Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của enzyme lipase từ mủ đu đủ

Chế phẩm enzyme lipase thu được từ phần không hòa tan trong nước sau khi ly tâm mủ đu đủ. Enzyme lipase từ mủ đu đủ là “enzyme cố định tự nhiên”, thể hiện hoạt tính xúc tác khác nhau với mỗi loại cơ chất. Trong bài nghiên cứu này tôi đã nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ bằng các phương pháp khác nhau. Nghiên cứu tính đặc hiệu cơ chất của enzyme lipase từ mủ đu đủ, với 4 cơ chất: dầu cá hồi, dầu đậu nành, triolein và tristearin. Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến hoạt độ enzyme lipase trên cơ chất dầu cá hồi. Kết quả cho thấy hoạt lực của chế phẩm enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ cao nhất ở phương pháp 3 (sấy thăng hoa) với hoạt lực enzyme 544.41 UIg enzyme khô, cao gấp 1.6 lần so với phương pháp 1 (sấy thường) và 2.6 lần so với phương pháp 2 (phơi nắng). Mức độ ưu tiên thủy phân của enzyme lipase từ mủ đu đủ đối với gốc acyl của triglycerides theo thứ tự giảm dần: axit béo đa bất bão hoà > axit béo đơn bất bão hoà > axit béo no (xét theo gốc acyl của triglycerides). Hoạt lực enzyme lipase trên cơ chất dầu cá hồi đạt cao nhất (261 UIg) ở điều kiện nhiệt độ 45°C, pH = 8 và trong thời gian 15 phút. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng phương pháp tủa với nồng độ muối (NH4)2SO4 60% kết hợp với sắc ký trao đổi ion và điện di xác định kích thước phân tử kích thước nằm trong khoảng 35 – 45kDa.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA * NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ XUÂN HÀ Đà Nẵng – Năm 2018 TÓM TẮT Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ” Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Xuân Hà Số thẻ sinh viên: 107130064 Lớp: 13H2A Chế phẩm enzyme lipase thu từ phần khơng hịa tan nước sau ly tâm mủ đu đủ Enzyme lipase từ mủ đu đủ “enzyme cố định tự nhiên”, thể hoạt tính xúc tác khác với loại chất Trong nghiên cứu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ phương pháp khác Nghiên cứu tính đặc hiệu chất enzyme lipase từ mủ đu đủ, với chất: dầu cá hồi, dầu đậu nành, triolein tristearin Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ đến hoạt độ enzyme lipase chất dầu cá hồi Kết cho thấy hoạt lực chế phẩm enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ cao phương pháp (sấy thăng hoa) với hoạt lực enzyme 544.41 UI/g enzyme khô, cao gấp 1.6 lần so với phương pháp (sấy thường) 2.6 lần so với phương pháp (phơi nắng) Mức độ ưu tiên thủy phân enzyme lipase từ mủ đu đủ gốc acyl triglycerides theo thứ tự giảm dần: axit béo đa bất bão hoà > axit béo đơn bất bão hoà > axit béo no (xét theo gốc acyl triglycerides) Hoạt lực enzyme lipase chất dầu cá hồi đạt cao (261 UI/g) điều kiện nhiệt độ 45°C, pH = thời gian 15 phút Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ phương pháp tủa với nồng độ muối (NH4)2SO4 60% kết hợp với sắc ký trao đổi ion điện di xác định kích thước phân tử kích thước nằm khoảng 35 – 45kDa ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA: HĨA CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lớp: PHẠM THỊ XUÂN HÀ 13H2A Khoa: Hóa Số thẻ sinh viên : 107130064 Ngành: Công nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu thu nhận xác đinh đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ” Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Lời mở đầu Chương : Tổng quan Chương : Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương : Kết thảo luận Kết luận Tài liệu tham khảo Các vẽ, đồ thị ( ghi rõ loại kích thước vẽ ): Không Họ tên người hướng dẫn: PGS TS Đặng Minh Nhật Th S Phan Thị Việt Hà Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 23 / 01 / 2018 Ngày hoàn thành đồ án: 30 / 05 / 2018 Trưởng Bộ môn …………………… Đà Nẵng, ngày tháng năm 2018 Người hướng dẫn LỜI CẢM ƠN Sau tháng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình Thầy Đặng Minh Nhật, với giúp đỡ thầy cô bạn sinh viên phịng thí nghiệm, tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Trước hết cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến Thầy Đặng Minh Nhật tận tình hướng dẫn, giúp đỡ từ việc chọn đề tài hồn thành đồ án tốt nghiệp Trong suốt thời gian thực đồ án, Thầy cung cấp cho tơi nhiều kiến thức bổ ích, ln định hướng, góp ý sửa chữa chỗ sai, để từ giúp tơi nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến đồ án hoàn thành đồ án cách tốt Bên cạnh đó, tơi cảm ơn cô Phan Thị Việt Hà hướng dẫn, hỗ trợ tơi q trình tìm kiếm nghiên cứu tài liệu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm – Sinh học, thầy phịng thí nghiệm tất bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ động viên suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Cuối cho tơi cảm ơn thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đồ án tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Phạm Thị Xuân Hà i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp thành từ nghiên cứu hoàn toàn thực tế sở số liệu thực tế thực theo hướng dẫn giáo viên hướng dẫn Đồ án thực hoàn toàn thành riêng tôi, không chép theo đồ án tương tự Mọi tham khảo sử dụng đồ án trích dẫn nguồn tài liệu báo cáo danh mục tài liệu tham khảo Mọi chép không hợp lệ, vi phạm quy chế nhà trường, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Sinh viên thực Phạm Thị Xuân Hà ii MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp Lời cảm ơn i Lời cam đoan .ii Mục lục iii Danh sách bảng, hình vẽ vi Danh sách chữ viết tắt .viii Lời mở đầu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ 1.1.1 Nguồn gốc phân bố 1.1.2 Hình thái sinh lý đu đủ 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế đặc tính dược lý đu đủ 1.1.4 Mủ đu đủ 1.2 Tổng quan enzyme lipase 1.2.1 Định nghĩa enzyme lipase 1.2.2 Phân loại cấu trúc enzyme lipase 1.2.3 Tính chất enzyme lipase 11 1.2.4 Cơ chế xúc tác enzyme lipase 12 1.2.5 Một số phản ứng đặc trưng enyme lipase 13 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân enzyme 14 1.2.7 Ứng dụng enzyme lipase 15 1.2.8 Tình hình nghiên cứu nước enzyme lipase 17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Mủ đu đủ 21 iii 2.1.2 Dầu cá hồi 21 2.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 21 2.2.1 Thiết bị phục vụ nghiên cứu 21 2.2.2 Hóa chất 22 2.3 Phương pháp phân tích 23 2.3.1 Phương pháp phân tích vật lý 23 2.3.2 Phương pháp hóa học – Chuẩn độ xác định hoạt lực chế phẩm lipase thô 21 2.3.3 Phương pháp hóa lý – Đo quang xác định hoạt lực chế phẩm lipase thô 21 2.4 Phương pháp tiến hành 21 2.4.1 Phương pháp thu nhận mủ đu đủ 21 2.4.2 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đu 22 2.4.3 Phương pháp thu nhận dầu cá hồi thô 25 2.4.4 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ lipase 26 2.4.5 Khảo sát đặc tính chế phẩm enzyme lipase thơ 28 2.4.6 Phương pháp nghiên cứu tinh enzyme lipase thô 28 2.5 Xử lý số liệu 33 Chương 3: KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô 34 3.2 Nghiên cứu xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ 36 3.2.1 Khảo sát tính đặc hiệu chất enzyme lipase 36 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoat lực enzyme lipase từ mủ đu đủ 38 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme lipase 40 3.3 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 42 3.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn xác định hoạt lực phương pháp đo quang 42 3.3.2 Kết xác định điểm đẳng điện 43 3.3.3 Kết chạy sắc ký ion tinh enzyme lipase từ mủ đu đu 44 iv 3.3.4 Kết kiểm tra phương pháp điện di 46 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 v DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Danh mục hình vẽ Hình 1.1 Quả đu đủ Hình 1.2 Cấu trúc tinh thể lipase 10 Hình 1.3 Mơ hình hoạt động lipase chất hồ tan khơng tan nước Sự thay đổi hình thể lipase trình hoạt động xúc tác 12 Hình 1.4 Phản ứng thủy phân 13 Hình 1.5 Phản ứng este hóa 13 Hình 1.6 Phản ứng trao đổi este 13 Hình 1.7 Phản ứng chuyển este 14 Hình 2.1 Vườn đu đủ lấy mủ Đại Lộc, Quảng Nam 21 Hình 2.2 Lườn cá hồi thu mua Cơng ty TNHH chế biến thực phẩm D&N 21 Hình 2.3 Máy ly tâm 22 Hình 2.4 Máy đo pH 22 Hình 2.5 Máy đo quang 22 Hình 2.6 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thơ theo phương pháp 22 Hình 2.7 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase theo phương pháp 23 Hình 2.8 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo phương pháp 24 Hình 2.9 Sơ đồ thu nhận dầu cá hồi 26 Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu tinh chế phẩm lipase thơ 29 Hình 3.1 Chế phẩm lipase thô thu nhận theo phương pháp 34 Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu suất thu nhận hoạt lực chế phẩm liapse thô từ phương pháp thu nhận khác 35 Hình 3.3 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Hình 3.6 Đường chuẩn đo quang hợp chất p-NP Hình 3.7 Hình ảnh thu enzyme lipase sau sắc ký trao đổi ion 37 39 41 42 44 Hình 3.8 Hình ảnh thu enzyme lipase sau sắc ký trao đổi ion (mẫu lặp) 45 Hình 3.9 Kết chạy điện di SDS-PAGE 46 vi Danh mục bảng Bảng 1.1 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý Bảng 1.2 Hình ảnh mô tả thái đu đủ Bảng 1.3 Hình thái số loại đu đủ Bảng 1.4 Cho biết tính đặc hiệu số enzyme lipase 11 Bảng 2.1 Bảng hóa chất xuất sứ 22 Bảng 2.2 Tóm tắt bước tiến hành để xác định hoạt độ enzyme lipase 27 Bảng 3.1 So sánh hiệu suất thu nhận hoạt lực chế phẩm lipase thô 35 Bảng 3.2 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 37 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 39 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 40 Bảng 3.5 Kết đo quang để xác định đường chuẩn 42 Bảng 3.6 Kết đo độ đục dung dịch enzyme lipase bước sóng 620 nm.43 Bảng 3.7 Hoạt độ phân đoạn liase sau chạy sắc ký 45 vii Đặc hiệu nhóm tương đối: có khả tác dụng lên kiểu liên kết hóa học định phân tử chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo phần tham gia tạo thành mối liên kết Đặc hiệu quang học: tác dụng với hai dạng đồng phân không gian chất Các chất sử dụng khảo sát này: dầu cá hồi, dầu đậu nành, triolein tristearin có gốc acy sau: • Tristearin: Gốc acyl acid béo no • Triolien: Gốc acyl acid béo 18C, không no, nối đơi • Dầu đậu nành: Chủ yếu hỗn hợp acid linolenic, có chưa gốc acyl axit béo khơng no, 1-2 nối đơi • Dầu cá hồi: Gốc acyl acid béo đa bất bão hịa, mạch dài, khơng no, nhiều nối đơi Kết khảo sát tính đặc hiệu chất enzyme lipase từ mủ đu đủ chất khác trình bày bảng 3.2 hình 3.3 Bảng 3.2 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ chất khác Cơ chất Dầu cá hồi Dầu đậu nành Triolein Tristearin 260a 227,8b 210c 150,6d Hoạt độ (UI/ g enzyme) 300 a b Hoạt độ UI/g 250 c 200 d 150 100 50 Dầu cá hồi Dầu đậu nành Triolein Tristearin Cơ chất Hình 3.3 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ chất khác SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 37 Ghi chú: Các giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) Nhận xét kết thí nghiệm: Kết hình 3.3 cho thấy hoạt lực enzyme lipase cao chất dầu cá hồi (260 UI/g enzyme) thấp chất tristearin (150.5 UI/g enzyme) Dựa vào kết khảo sát chất cho thấy lipase từ mủ đu đủ thủy phân ưu tiên với gốc acyl axit béo đa bất bão hịa, nhiều nối đơi gốc acyl axit béo no ➢ Từ đó, xếp mức độ ưu tiên thủy phân enzyme lipase từ mủ đu đủ gốc acyl triglycerides sau: axit béo đa bất bão hoà > axit béo đơn bất bão hoà > axit béo no Kết nghiên cứu cho kết tương tự theo nghiên cứu Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth (2011) cho thấy hoạt lực lipase chất dầu ô liu (256 ± U/g) [16] Sự sai khác điều kiện thủy phân chưa tối ưu, enzyme lipase từ mủ đu đủ thu nhận từ vùng khác Ngoài ra, theo nghiên cứu P Villeneuve, M Pina, A Skarbek cộng (1997) cho thấy lipase từ mủ đu đủ ưu tiên thủy phân gốc acyl mạch ngắn gốc acyl mạch dài [36] Theo nghiên cứu Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth (2011) cho thấy enzyme lipase từ mủ đu đủ thể mức độ ưu tiên với triacylglycerides mạch ngắn trung bình triacylglycerides mạch dài Hoạt lực enzyme lipase từ mủ đu mesocarp khô cọ dầu (250 ± 14 U/g) Lipase từ mủ đu đủ thủy phân phosphatidylcholine với hoạt lực 65 ± U/g, cho thấy khơng có hoạt lực oleate cholesterol [16] Các thí nghiệm sử dụng chất dầu cá hồi để khảo sát yếu tố ảnh hưởng: nhiệt độ, pH đến hoạt lực enzyme lipase từ mủ đu đủ 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt lực enzyme lipase từ mủ đu đủ Bản chất enzyme protein nên tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác enzyme, enzyme thể hoạt tính cao giới hạn nhiệt độ thích hợp Thơng thường, đa số enzyme nhiệt độ thích hợp nằm khoảng từ 40 – 50°C, nhiệt độ lớn 70°C đa số enzyme bị hoạt tính Nhiệt độ yếu tố tác động mạnh mẽ tới hoạt độ enzyme Vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng theo nhiệt độ giới hạn xác định mà phân tử ezyme cịn bền chưa bị biến tính Khi nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng đến giai đoạn vận tốc đạt cực đại, tiếp tục tăng vận tốc SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 38 enzyme giảm Nhiệt độ mà enzyme hoạt động mạnh gọi nhiệt độ tối ưu, enzyme có vùng hoạt độ khác Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cho hoạt động phân giải lipid enzyme lipase từ mủ đu đủ chất dầu cá hồi trình bày bảng 3.3 hình 3.4 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Nhiệt độ (°C) Hoạt độ (UI/g enzyme) 30 35 40 45 50 55 60 133,3d 188,9c 211,1b 261,1a 133,3d 83,3e 77,8f 300 a Hoạt độ UI/g 250 b c 200 150 d d e 100 f 50 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Nhiệt độ (°C) Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Ghi chú: Các giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thơng kê ANOVA (α = 0,05) Nhận xét: Đồ thị cho thấy hoạt độ lipase tăng dần ta tăng nhiệt độ từ 30°C đến 45°C, sau giảm dần tiếp tục tăng nhiệt độ từ 45°C đến 60°C Hoạt độ lipase đạt giá trị cao 261,1 UI/g enzyme 45°C Điều tuân theo quy tắc phản ứng enzyme nghĩa tăng nhiệt độ tốc độ phản ứng enzyme tăng nhiệt độ tăng cao protein enzyme bị biến tính làm cho enzyme bị vơ hoạt Nhiệt độ tối ưu thấp công bố nghiên cứu Abdelkafi S cộng sự, với nhiệt độ hoạt động tối ưu lipase thu từ mủ đu đủ 50°C [16] Giải thích kết thí nghiệm: SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 39 Có thể thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme có tác động trực tiếp đến cấu trúc khơng gian hình thể trung tâm hoạt động enzyme Tử 30÷45°C hoạt động enzyme tăng dần, điều giải thích dựa vào động lực học phản ứng enzyme Khi nhiệt độ tăng làm cho động enzyme chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều Các phức chất enzymecơ chất hình thành nhiều hơn, vận tốc phản ứng thủy phân tăng theo đạt cực đại tương ứng nhiệt độ tối ưu điểm khảo sát 45°C Từ 45÷60°C hoạt độ enzyme lipase giảm dần enzyme có chất protein nên tăng nhiệt độ đến giới hạn nhiệt độ tối ưu vận tốc phản ứng enzyme bị giảm Khi vùng nhiệt độ tối ưu (45°C), tác dụng nhiệt độ cao enzyme bị biến tính Trong q trình xử lý nhiệt độ cao, trước tiên số liên kết hydro mạng lưới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc lipase bị đứt gãy, dẫn đến cấu trúc lipase bị biến đổi, enzyme bị biến tính duỗi mạch để lộ nhóm chức kị nước đồng thời tăng cường lực tĩnh điện nhóm chức mạch bên, nhóm chức trái dấu hút ngược lại, nhóm chức dấu đẩy Nếu xử lý enzyme nhiệt độ cao phá vỡ liên kết hydro enzyme chất Kết lớp hydrate bao quanh enzyme bị phá vỡ, hình thể trung tâm hoạt động enzyme khơng cịn phù hợp với chất nên hoạt lực enzyme giảm dần 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme lipase pH có ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng enzyme, enzyme hoạt động mạnh dải pH khác Ở giá trị pH mà enzyme hoạt động mạnh gọi pH tối ưu pH môi trường phản ứng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất, độ bền cấu trúc protein enzyme có nguồn gốc protein nên pH thay đổi ảnh hưởng tới độ phân ly nhóm chức cấu tạo nên trung tâm hoạt động enzyme - OH, - SH Kết khảo sát ảnh hưởng pH cho hoạt động phân giải lipid enzyme lipase từ mủ đu đủ chất dầu cá hồi trình bày bảng 3.4 hình 3.5 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ pH Hoạt độ (UI/g enzyme) 6,5 7,5 8,5 9,5 10 194,4e 205,6d 227,8b,c 238,9b 261,1a 227,8b,c 211,1c,d 205,6d 183,3e SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 40 300 Hoạt độ UI/g a 250 b,c b b,c c,d d e 200 d e 150 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10 10,5 pH Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Ghi chú: Các giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) Nhận xét: Kết hình 3.2 cho thấy pH tăng dần từ đến hoạt độ lipase tăng dần, sau hoạt độ lipase giảm dần pH tăng từ đến 10 Trên hình 3.2, dễ dàng nhận thấy lipase từ mủ đu đủ hoạt động khoảng pH 8-9 với hoạt độ lớn đạt 127,78 UI/g giá trị pH=8 Giá trị pH thấp kết Abdelkafi S cộng nghiên cứu lipase từ mủ đu đủ, với pH tối ưu giá trị [16] Giải thích kết thí nghiệm: Khi pH thay đổi từ – 10 hoạt tính lipase tăng dần đạt cao pH=8 Điều giải thích dựa vào trạng thái ion hóa enzyme chất, pH tăng đồng thời trạng thái ion hóa enzyme chất thay đổi theo hướng hình thành phức hợp enzyme–cơ chất bền dẫn đến làm tăng vận tốc phản ứng Sau khoảng pH = – 9, hoạt lực enzyme giảm nhanh ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho tạo thành phức hợp enzyme–cơ chất trì cấu hình khơng gian enzyme nên tương tác với chất SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 41 3.3 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 3.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn xác định hoạt lực phương pháp đo quang Phương pháp đo quang để đánh giá phân đoạn protein thu có họa lực lipase hay không dựa vào phản ứng thủy phân chất béo không màu p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) thành chất có màu vàng p-nitrophenol (p-NP) hấp thụ bước sóng 410 nm Độ hấp thụ đo bước sóng 410nm tỉ lệ với hoạt lực enzyme lipase, đơn vị hoạt độ lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol pnitrophenol phút Kết xây dựng đường chuẩn thể mối quan hệ tuyến tính nồng độ pNP độ hấp thụ quang bước sóng 410nm theo quy trình trình bày mục 2.4.2.4 thể bảng 3.5 hình 3.6 Bảng 3.5 Kết đo quang để xác định đường chuẩn Lần đo Lần đo Lần đo Trung bình 0,009 0,136 0,138 0,140 0,138000 0,010 0,148 0,147 0,149 0,148000 0,012 0,177 0,175 0,169 0,173667 0,015 0,214 0,210 0,219 0,214333 0,021 0,307 0,302 0,291 0,300000 0,030 0,42 0,424 0,429 0,424333 0,060 0,835 0,831 0,825 0,830333 OD CM 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 y = 13,649x + 0,0122 R² = 0,9999 0,02 0,04 0,06 0,08 Nồng độ p-NP (mM) Hình 3.6 Đường chuẩn đo quang hợp chất p-NP SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 42 Nhận xét: Sau xây dựng đường chuẩn thể mối quan hệ nồng độ p-NP độ hấp thụ bước sóng 410 nm, ta thu phương trình tuyến tính y = 13,649x + 0,0122 với R2=0.999 Với R2 = 0.999 ≈ 1, có tương quan chặt chẽ nồng độ p-NP độ hấp thụ quang bước sóng 410 nm phương trình tuyến tính phù hợp để làm đường chuẩn xác định hoạt lực enzyme lipase 3.3.2 Kết xác định điểm đẳng điện Để tách phân đoạn protein cột sắc ký Q Sepharose Fast Flow cần có tương tác protein với cột sắc ký Vì cột trao đổi anion cần đưa pH môi trường lớn điểm đẳng điện protein (pI) Do mục đích nghiên cứu nhằm xác định điểm đẳng điện giúp cho việc lựa chọn pH cho pha động loại cột phù hợp dùng sắc ký trao đổi ion để tinh enzyme Kết đo quang 620 nm dung dich enzyme thu bảng bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết đo độ đục dung dịch enzyme lipase bước sóng 620 nm SVTH: Phạm Thị Xuân Hà pH OD 0,02700 3,5 0,0280 0,0290 4,5 0,0280 0,0280 5,5 0,0330 0,0642 6,5 0,1102 0,0360 7,5 0,0348 0,0331 8,5 0,0330 0,0321 9,5 0,0311 10 0,0310 GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 43 Nhận xét giải thích kết thí nghiệm: Khi pH= 3÷5,5 ta gần chưa quan sát độ đục dung dịch, có ống nghiệm chứa pH= 6,5 ta thấy dung dịch có đục, tăng pH dung dịch đệm lên độ đục giảm dần khó quan sát Khi đo quang ta nhận thấy ống chứa pH= 3,5; 4; 4,5; có kết gần tương đương Từ pH = 3÷6 độ đục tăng dần Từ pH = 7÷10 độ đục giảm dần Ống nghiệm chứa pH=6,5 đo quang OD lớn quan sát Từ bảng kết thu nhận thấy ống nghiệm chứa mơi trường có pH=6,5 dung dịch enzyme có độ đục cao nhất, điều chứng tỏ điểm đẳng điện lipase gần 6,5 Điều giải thích pH = 6,5 gần với pI protein nên có nhiều tủa nhất, cịn pH cịn lại xa dần pI nên lượng kết tủa giảm dần 3.3.3 Kết chạy sắc ký ion tinh enzyme lipase từ mủ đu đu Kết chạy trao đổi sắc ký ion sử dụng cột Q Sepharose Fast Flow với điều kiện tách phân đoạn sau: cột cân đệm Tris-HCl 0,01M, pH 9; tốc độ chảy 0.1ml/phút với gradien nồng độ 1M NaCl, ta thu peak hình 3.7 (mẫu thí nghiệm) hình 3.8 (mẫu lặp) Mẫu lipase tinh sau qua khỏi cột trao đổi ion thu lại, phân đoạn thu 0.5 ml/ống Sau tiến hành xác định hoạt lực lipase tinh phân đoạn thu phương pháp đo quang, kết đo quang để xác định hoạt lực lipase phân đoạn thể bảng 3.7 Hình 3.7 Hình ảnh thu enzyme lipase sau sắc ký trao đổi ion SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 44 Hình 3.8 Hình ảnh thu enzyme lipase sau sắc ký trao đổi ion (mẫu lặp) Bảng 3.7 Hoạt độ phân đoạn liase sau chạy sắc ký Phân đoạn OD Hoạt độ enzyme (UI/ml) 0,457 316,76 0,487 338,12 Mẫu thí nghiệm: phân đoạn Mẫu lặp: phân đoạn Nhận xét giải thích kết thí nghiệm: Kết chạy sắc ký ion tính enzyme lipase từ mủ đu đủ (hình 3.7 mẫu lặp hình 3.8) cho thấy dung dịch lipase sau chạy sắc ký ion thu peak, phút thứ Sau thu phân đoạn 2, mẫu lặp phân đoạn 3, xác định hoạt lực phương pháp đo quang ta thấy phân đoạn 2,3 có hoạt lực lipase Chứng tỏ enzyme lipase dung dịch tinh Điều cho thấy lipase sau sắc ký trao đổi ion làm phần SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 45 3.3.4 Kết kiểm tra phương pháp điện di Mẫu dung dịch lipase tinh kiểm tra lại phương pháp điện di SDS PAGE nhờ xác định trọng lượng phân tử, kích thước băng protein khác từ hỗn hợp protein xuất phát ban đầu Hình 3.9 Kết chạy điện di SDS-PAGE Các ký hiệu hình 3.9 là: + M : Khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, BioBase) + : Mẫu enzyme trước chạy sắc ký trao đổi ion + 2,3 : Mẫu enzyme tinh (mẫu thí nghiệm) chạy điện di song song Nhận xét giải thích kết thí nghiệm: Kết chạy điện di SDS – PAGE cho thấy băng protein dung dịch enzyme giai đoạn chạy sắc ký Quá trình chạy điện di khẳng định điều chúng tơi tiến hành chạy mẫu thí nghiệm mẫu lặp chứa băng protein hình 3.7 Theo hình ảnh thu hình 3.9 chúng tơi nhận thấy mẫu chứa băng protein enzyme, kích thước nằm khoảng 35-45 kDa Kết gần tương tự với công bố nghiên cứu R Dhouib, cộng sự, với kích thước enzyme thu 45kDa [27] SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 46 KẾT LUẬN Kết luận Qua trình tiến hành nghiên cứu thu số kết sau: ✓ Xác định hoạt lực chế phẩm enzyme lipase thu nhận từ mủ đu đủ cao phương pháp (sấy thăng hoa) với hoạt lực enzyme 544.41 UI/g enzyme khô, cao gấp 1,6 lần so với phương pháp (sấy thường) 2,6 lần so với phương pháp (phơi nắng) ✓ Lipase từ mủ đu đủ enzyme chịu kiềm, chịu nhiệt tốt ✓ Xác định hoạt độ enzyme lipase từ mủ đu đủ tối ưu chất dầu cá hồi nhiệt độ 45°C pH= với hoạt độ 260 UI/g enzyme ✓ Mức độ ưu tiên thủy phân enzyme lipase từ mủ đu đủ: acid béo đa bất bão hoà > acid béo đơn bất bão hoà > acid béo no (xét theo gốc acyl triglycerides) ✓ Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ phương pháp tủa với nồng độ muối (NH4)2SO4 60% kết hợp với sắc ký trao đổi ion điện di xác định kích thước phân tử kích thước nằm khoảng 35 – 45kDa Kiến nghị Qua q trình nghiên cứu cho phép tơi đề xuất số ý kiến việc nghiên cứu tiếp tục sau: ➢ Tiếp tục nghiên cứu tính đặc hiệu enzyme lipase từ mủ đu đủ ➢ Nghiên cứu ứng dụng lipase tinh chất khác để xem xét khả thủy phân lipase ➢ Xác định đặc tính lipase tinh sạch, Km Vmax lipase tinh ➢ Đưa trình tự acid amin phân tử lipase tinh SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước [1] Đặng Minh Nhật, Phan Thị Việt Hà, Trần Thị Bích Hà (2016), Nghiên cứu chiết tách khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ, Báo cáo nghiên cứu khoa học Khoa hóa Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng năm 2015 – 2016 [2] Dương Minh Lam – Vũ Thị Lý (2011), “Nghiên cứu tuyển chọn Balicillus sinh Lipase kiềm từ rừng ngập mặn”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50 [3] Đặng Thị Thu (2004), Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Bộ Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội [4] Trần Thế Tục – Đoàn Thế Lư (2004), Cây đu đủ Kỹ thuật trồng, Nhà xuất Lao Động Xã Hội [5] Thái Hà – Đặng Mai (2008), Kỹ thuật trồng chăm sóc đu đủ, Nhà xuất Hồng Đức [6] Hồ Đình Hải, Cây đu đủ, Rau Cây thân gỗ lớn, Rau Rừng Việt Nam [7] Trần Bích Lam – Lưu Duẩn (2013), “Tính chất động học đặc điểm thủy phân lipase tinh từ gan tụy cá tra (PANGASIUS)”, Tạp chí phát triển KHKT&CN, số 16 [8] Hồng Thị Bích (2017), Nghiên cứu sử dụng kết hợp Enzyme chiết tách làm giàu số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên, Luận án Tiến sĩ hóa học, Học Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam [9] Nguyễn Minh Chơn (2015), Giáo trình thực tập sinh hóa, Đại học Cần Thơ [10] Ngơ Tiến Hiển (2004), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme chế biến số nông sản thực phẩm, Bộ Khoa học Công nghệ viện Công nghệ thực phẩm Việt Nam [11] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp H Chí Minh [12] Nguyễn Ngọc Sương Mai (2014), Thu nhận khảo sát đặc tính số enzyme hydrolase ứng dụng dược phẩm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh [13] Đặng Minh Nhật, Phan Thị Việt Hà, Nguyễn Thị Quỳnh (2017), Nghiên cứu tinh Enzyme Lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính Lipase, Báo cáo SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 48 nghiên cứu khoa học Khoa Hóa Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng năm 2016 – 2017 [14] Quyền Đình Thi (2009), Phân lập số vi khuẩn nấm Việt Nam có khả sinh tổng hợp lipase mới, nghiên cứu tái tổ hợp ứng dụng chúng công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học, Hà Nội [15] Bùi Hồng Quân – Nguyễn Đức Lượng (2009), “Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Pichia Anomala Vtcc Y0787 sử dụng ma trận plackett-burman phương pháp đáp ứng bề mặt - phương án cấu trúc có tâm”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Tài liệu tham khảo nước [16] Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth (2011), Carica papaya lipase: A naturally immobilized enzyme with interesting biochemical properties, Plant foods hum nutri Vol 66, Page 67-70 [17] Teixeira da Silva (2007), Papaya (Carica papaya L.) Biology and Biotechnology, Tree and Forestry Science and Biotechnology, Global Science Books [18] Rubens Monti et al (2000), Purification of papain from fresh latex of Carica papaya, Brazilian archieves of biology and technology, Page 43-46 [19] Carla Tecelao, Ivanna Rivera, Georgina Sandoval and Suzana Ferreira-Dias (2012), Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production, J Lipid Sci Technol, Page 114-116 [20] Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S and Balasubramanian T (2011), Thermostable alkaline tolerant lipase from Bacillus licheniformis using peanut oil cake as a substrate, African Journal of Biochemistry Research [21] Fernanda Wiermann Paques (2008), Characterization of the lipase from Carica papaya residues, Braz J Food Technol, Page 20-27 [21] Christoph Brunschwiler (2013), Direct measurement of rice bran lipase activity for inactivation kinetics and storage stability prediction, Journal of Cereal Science, Page 272-277 [22] Curso de Postgrado (2002), Enzymeic Enhancement of ω3 Polyunsaturated Fatty Acids Content in Brazilian Sardine Oil, Acta Farm Bonaerense, Page 85-87 SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 49 [24] Georgina Sandoval (2012), Lipases and Phospholipases, Industrial Biotechnology Unit Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C (CIATEJ) Guadalajara, Jalisco, Mexico, Page 4-8 [25] José Murillo P Barbosa, Ranyere L Souza (2011), Biochemical characterisation of lipase from a new strain of Bacillus, Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Av Murilo Dantas, 300, 49032-490 Aracaju - SE, Brasil, Page 7-10 [25] Laemmli, U K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227(5259), Page 680-685 [27] Matheus H.M Avelar (2013), Hdrolysis of vgetable oils catalyzed by lipase extract powder from dormant castor bean seess, Industrial Crops and Products [28] Muhannad I Massadeh* and Fatima M Sabra (2011), Production and characterization of lipase from Bacillus stearothermophilus, African Journal of Biotechnology Vol 10, Page 139-146 [29] Nathalie Barouth, Slim Abdelkafi (2010), Neutral lipid characterization of Non – water – soluble fractions of Carica papaya latex, J Am Oil Chem Soc, Page 8788 [30] Poonsuk Prasertsan (2008), Comparison and Selection of protease and lipase sources from visceral organs of three tuna species, Songklanakarin J.Sci Technol, Page 73 – 76 [31] Pablo Domínguez de María, José V Sinisterra, Shau-Wei Tsai, Andrés R Alcántara (2006), Carica papaya lipase (CPL): An emerging and versatile biocatalyst, Biotechnology Advances, Page 493–499 [32] Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G (2012), Plant lipases: partial purification of Carica papaya lipase, Methods Mol Bio [33] Richard R Burgess ( 2009), Protein Precipitation Techniques, University of Wisconsin–Madison, Madison, Wisconsin, USA, Page 330-340 [34] R Dhouib1, J Laroche-Traineau2, R Shaha1, D Lapaillerie3, E Solier3 (2010), Identification of a putative triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics, SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 50 [35] Sonali Seth, Debamitra Chakravorty, Vikash Kumar Dubey, Sanjukta Patra (2013), An insight into plant lipase research – challenges encountered, Protein expression and purification Vol 95, page 2-3 [36] P Villeneuve, M Pina, A Skarbek (1997), Specificity of Carica papaya latex lipase – catalyzed interesterification reactions, Biotechnology Techniques, Vol11, No Tài liệu Web [37] http://www.congdanchuyennghiep.com/san-pham/du-du%CC%89-xanh- 1kg/ SVTH: Phạm Thị Xuân Hà GVHD: PGS TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 51 ... ? ?Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ? ?? với nội dung sau: - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ phương pháp khác - Xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ. .. Việt Hà 20 Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mủ đu đủ Mủ đu đủ thu từ số vườn đu đủ trồng... Phan Thị Việt Hà 19 Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính enzyme lipase từ mủ đu đủ Năm 2017, Nguyễn Thị Quỳnh nghiên cứu tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ xác định đặc tính Lipase chất dầu cá Basa