Nghiên cứu thu nhận và cố định enzyme glucoamylase và pectinase theo kĩ thuật CLEA (cross linking enzeyme aggregates)

I H C QU C GIA TP HCM I H C BÁCH KHOA TR N TH LINH GIANG NGHIÊN C U THU NH N VÀ C NH ENZYME GLUCOAMYLASE VÀ T CLEA (CROSS-LINKING ENZYME AGGREGATES) Chuyên ngành: Công ngh Sinh h c Mã s : 60 42 80 LU TP H Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang C HOÀN THÀNH T I I H C BÁCH KHOA HCM Cán b ng d n khoa h c : TS Hu nh Ng c Oanh Cán b ch m nh n xét 1: PGS TS Nguy n Ti n Th ng Cán b ch m nh n xét 2: Lu ngày 14 tháng Tâm cb ov t ih Thành ph n H m: Ch t ch h HQG Tp.HCM ng: PGS TS Nguy ng ng: PGS TS Nguy y viên ph n bi n 1: PGS TS Nguy n Ti n Th ng y viên ph n bi n 2: Tâm y viên h ng: TS Hu nh Ng c Oanh Xác nh n c a Ch t ch H i chuyên ngành sau lu CH T CH H ng Khoa qu n lý c s a ch a (n u có) NG NG KHOA i Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang I H C QU C GIA TP.HCM TR I H C BÁCH KHOA C NG HÒA XÃ H I CH T NAM c l p - T - H nh phúc NHI M V LU H tên h c viên: Tr n Th Linh Giang MSHV: 12310727 18/12/1989 N i sinh: Daklak Chuyên ngành: Công ngh Sinh h c Mã s : 60 42 80 I TÀI: Nghiên c u thu nh n c thu t CLEA II nh enzyme glucoamylase pectinase theo k NHI M V VÀ N I DUNG: Nhi m v : Tìm hi u th c hi n t c nh CLEA glucoamylase pectinase ng th i kh o sát tính ch t c a enzyme c ng nh d ng CLEA N i dung: Kh u ki n t c nh enzyme glucoamylase enzyme pectinase thu nh n t n m m c Aspergillus niger b CLEA, bao g m y u t : n tay g n glutaraldehyde, nhi c nh, th i gian c nh Kh o sát tính ch t c a enzyme c t nh d ng CLEA thu nh n t vi sinh v t, bao g m: c u trúc c a kh i CLEA, kh ch t riêng bi t c a t ng enzyme, kh d ng i iv ng c a pH nhi u ng d ng enzyme d ng CLEA x lý hai lo i d ch qu c a hai ch c c a s n ph m III IV NGÀY GIAO NHI M V : 20/01/2014 NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 20/06/2014 V CÁN B H NG D N: TS Hu nh Ng c Oanh ii Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang CÁN B H NG D N CH NHI M B (H tên ch ký) TS Hu nh Ng c Oanh TR NG KHOA (H tên ch ký) iii O Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang L IC L cg il ic Em c m th y th t h nh phúc may m n TS Hu nh Ng c Oanh c th c hi n lu is ng d n t n tình c a Cô Xin c u th i gian, công s c n th i gian th c hi tài Tôi xin g i l i c n t t c Th y Cơ anh ch phịng thí nghi m B mơn Cơng ngh Sinh h i h c Bách khoa Thành ph H b r t nhi u trình th c hi n tài C y Tiên, sinh viên ngành Công ngh Sinh h c khóa n ng ng hành, h tr tơi th c hi n nghiên c u Xin c n l p cao h c Công ngh Sinh h ng hành su t th i gian làm thí nghi m X Giáo d h c Bách khoa Thành ph H o, Ban Giám hi phòng ban ch t u ki n thu n l i cho th c hi n Cu c g i l i bi khuy n khích, ng h c bi tài nghiên c u i i h c t Hóa h i t t c tình u s hoàn thành tài nghiên c u H c viên th c hi n Tr n Th Linh Giang iv Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang TÓM T T c th c hi n v i m c tiêu tìm hi u th c hi ng glucoamylase pectinase tính ch t c a enzyme c nh d ng CLEA Trong nghiên c u t c nh ng th i kh o sát ng d c nh hai lo i enzyme, glucoamylase pectinase, t d ch enzyme thô thu nh n t môi ng nuôi c y n m m c Aspergillus niger K t qu nghiên c u cho th y: b sung vào d ch enzyme ethanol 96O v i t l 2:1 (tác nhân t a:d ch enzyme), 5OC 15 phút 7% glutaraldehyde, khu gi ; hi u su t c glucoamylase 37,85% u gi nhi nh protein 45,06% hi u su t c Vi c kh o sát tính ch t c a enzyme c nh d 5OC nh enzyme c th c hi n d a vào hình ch p SEM c a kh i enzyme d ng CLEA, kh o sát kh d ng kh o sát kh nh ho ng c a pH/to K t i qu t hình ch p SEM cho th y k c kh t5 20 µm Enzyme c nh t d ch nuôi c y s d n l n th v n cịn gi c 70% ho t tính T i pH 8, ho t tính glucoamylase c nh t d ch nuôi c y 40% Glucoamylase c ho t tính t t ph n ng Q trình c nh t nhi ng ni c y có kh nh cao nh enzyme pectinase t d ch nuôi c y v i n c k t qu kh quan: hi u su t c nh protein 66,67% hi u su t c nh enzyme pectinase 57,61% Kích t 50µm Enzyme pectinase c nh t d ch enzyme thu nh n t kh nh ho ng nuôi c i y kh ng c a pH/nhi d ng t t Pectinase c nh t d ch nuôi c y sau l n s d ng v n cịn 95% ho t tính K t qu u ng d ng enzyme c nh d ng CLEA x cho th ng c a d ch qu c gi lý v i enzyme c glucoamylase c c qu nh d ng CLEA l n s d ng th 6, ho t tính c a enzyme nh t ng ni c y v n cịn bi u hi n cao, hàm Enzyme pectinase c nh t d ch nuôi c y cho th y v l ns d u tiên l n s d ng th Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang c gi c qu v d t kho ng 40% so v c gi m l ns u tiên K t qu thí nghi t CLEA hi u qu i v i ngu n i qua trình tinh s ch Làm n i b m quan tr ng c a t CLEA k t h p trình thu nh n c nh enzyme vào m t c, b c tinh s ch, làm u qu c vi nh enzyme Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang SUMMARY The thesis was conducted to find out and carry out CLEA method on objects, glucoamylase and pectinase At the same time, we survey properties of enzyme in CLEA In the study, we applied CLEA method to immobilize two enzymes, glucoamylase and pectinase, from crude enzyme solution obtained from semisolid culture of Aspergillus niger Research results showed: when added ethanol 96O to crude enzyme solution with a 2:1 ratio (precipitation agent: enzyme solution), in 15 minutes at 5OC and 7% glutaraldehyde, stirred, kept at 5°C in hours; Protein immobilization yield was 45.06% and enzyme immobilization yield was 37.85% Survey the properties of enzyme in CLEA was based on image of enzyme in CLEA by SEM, reuse and activity stability under the influences of pH and temperature abilities Size of immobilized glucoamylase in CLEA was 5-20 Immobilized enzyme from the culture medium could be retained 70% activity after using times At pH 8, activity of glucoamylase immobilized from the culture medium was 40% Activity stability of glucoamylase immobilized from the culture medium was good at high temperatures Immobilization pectinase from the culture medium with 10% glutaraldehyde also obtained good results: Protein immobilization yield was 66.67% and enzyme immobilization yield was 57.61%; Size of immobilized pectinase in CLEA reached he enzyme pectinase immobilized from culture medium also showed reuse and structural stability under the influences of pH and temperature abilities well Immobilized enzyme from the culture medium could be retained 95% activity after using times Initial results of application immobilized enzyme (CLEA) in treatment fruit juice showed that the sugar content of the juice increased and turbidity decreased after treatment with immobilized enzyme in CLEA In the 6th time use, the enzyme glucoamylase immobilized from culture medium still made sugar content of juice increased over 70% compared to the increasing content of sugar in the first use Pectinase immobilized from the culture medium also showed good by 40% compared with reducing turbidity in first time use vii Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang Experimental results showed that CLEA method expressed more effectiveness with crude enzyme Highlight the important feature of this method is combining enzyme precipitation and immobilization into the step and skiping enzyme purification, the enzyme can be immobilized directly from crude enzyme solution high-effectively viii Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang C NG HÒA XÃ H I CH cl p T NAM T H nh phúc L u c a h c viên Tr n Th Linh Giang v i s ng d n c a TS Hu nh Ng c Oanh Các s li u k t qu trình bày lu c công b riêng l b i tác gi khác b t k ng d n khoa h c Tác gi lu TS HU NH NG C OANH TR N TH LINH GIANG ix Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 11: Kh o sát kh S l ns d ng tái s d ng theo m c a glucoamylase ic nh OD540nm S l n pha lỗng T ng ho t tính (U) Hi u su t tái s d ng (%) 0,403 20 16,367 100,00 0,436 20 17,687 108,07 0,422 20 17,127 104,65 0,408 20 16,567 101,22 0,383 20 15,566 95,11 0,234 20 9,604 58,68 0,209 10 4,302 26,28 0,179 10 3,701 22,62 (Kh ng m u glucoamylase c B ng 12: Kh o sát kh tái s d ng theo m c a glucoamylase c nh t S l ns d ng OD540nm nh = 0,5 g) ng ni c y S l n pha lỗng T ng ho t tính (U) Hi u su t tái s d ng (%) 0,423 2,221 100,00 0,448 2,352 105,89 0,441 2,313 104,14 0,440 2,310 104,02 0,365 1,920 86,45 0,358 1,886 84,90 0,342 1,803 81,17 0,297 1,570 70,67 (Kh ng m u glucoamylase c 93 nh = 0,5 g) Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 13: Kh o sát kh Th i gian (phút) tái s d ng liên t c c a glucoamylase m ic nh OD540nm S l n pha loãng ng ng (mg/ml) Hi u su t tái s d ng (%) 10 0,536 5,850 100,00 20 0,530 2,710 98,89 30 0,539 2,680 100,55 40 0,522 2,725 97,42 50 0,485 2,640 90,59 60 0,451 2,455 84,32 70 0,474 2,285 88,56 80 0,501 2,400 93,54 90 0,453 2,535 84,69 100 0,421 2,295 78,78 110 0,400 2,135 74,91 120 0,345 2,030 64,76 130 0,315 1,755 59,23 140 0,232 1,605 43,91 (Kh ng m u glucoamylase c 94 nh = 0,5 g) Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 14: Kh o sát kh t Th i gian (phút) OD540nm tái s d ng liên t c c a glucoamylase c ng nuôi c y S l n pha loãng ng ng (mg/ml) Hi u su t tái s d ng (%) 10 0,396 2,237 100,00 20 0,415 1,205 104,86 30 0,418 1,263 105,60 40 0,360 1,272 91,03 50 0,340 1,097 86,18 60 0,387 1,038 97,76 70 0,357 1,178 90,29 80 0,357 1,088 90,41 90 0,353 1,089 89,41 100 0,347 1,077 87,80 110 0,345 1,058 87,30 120 0,329 1,052 83,31 130 0,323 1,004 81,82 140 0,300 0,986 76,21 (Kh ng m u glucoamylase c nh = 0,5 g) 2.5 ETM ETM 1.5 ETH ETH 0.5 0 20 40 60 80 Hình 5: Bi 100 120 140 160 ng tái s d ng liên t c 95 nh Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 15: Kh o sát kh ng c a glucoamylase c ng c a pH i Ngu n glucoamylase i ng nuôi c y ng enzyme s d ng (g) OD(540nm)TB 0,0131 0,087 ± 0,022 0,0116 0,448 ± 0,020 0,0150 0,456 ± 0,040 0,0125 0,089 ± 0,011 0,0111 0,212 ± 0,011 0,0124 0,447 ± 0,013 0,0120 0,371 ± 0,023 0,0124 0,176 ± 0,019 pH Kh B ng 16: Kh o sát kh ng c a glucoamylase c i Ngu n Nhi glucoamylase i ng nuôi c y nh d ng (OC) nh d ng ng c a nhi Kh ng enzyme s d ng (g) OD(540nm)TB 50 0,0130 0,515 ± 0,117 60 0,0121 0,453 ± 0,045 70 0,0126 0,238 ± 0,013 80 0,0157 0,121 ± 0,003 50 0,0150 0,560 ± 0,062 60 0,0131 0,547 ± 0,013 70 0,0105 0,345 ± 0,013 80 0,0112 0,217 ± 0,021 96 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang Kh o sát trình c B ng 17: X nh pectinase theo k thu t CLEA nh ho t tính pectinase c a d ch enzyme thu nh n t ng nuôi c y Nghi m th c N glutaraldehyde Th tích s d ng (ml) S l n pha loãng 100 100 0,350 ± 0,019 0,214 ± 0,013 100 100 0,333 ± 0,011 0,205 ± 0,007 100 100 0.309 ± 0,010 0,189 ± 0,007 Ho t tính OD(584nm)TB pectinase (U/ml) (%v/v) Th i gian c nh (h) Nhi c O nh ( C) B ng 18: ng c a n ns c nh enzyme pectinase nh ho t tính pectinase N glutaraldehyde (%v/v) Kh i OD(750nm)TB ng enzyme S l n pha s d ng loãng OD(584nm)TB (g) 10 11 0,813 ± 0,011 0,701 ± 0,002 0,682 ± 0,003 0,684 ± 0,015 0,645 ± 0,003 0,623 ± 0,006 0,581 ± 0,008 0,691 ± 0,011 0,0284 0,0271 0,0266 0,0270 0,0284 0,0260 0,0275 0,0278 97 50 50 50 50 50 50 50 50 0,129 ± 0,007 0,307 ± 0,014 0,340 ± 0,023 0,497 ± 0,021 0,446 ± 0,019 0,460 ± 0,001 0,700 ± 0,006 0,386 ± 0,045 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 19: nh h cr at a pectinase c c r u c r a cu i VNaOH VNaOH u (ml) sau (ml) nh ng ng glutaraldehyde glutaraldehyde trung bình (mg) (mg) L n1 6,0 6,2 250,25 L n2 6,5 6,8 375,38 L n3 7,0 7,2 250,25 L n1 8,0 8,0 L n2 8,0 8,0 L n3 8,0 8,0 B ng 20: ng c a th i gian c 291,96 ± 72,24 ns c nh enzyme pectinase nh ho t tính pectinase Kh i Th i gian c nh (h) OD(750nm)TB 0,657 ± 0,009 0,632 ± 0,005 0,662 ± 0,011 0,681 ± 0,012 0,707 ± 0,007 0,714 ± 0,006 ng enzyme S l n pha s d ng (g) loãng 0,0205 0,0228 0,0233 0,0224 0,0231 0,0210 98 50 50 50 50 50 50 OD(584nm)TB 0,536 ± 0,047 0,740 ± 0,008 0,640 ± 0,054 0,583 ± 0,016 0,505 ± 0,002 0,423 ± 0,003 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 21: ng c a nhi ns c nh enzyme pectinase nh ho t tính pectinase Nhi c nh (OC) OD(750nm)TB Kh i ng enzyme s d ng S l n pha loãng OD(584nm)TB (g) 10 25 30 0,637 ± 0,014 0,512 ± 0,010 0,581 ± 0,004 0,707 ± 0,007 0,714 ± 0,006 B ng 22: Kh o sát kh S l ns 50 50 50 50 50 0,607 ± 0,004 0,779 ± 0,010 0,618 ± 0,004 0,420 ± 0,004 0,340 ± 0,003 tái s d ng theo m c a pectinase m ic nh OD584nm d ng 0,0232 0,0224 0,0227 0,0228 0,0216 S l n pha T ng ho t Hi u su t tái lỗng tính (U) s d ng (%) 0,846 50 0,813 100,00 0,792 50 0,759 93,38 0,851 50 0,818 100,61 0,842 50 0,809 99,51 0,787 50 0,754 92,76 0,631 50 0,599 73,63 0,512 50 0,480 59,04 0,499 50 0,467 57,44 (Kh ng m u pectinase c 99 nh = 0,03 g) Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 23: Kh o sát kh S l ns d ng OD584nm tái s d ng theo m c a pectinase c ng nuôi c y nh t S l n pha loãng T ng ho t tính (U) Hi u su t tái s d ng (%) 0,727 50 0,501 100,00 0,731 50 0,503 100,57 0,732 50 0,504 100,72 0,720 50 0,496 98,99 0,714 50 0,491 98,13 0,706 50 0,485 96,98 0,613 50 0,419 83,63 0,601 50 0,410 81,91 (Kh ng m u pectinase c B ng 24: Kh o sát kh ng c a pectinase c i Ngu n enzyme m i Môi ng nuôi c y pH nh = 0,03 g) nh d ng CLEA ng c a pH Kh ng enzyme s S l n pha d ng loãng OD(584nm)TB 0,0243 50 0,295 ± 0,023 0,0222 50 0,540 ± 0,006 0,0284 50 0,430 ± 0,020 0,0241 50 0,107 ± 0,004 0,0292 50 0,346 ± 0,017 0,0263 50 0,664 ± 0,040 0,0306 50 0,582 ± 0,043 0,0285 50 0,307 ± 0,008 100 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 25: Kh o sát kh ng c a pectinase c ng c a nhi i Ngu n enzyme Nhi t Kh ng enzyme s S l n pha ( C) d ng (g) loãng 30 40 50 60 30 40 50 60 0,0303 0,0302 0,0268 0,0287 0,0313 0,0320 0,0297 0,0297 50 50 50 50 50 50 50 50 O m i Môi ng nuôi c y B nh d ng CLEA OD(584nm)TB 0,685 ± 0,019 0,628 ± 0,062 0,322 ± 0,016 0,231 ± 0,036 0,781 ± 0,024 0,724 ± 0,047 0,485 ± 0,040 0,328 ± 0,011 u ng d ng enzyme glucoamylase pectinase c CLEA s n xu t B ng 26: Kh o sát kh S l ns S l n pha d ng loãng u nh d ng c qu d ng c a x lý d ch qu ic nh C OD540nm OD600nm OD540nm OD600nm 100 0,055 0,750 0,351 0,935 100 0,215 0,112 0,485 0,462 100 0,235 0,109 0,481 0,459 100 0,209 0,145 0,474 0,485 100 0,187 0,567 0,467 0,689 100 0,182 0,698 0,453 0,751 100 0,078 0,707 0,365 0,884 101 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 27: Kh o sát kh d ng c a enzyme c ng nuôi c y x lý d ch qu S l ns S l n pha d ng loãng u nh t môi C OD540nm OD600nm OD540nm OD600nm 100 0,055 0,750 0,351 0,935 100 0,162 0,052 0,463 0,388 100 0,161 0,035 0,463 0,397 100 0,170 0,042 0,476 0,452 100 0,173 0,247 0,452 0,448 100 0,153 0,376 0,441 0,689 100 0,147 0,402 0,434 0,723 102 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang PH L C 5: M T S HÌNH HAI LO I TH C PH M C NH THÍ NGHI M VÀ THƠNG TIN V S D NG TRONG THÍ NGHI M Thành ph n hóa h c c a c mã th y) Hình 6: C B ng 28: Thành ph n hóa h c c a c Thành ph n hóa h c T l c 68,52% Tinh b t 18,75% Protein 2,25% Ch t béo 0,19% Ch t khoáng 1,58% ng Pectin c bi t c a Puchiin, m t ch t có tính kháng khu n khơng ch u nhi u gi i thích t i d ch ép c l i có tác d ng c ch 103 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang i v i m t s lo i vi khu c u vàng, tr c khu n, m c gi i nhi t t t y h c c truy n, v y, hi n c cs d ng tinh b t nh c u ng Bên c ng l i th ch n c nh hi u qu ho ng c a enzyme glucoamylase c nh o sát Thành ph n hóa h c c a qu i d a, khóm) Hình 7: Qu a pectin làm kh i d ch qu nghi n s tr ng thái keo, ch qu c, nh enzyme pectinase phân gi i ch t pectin mà d ch qu tr nên su t không b v c, l c r t d dàng Ngoài pectinase cịn góp ph n chi t rút ch t màu, tanin ch v y, s d ng th ho ng c a enzyme pectinase c ng s n ph d nh 104 c m quan Vì c hi u qu Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang B ng 29: Thành ph n hóa h c c Thành ph n hóa h c T l c Ch t khô ng 72 88% 12 t khô hòa tan chi m 15 24% 19% m 70% Acid 0,3 0,8% Ph n l n acid citric, ngồi cịn có acid malic, tartaric, succinic) Protid 0,5% Khống 0,25% Vitamin C 40mg% M t s Vitamin nhóm B Enzyme Bromelain 105 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang M t s hình nh thí nghi m Hình 8: Hydroxylamin HCl 7% Hình 9: i ch ng) c r a cu Hình 10: D ch qu c sau x lý v cc Hình 11: D ch qu cr u ic nh c sau x lý v i enzyme c sau x lý v i enzyme c sau x lý v i enzyme c nh n t cc ng cr at a nh t d ch enzyme thu ng nuôi c y c sau x lý v i enzyme c sau x lý v i enzyme 106 Lu HVTH: Tr n Th Linh Giang PH N LÝ L CH TRÍCH NGANG H tên: Tr n Th Linh Giang 18/12/1989 a ch liên l c: ng s N i sinh: Daklak ng 12, qu n Gò V p, Tp.HCM T O 2007 Chí Minh 2012 Minh Bách khoa 107 ... s : 60 42 80 I TÀI: Nghiên c u thu nh n c thu t CLEA II nh enzyme glucoamylase pectinase theo k NHI M V VÀ N I DUNG: Nhi m v : Tìm hi u th c hi n t c nh CLEA glucoamylase pectinase ng th i kh... th c hi ng glucoamylase pectinase tính ch t c a enzyme c nh d ng CLEA Trong nghiên c u t c nh ng th i kh o sát ng d c nh hai lo i enzyme, glucoamylase pectinase, t d ch enzyme thô thu nh n t... t s cơng trình nghiên c u v t CLEA Nghiên c u c a R.A Sheldon c ng s aggregates (CLEA) : M -linked enzyme nh enzyme tân th i linh ho C nh enzyme b t CLEA ng d ng c a enzyme d ng CLEA chuy n hóa