Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của enzyme lipase từ mủ đu đủ

Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của enzyme lipase từ mủ đu đủ Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của enzyme lipase từ mủ đu đủ Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của enzyme lipase từ mủ đu đủ Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của enzyme lipase từ mủ đu đủ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA * NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ XUÂN HÀ Đà Nẵng – Năm 2018 TÓM TẮT Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ” Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Xuân Hà Số thẻ sinh viên: 107130064 Lớp: 13H2A Chế phẩm enzyme lipase thu từ phần khơng hịa tan nước sau ly tâm mủ đu đủ Enzyme lipase từ mủ đu đủ “enzyme cố định tự nhiên”, thể hoạt tính xúc tác khác với loại chất Trong nghiên cứu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ phương pháp khác Nghiên cứu tính đặc hiệu chất enzyme lipase từ mủ đu đủ, với chất: dầu cá hồi, dầu đậu nành, triolein tristearin Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ đến hoạt độ enzyme lipase chất dầu cá hồi Kết cho thấy hoạt lực chế phẩm enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ cao phương pháp (sấy thăng hoa) với hoạt lực enzyme 544.41 UI/g enzyme khô, cao gấp 1.6 lần so với phương pháp (sấy thường) 2.6 lần so với phương pháp (phơi nắng) Mức độ ưu tiên thủy phân enzyme lipase từ mủ đu đủ gốc acyl triglycerides theo thứ tự giảm dần: axit béo đa bất bão hoà > axit béo đơn bất bão hoà > axit béo no (xét theo gốc acyl triglycerides) Hoạt lực enzyme lipase chất dầu cá hồi đạt cao (261 UI/g) điều kiện nhiệt độ 45°C, pH = thời gian 15 phút Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ phương pháp tủa với nồng độ muối (NH4)2SO4 60% kết hợp với sắc ký trao đổi ion điện di xác định kích thước phân tử kích thước nằm khoảng 35 – 45kDa ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA: HĨA CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lớp: PHẠM THỊ XUÂN HÀ 13H2A Khoa: Hóa Số thẻ sinh viên : 107130064 Ngành: Công nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu thu nhận xác đinh đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ” Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Lời mở đầu Chương : Tổng quan Chương : Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương : Kết thảo luận Kết luận Tài liệu tham khảo Các vẽ, đồ thị ( ghi rõ loại kích thước vẽ ): Không Họ tên người hướng dẫn: PGS TS Đặng Minh Nhật Th S Phan Thị Việt Hà Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 23 / 01 / 2018 Ngày hoàn thành đồ án: 30 / 05 / 2018 Trưởng Bộ môn …………………… Đà Nẵng, ngày tháng năm 2018 Người hướng dẫn LỜI CẢM ƠN Sau tháng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình Thầy Đặng Minh Nhật, với giúp đỡ thầy cô bạn sinh viên phịng thí nghiệm, tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Trước hết cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến Thầy Đặng Minh Nhật tận tình hướng dẫn, giúp đỡ từ việc chọn đề tài hồn thành đồ án tốt nghiệp Trong suốt thời gian thực đồ án, Thầy cung cấp cho tơi nhiều kiến thức bổ ích, ln định hướng, góp ý sửa chữa chỗ sai, để từ giúp tơi nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến đồ án hoàn thành đồ án cách tốt Bên cạnh đó, tơi cảm ơn cô Phan Thị Việt Hà hướng dẫn, hỗ trợ tơi q trình tìm kiếm nghiên cứu tài liệu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm – Sinh học, thầy phịng thí nghiệm tất bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ động viên suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Cuối cho tơi cảm ơn thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đồ án tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Phạm Thị Xuân Hà i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp thành từ nghiên cứu hoàn toàn thực tế sở số liệu thực tế thực theo hướng dẫn giáo viên hướng dẫn Đồ án thực hoàn toàn thành riêng tôi, không chép theo đồ án tương tự Mọi tham khảo sử dụng đồ án trích dẫn nguồn tài liệu báo cáo danh mục tài liệu tham khảo Mọi chép không hợp lệ, vi phạm quy chế nhà trường, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Sinh viên thực Phạm Thị Xuân Hà ii MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp Lời cảm ơn i Lời cam đoan .ii Mục lục iii Danh sách bảng, hình vẽ vi Danh sách chữ viết tắt .viii Lời mở đầu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ 1.1.1 Nguồn gốc phân bố 1.1.2 Hình thái sinh lý đu đủ 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế đặc tính dược lý đu đủ 1.1.4 Mủ đu đủ 1.2 Tổng quan enzyme lipase 1.2.1 Định nghĩa enzyme lipase 1.2.2 Phân loại cấu trúc enzyme lipase 1.2.3 Tính chất enzyme lipase 11 1.2.4 Cơ chế xúc tác enzyme lipase 12 1.2.5 Một số phản ứng đặc trưng enyme lipase 13 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân enzyme 14 1.2.7 Ứng dụng enzyme lipase 15 1.2.8 Tình hình nghiên cứu nước enzyme lipase 17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Mủ đu đủ 21 iii 2.1.2 Dầu cá hồi 21 2.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 21 2.2.1 Thiết bị phục vụ nghiên cứu 21 2.2.2 Hóa chất 22 2.3 Phương pháp phân tích 23 2.3.1 Phương pháp phân tích vật lý 23 2.3.2 Phương pháp hóa học – Chuẩn độ xác định hoạt lực chế phẩm lipase thô 21 2.3.3 Phương pháp hóa lý – Đo quang xác định hoạt lực chế phẩm lipase thô 21 2.4 Phương pháp tiến hành 21 2.4.1 Phương pháp thu nhận mủ đu đủ 21 2.4.2 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đu 22 2.4.3 Phương pháp thu nhận dầu cá hồi thô 25 2.4.4 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ lipase 26 2.4.5 Khảo sát đặc tính chế phẩm enzyme lipase thơ 28 2.4.6 Phương pháp nghiên cứu tinh enzyme lipase thô 28 2.5 Xử lý số liệu 33 Chương 3: KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô 34 3.2 Nghiên cứu xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ 36 3.2.1 Khảo sát tính đặc hiệu chất enzyme lipase 36 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoat lực enzyme lipase từ mủ đu đủ 38 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme lipase 40 3.3 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 42 3.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn xác định hoạt lực phương pháp đo quang 42 3.3.2 Kết xác định điểm đẳng điện 43 3.3.3 Kết chạy sắc ký ion tinh enzyme lipase từ mủ đu đu 44 iv 3.3.4 Kết kiểm tra phương pháp điện di 46 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 v DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Danh mục hình vẽ Hình 1.1 Quả đu đủ Hình 1.2 Cấu trúc tinh thể lipase 10 Hình 1.3 Mơ hình hoạt động lipase chất hồ tan khơng tan nước Sự thay đổi hình thể lipase trình hoạt động xúc tác 12 Hình 1.4 Phản ứng thủy phân 13 Hình 1.5 Phản ứng este hóa 13 Hình 1.6 Phản ứng trao đổi este 13 Hình 1.7 Phản ứng chuyển este 14 Hình 2.1 Vườn đu đủ lấy mủ Đại Lộc, Quảng Nam 21 Hình 2.2 Lườn cá hồi thu mua Cơng ty TNHH chế biến thực phẩm D&N 21 Hình 2.3 Máy ly tâm 22 Hình 2.4 Máy đo pH 22 Hình 2.5 Máy đo quang 22 Hình 2.6 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thơ theo phương pháp 22 Hình 2.7 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase theo phương pháp 23 Hình 2.8 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo phương pháp 24 Hình 2.9 Sơ đồ thu nhận dầu cá hồi 26 Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu tinh chế phẩm lipase thơ 29 Hình 3.1 Chế phẩm lipase thô thu nhận theo phương pháp 34 Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu suất thu nhận hoạt lực chế phẩm liapse thô từ phương pháp thu nhận khác 35 Hình 3.3 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Hình 3.6 Đường chuẩn đo quang hợp chất p-NP Hình 3.7 Hình ảnh thu enzyme lipase sau sắc ký trao đổi ion 37 39 41 42 44 Hình 3.8 Hình ảnh thu enzyme lipase sau sắc ký trao đổi ion (mẫu lặp) 45 Hình 3.9 Kết chạy điện di SDS-PAGE 46 vi Danh mục bảng Bảng 1.1 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý Bảng 1.2 Hình ảnh mô tả thái đu đủ Bảng 1.3 Hình thái số loại đu đủ Bảng 1.4 Cho biết tính đặc hiệu số enzyme lipase 11 Bảng 2.1 Bảng hóa chất xuất sứ 22 Bảng 2.2 Tóm tắt bước tiến hành để xác định hoạt độ enzyme lipase 27 Bảng 3.1 So sánh hiệu suất thu nhận hoạt lực chế phẩm lipase thô 35 Bảng 3.2 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 37 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 39 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 40 Bảng 3.5 Kết đo quang để xác định đường chuẩn 42 Bảng 3.6 Kết đo độ đục dung dịch enzyme lipase bước sóng 620 nm.43 Bảng 3.7 Hoạt độ phân đoạn liase sau chạy sắc ký 45 vii nghiên cứu khoa học Khoa Hóa Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng năm 2016 – 2017 [14] Quyền Đình Thi (2009), Phân lập số vi khuẩn nấm Việt Nam có khả sinh tổng hợp lipase mới, nghiên cứu tái tổ hợp ứng dụng chúng công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học, Hà Nội [15] Bùi Hồng Quân – Nguyễn Đức Lượng (2009), “Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Pichia Anomala Vtcc Y0787 sử dụng ma trận plackett-burman phương pháp đáp ứng bề mặt - phương án cấu trúc có tâm”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Tài liệu tham khảo nước [16] Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth (2011), Carica papaya lipase: A naturally immobilized enzyme with interesting biochemical properties, Plant foods hum nutri Vol 66, Page 67-70 [17] Teixeira da Silva (2007), Papaya (Carica papaya L.) Biology and Biotechnology, Tree and Forestry Science and Biotechnology, Global Science Books [18] Rubens Monti et al (2000), Purification of papain from fresh latex of Carica papaya, Brazilian archieves of biology and technology, Page 43-46 [19] Carla Tecelao, Ivanna Rivera, Georgina Sandoval and Suzana Ferreira-Dias (2012), Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production, J Lipid Sci Technol, Page 114-116 [20] Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S and Balasubramanian T (2011), Thermostable alkaline tolerant lipase from Bacillus licheniformis using peanut oil cake as a substrate, African Journal of Biochemistry Research [21] Fernanda Wiermann Paques (2008), Characterization of the lipase from Carica papaya residues, Braz J Food Technol, Page 20-27 [21] Christoph Brunschwiler (2013), Direct measurement of rice bran lipase activity for inactivation kinetics and storage stability prediction, Journal of Cereal Science, Page 272-277 [22] Curso de Postgrado (2002), Enzymeic Enhancement of ω3 Polyunsaturated Fatty Acids Content in Brazilian Sardine Oil, Acta Farm Bonaerense, Page 85-87 SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 49 [24] Georgina Sandoval (2012), Lipases and Phospholipases, Industrial Biotechnology Unit Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diso del Estado de Jalisco A.C (CIATEJ) Guadalajara, Jalisco, Mexico, Page 4-8 [25] José Murillo P Barbosa, Ranyere L Souza (2011), Biochemical characterisation of lipase from a new strain of Bacillus, Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Av Murilo Dantas, 300, 49032-490 Aracaju - SE, Brasil, Page 7-10 [25] Laemmli, U K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227(5259), Page 680-685 [27] Matheus H.M Avelar (2013), Hdrolysis of vgetable oils catalyzed by lipase extract powder from dormant castor bean seess, Industrial Crops and Products [28] Muhannad I Massadeh* and Fatima M Sabra (2011), Production and characterization of lipase from Bacillus stearothermophilus, African Journal of Biotechnology Vol 10, Page 139-146 [29] Nathalie Barouth, Slim Abdelkafi (2010), Neutral lipid characterization of Non – water – soluble fractions of Carica papaya latex, J Am Oil Chem Soc, Page 8788 [30] Poonsuk Prasertsan (2008), Comparison and Selection of protease and lipase sources from visceral organs of three tuna species, Songklanakarin J.Sci Technol, Page 73 – 76 [31] Pablo Domínguez de María, José V Sinisterra, Shau-Wei Tsai, Andrés R Alcántara (2006), Carica papaya lipase (CPL): An emerging and versatile biocatalyst, Biotechnology Advances, Page 493–499 [32] Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G (2012), Plant lipases: partial purification of Carica papaya lipase, Methods Mol Bio [33] Richard R Burgess ( 2009), Protein Precipitation Techniques, University of Wisconsin–Madison, Madison, Wisconsin, USA, Page 330-340 [34] R Dhouib1, J Laroche-Traineau2, R Shaha1, D Lapaillerie3, E Solier3 (2010), Identification of a putative triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics, SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 50 [35] Sonali Seth, Debamitra Chakravorty, Vikash Kumar Dubey, Sanjukta Patra (2013), An insight into plant lipase research – challenges encountered, Protein expression and purification Vol 95, page 2-3 [36] P Villeneuve, M Pina, A Skarbek (1997), Specificity of Carica papaya latex lipase – catalyzed interesterification reactions, Biotechnology Techniques, Vol11, No Tài liệu Web [37] http://www.congdanchuyennghiep.com/san-pham/du-du%CC%89-xanh- 1kg/ SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 51 ... ly tâm mủ đu đủ Enzyme lipase từ mủ đu đủ ? ?enzyme cố định tự nhiên”, thể hoạt tính xúc tác khác với loại chất Trong nghiên cứu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ phương... lipase từ mủ đu đủ? ?? SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ 2.2 Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu thu. .. tế việc xác định đặc tính enzyme quan trọng Đã có số nghiên cứu khảo sát đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ, nhiên enzyme lipase từ mủ đu đủ thể hoạt lực xúc tác khác chất Do nghiên cứu chúng