỉnh cấy sang môi trường MS bổ sung Gibberillic nồng độ khác (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2) mg/l, 7g/l agar 30g sucrose, pH điều chỉnh 5.8 sau vơ trùng 121oC thời gian 30 phút Mật độ nuôi cấy cụm phơi/ túi - Chỉ tiêu theo dõi: số chồi hồn chỉnh, chiều cao chồi (mm), số lá/chồi Thu kết sau tuần nuôi cấy 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô - Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng Auxin NAA đến khả rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) - Tiến hành thí nghiệm: Cây hồn chỉnh có - sử dụng làm nguồn mẫu cho thí nghiệm rễ Cây cấy sang mơi trường MS có bổ sung NAA nồng độ (0; 0,3;0,5; 0,7; 1; 1,5; 2)mg/l, 7g agar 30g sucrose, pH điều chỉnh 5.8 sau vơ trùng 121oC thời gian 30 phút Mật độ nuôi cấy 12 cây/ túi 15 Chương Vật liệu phương pháp - Chỉ tiêu theo dõi: số lá, số rễ, chiều dài rễ (mm), chiều dài mẫu (mm) Thu kết sau tháng nuôi cấy 2.2.5 Thu thập xử lý số liệu Tất thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên lặp lại lần, lần túi, túi mẫu Trong thí nghiệm rễ lần túi, túi 12 Số liệu thu nhận xử lý phần mềm Microsoft Excel 2016 phần mềm SPSS 22.0 với phép thử Duncan (mức ý nghĩa p = 0,05) 16 Chương Kết biện luận CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mơ Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ khống ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Nghiệm thức Mơi trường Trung bình Trung bình chiều Trung bình số số chồi cao chồi (mm) lá/chồi A1 MS 9,6a 6,6a 6,8a A2 ắ MS 10,4a 7,8a 7,6a A3 ẵ MS 4,8c 1c 4,16b A4 ¼ MS 8,6b 2,6b 3,4b Ghi chú: Các ký tự a, b, c, d… cột thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, khác biệt có ý nghĩa mức  = 0,05 Sau tuần nuôi cấy mơi trường có nồng độ khống khác nhau, sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) cho thấy có khác biệt rõ rệt tiêu theo dõi Ở nghiệm thức A2 mơi trường ¾ MS cho kết tiêu theo dõi tốt nhất, với số chồi TB đạt 10,4 chồi/ cụm; chiều cao chồi trung bình đạt 7,8 mm/ chồi; số TB đạt 7,6 lá/chồi Có khác biệt rõ so với nghiệm thức A3 với số chồi TB (4,8 chồi/ cụm); chiều cao chồi TB (1mm/ cụm); số TB (4,16 lá/ chồi) Các chồi nuôi cấy nghiệm thức A2 cho thấy khác biệt hình thái chồi tương đối rõ rệt, thể số chồi thật hình thành, chiều cao chồi, số cao so với nghiệm thức cịn lại (Bảng 3.1; Hình 3.1) Hơn qua quan sát sinh trưởng phát triển thể rõ hình thái chồi với thân to, khỏe, phát triển đều; xanh đậm, to hẳn, nghiệm thức cịn lại mẫu có số mẫu rnhiều, nhiên hình thái mẫu nhỏ, chưa hồn chỉnh, nhiều nhỏ màu sắc xanh nhạt, chất lượng chồi (Hình 3.1) Kết thu nghiệm thức A2 tương ứng với mơi trường ¾ MS môi trường tốt cho sinh trưởng phát triển chồi violet (Saintpaulia) Vậytrong nghiên cứu này, mơi trường ¾ MS có bổ sung 30 g/l đường; g/l agar môi trường tốt cho sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) 17 Chương Kết biện luận Hình 3.1 Khảo sát mơi trường khống thích hợp cho Violet Châu Phi sinh trưởng phát triển Ghi chú: A1: mơi trường MS; A2: mơi trường ¾ ms; A3: mụi trng ẵ MS; A4: Mụi trng ẳ MS 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Kinetin thành phần nhóm hợp chất gọi cytokinin, lớp nhân tố điều hòa sinh trưởng thực vật Ở loài thực vật, Kinetin thúc đẩy phân chia tế bào hoạt động quy trình sinh trưởng biệt hóa tế bào Chức chất kháng xi hóa, ngăn chặn tổn thương o xi hóa gây gốc tự Kinetin thường sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật để kích ứng hình thành mơ sẹo để tái tạo chồi từ mơ sẹo Trong thí nghiệm này, Kinetin bổ sung nồng độ khác kết ảnh hưởng hàm Kinetin lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) trình bày (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Nghiệm Nồng độ Trung thức Kinetin số chồi chồi (mm) lá/chồi C1 ĐC 9,6b 6,6a 6,8a C2 0,3 13a 1,24b 3,5b C3 0,5 7,6c 1,3b 3,26bc C4 0,7 3,2d 1,24b 3,08bcd C5 2,8de 1,18b 2,8cde C6 1,5 2,5de 0,8b 2,5de C7 1,5e 0,76b 2,34e bình Trung bình chiều cao Trung bình số Ghi chú: Các ký tự a, b, c, d… cộ thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, khác biệt có ý nghĩa mức  = 0,05 18 Chương Kết biện luận Sau tuần nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung Kinetin nồng độ (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2)mg/l, sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia), cho thấy có khác biệt rõ rệt Các tiêu theo dõi nghiệm thức bổ sung 0,3 mg/l Kinetin cho kết tiêu theo dõi tốt với số chồi hình thành hồn chỉnh TB 13 chồi/ cụm, chiều cao chồi TB 1,24 mm, số TB 3,5 lá/chồi có hình thái chồi rõ ràng, xanh tốt Các nghiệm thức lại tiếp tục tăng nồng độ Kinetin tỷ lệ chồi giảm dần tương ứng nghiệm thức C3 với số chồi TB 7,6 chồi/ cụm, nghiệm thức C4 với số chồi TB 3,2 chồi/cụm, nghiệm thức C5 với số chồi TB 2,8 chồi/cụm, nghiệm thức C6 với số chồi TB 2,5 chồi/cụm, nghiệm thức C7 với số chồi TB 1,5 chồi/cụm (Bảng 3.2) Hình thái mẫu ni cấy mơi trường có bổ sung Kinetin thường xuất chồi hồn chỉnh, to có màu xanh đậm Tuy nhiên nồng độ Kinetin tăng hình thái chồi hơn, chồi nhỏ hơn, yếu hơn, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Hình 3.2) Như vậy, nghiên cứu nghiệm thức môi trường MS bổ sung Kinetin nồng độ 0,3 mg/l, 30g/l đường, g/l agar môi trường tốt cho sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) Hình 3.2 Kết khảo sát Kinetin lên sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Ghi chú: C1: đối chứng; C2: bổ sung 0,3 mg/l-Kinetin; C3: bổ sung 0,5 mg/l-Kinetin; C4: bổ sung 0,7 mg/l-Kinetin; C5: bổ sung mg/l-Kinetin; C6: bổ sung 1,5 mg/l-Kinetin; C7: bổ sung mg/l-Kinetin 19 Chương Kết biện luận 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Gibberellic (GA3) có vai trị thúc đẩy kéo dài tế bào, để thân thon dài, phát triển cao có tác dụng thúc đẩy hoa đậu Hiệu sinh lý Gibberellic kích thích mạnh mẽ sinh trưởng kéo dài thân, vươn dài lóng Hiệu có Gibberellic kích thích mạnh lên pha giãn tế bào theo chiều dọc Vì sử lý Gibberellic cho làm tăng nhanh sinh trưởng dinh dưỡng nên làm tăng sinh khối Dưới tác động Gibberellic làm cho thân tăng chiều cao mạnh Trong thí nghiệm này, Gibberellic bổ sung nồng độ khác kết ảnh hưởng hàm lượng Gibberellic lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát Gibberillic lên sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Trung bình Trung bình chiều Trung bình số số chồi cao chồi (mm) lá/chồi B1 ĐC 9,6b 6,6b 6,8b B2 0,3 11a 7.5ab 7.22ab B3 0,5 11.5a 8.26a 7.74a B4 0,7 10.9a 7.3ab 7.02b B5 10.6ab 6.94b 6.96b B6 1,5 10.52ab 6.78b 6.92b B7 10.3ab 6.64b 6.88b Ghi chú: Các ký tự a, b, c, d… cột thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, khác biệt có ý nghĩa mức  = 0,05 Thông qua Bảng 3.3 sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung GA3 nồng độ (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2) mg/l, cho thấy có khác biệt rõ rệt sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) Khi bổ sung GA3 nghiệm thức, ta thấy tiêu theo dõi cao so với nghiệm thức đối chứng Ở nồng độ GA3 0,5 mg/l cho kết tiêu theo dõi lớn với số chồi TB đạt 11,5 chồi/cụm, chiều cao chồi 8.26 mm, số lá/chồi 7.4 lá, cao đối 20 Chương Kết biện luận chứng cao so với nghiệm thức khác Bên cạnh hình thái chồi nuôi cấy môi trường chứa GA3 nồng độ 0,3 mg/l thể khác biệt đáng kể so với nghiệm thức đối chứng với hình thái mẫu chồi hình thành hồn thiện có chiều dài dài hơn, lóng dài Từ nghiệm thức B1 không bổ sung GA3 đến bổ sung GA3 nồng độ 0,3 mg/l – 0,5 mg/l số chồi TB, chiều cao chồi TB, số tăng lên rõ rệt có hình thái chồi nhiều, rõ, xanh, to Nhưng tăng nồng độ GA3 lên 0,7 mg/l – 2mg/l số chồi TB, chiều cao chồi TB, số TB giảm có hình thái chồi ít, nhỏ thể Bảng 3.3 Hình 3.3 Như vậy, nghiên cứu môi trường MS bổ sung GA3 nồng độ 0,5 mg/l, 30g/l đường, g/l agar môi trường tốt cho sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) Hình 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sinh trưởng phát triển violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Ghi chú: B1: đối chứng; B2: bổ sung 0,3 mg/l-GA3; B3: bổ sung 0,5 mg/l-GA3; B4: bổ sung 0,7 mg/lGA3; B5: bổ sung mg/l-GA3; B6: bổ sung 1,5 mg/l-GA3; B7: bổ sung mg/l-GA3 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ violet (Saintpaulia) điều kiện ni cấy mơ Trong thí nghiệm rễ sử dụng @ - NAA để nghiên cứu rễ chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) in vitro Sau tuần nuôi cấy, thu kết Bảng 3.4 21 Chương Kết biện luận Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Nồng Nghiệm Độ thức NAA (mg/l) Trung Trung bình số bình số (Lá/ chồi) rễ (rễ) Trung bình chiều dài rễ Hình thái mẫu (mm) D1 MS 11a 11,8d 7,6b D2 0,3 8,8ab 12,4cd 11,6a Cây cao, thân còi, nhỏ, xanh nhạt, rễ yếu, nhỏ Cây cao, thân mập, to, xanh đậm, rễ đồng đều, to Cây thấp, thân còi, nhỏ, D3 0,5 7,6bc 21,6c 10,9a xanh đậm, rễ không đồng đều, nhỏ yếu Rễ không đồng đều, yếu, rễ D4 0,7 6cd 22,4c 5,02c mọc vị trí có tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, bị xốp, yếu Rễ mọc từ thân, cuống D5 5de 35,4b 4,3c hay vị trí thân có tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, bị xốp, yếu Rễ mọc từ thân, cuống D6 1,5 4,2e 60,6a 4c hay vị trí thân có tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, bị xốp, yếu Rễ mọc từ thân, cuống D7 4e 69,6a 3,8c hay vị trí thân có tiếp xúc với mơi trường ni cấy, bị xốp, yếu Ghi chú: Các ký tự a, b, c, d… cột thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, khác biệt có ý nghĩa mức  = 0,05 22 Chương Kết biện luận Qua bảng 3.4 cho thấy: 100% chồi Violet Châu Phi rễ dù cấy mơi trường có bổ sung hay khơng bổ sung NAA, điều chứng tỏ chồi, auxin nội sinh đủ để kích thích q trình tạo rễ chồi Tuy nhiên bổ sung NAA với mức nồng độ thay đổi nhận thấy nồng độ 0,3 mg/l cho số trung bình chiều dài rề trung bình vượt trội nghiệm thức khác, tương ứng 8,8 lá/ chồi 11,6 mm nghiệm thức cho hình thái mẫu hồn chỉnh, rễ mọc vị trí gốc thân cây, với hình thái cao, thân mập, to, xanh đậm, rễ đồng đều, to chất lượng Khi tăng nồng độ NAA lên 0,5 mg/l độ dài chất lượng rễ giảm dần số rễ tăng Khi tăng nồng độ NAA số rễ tăng chất lượng rễ, chất lượng chồi giảm thể hình thái xốp, yếu, rễ mọc từ thân, cuống hay vị trí thân có tiếp xúc với mơi trường ni cấy, gốc có hình thành mơ sẹo biểu rõ qua (Hình 3.4) điều gây ảnh hưởng đến hấp thu dinh dưỡng dễ gây thối hoại tử đưa trồng vườn ươm Trong nghiệm thức đối chứng rễ hình thành với hình thái tương đồng nhau, rễ nhỏ giịn, dễ gãy Như vậy, thí nghiệm mơi trường MS có bổ sung 0,3 mg/l NAA; 7g/l agar; 30g/l đường lả mơi trường thích hợp cho việc rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) Hình 3.4 Kết khảo sát đến khả rễ violet (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô Ghi chú: Ban đầu: mẫu trước đưa vào cấy; D1: đối chứng; D2: bổ sung 0,3 mg/l-NAA; D3: bổ sung 0,5 mg/l-NAA; D4: bổ sung 0,7 mg/l-NAA; D5: bổ sung mg/l-NAA; D6: bổ sung 1,5 mg/l-NAA; D7: bổ sung mg/l-NAA 23 Chương Kết luận kiến nghị CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài đưa kết luận sau: - Mơi trường ¾ MS + g/l agar + 30g/l đường mơi trường thích hợp cho sinh trưởng phát triển chồi Violet Châu Phi (Saintpaulia) - Cytokinin thích hợp cho sinh trưởng phát triển KIN nồng độ 0,3 mg/l + g/l agar + 30g/l đường - Gibberellin thích hợp cho sinh trưởng phát triển GA3 nồng độ 0,5 mg/l + g/l agar + 30 g/l đường - Auxin thích hợp cho tạo rễ in vitro NAA nồng độ 0,3 mg/l + g/l agar + 30 g/l đường 4.2 Kiến nghị Cần khảo sát thêm số loại phân bón để đánh giá đầy đủ trình sinh trưởng Cần tiếp tục theo dõi ảnh hưởng phân bón đến giai đoạn hoa, thực mô hình lớn để đưa quy trình chăm sóc Violet Châu Phi (Saintpaulia) cho chất lượng hoa tốt 24 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Dodd J H., Roberts L W.(1999), Experiments in plant tissue culture, Cambridge University press, United Kingdom [2] GS TS Hồng Minh Tuấn (2006), Giáo trình sinh lý học thực vật, Nhà xuất Đại học sư phạm [3] http://caycanhhn.com [4] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống cấy trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [5] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002) Công nghệ tế bào NXB Đại học Quốc Gia, TP HCM [6] Nguyễn Đức Thành (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội [7] Teixeira da Silva, J A., Zeng, S., Wicaksono, A., Kher, M M., Kim, H., Hosokawa, M., & Dewir, Y H (2017) In vitro propagation of African violet: A review South African Journal of Botany, 112, 501–507 [8] Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm Hoàng Minh Tấn (2007) Sinh lý thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội [9] Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm Hoàng Minh Tấn (2007) Sinh lý thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội 25 ... đề tài ? ?Xây dựng quy trình nhân nhanh giống violet Châu Phi (Saintpaulia) phương pháp nuôi cấy mô tế bào? ?? Chương Tổng quan CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan violet (Saintpaulia) – Tên khoa học:... lịch sử nuôi mô tế bào thực vật 1.5.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.5.3 Tầm quan trọng nuôi cấy mô tế bào 1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực... sinh trưởng phát triển Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 15 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng Auxin đến khả rễ Violet Châu Phi (Saintpaulia) điều kiện nuôi cấy mô 15 2.2.5