Bước đầu thành lập cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 18 STR marker

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA BÙI THỊ THU THẢO BƯỚC ĐẦU THÀNH LẬP CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 18 STR MARKER Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2013 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán chấm nhận xét 1: TS NGUYỄN HỮU PHÚC Cán chấm nhận xét 2: TS VÕ ĐÌNH LỆ TÂM Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 24 tháng 12 năm 2013 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG TS NGUYỄN HỮU PHÚC TS VÕ ĐÌNH LỆ TÂM TS LÊ THỊ THANH MAI Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: BÙI THỊ THU THẢO MSHV:12310751 Ngày, tháng, năm sinh: 26-08-1980 Nơi sinh: Bình Dương Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 604280 I TÊN ĐỀ TÀI: Bước Đầu Thành Lập Cơ Sở Dữ Liệu Tần Suất Các Alen Của 18 STR Marker II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 24-06-2013 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22-11-2013 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, giáo viên hướng dẫn khoa học – hỗ trợ giúp đỡ q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa TP.HCM truyền đạt kiến thức kinh nghiệm để hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Đốc Trung tâm Pháp Y TP.HCM, ThS Đặng Mai Anh Tuấn – trưởng phòng Sinh học phân tử, đồng nghiệp phòng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực đề tài Và cuối xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô Hội đồng Phản biện, Hội đồng Bảo vệ dành thời gian quý báu để xem qua nhận xét luận văn i MỤC LỤC TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc DNA 1.2 Dấu vân tay DNA 1.2.1 Tiểu vệ tinh (Minisatelites) 1.2.2 Vi vệ tinh (Microsatelites) 1.3 STR – PCR 1.3.1 Sơ lược thiết kế mồi cho phản ứng PCR 1.3.2 Enzyme Amplitaq Gold Polymerase 11 1.3.3 Mutiplex PCR STR – PCR 12 1.3.4 Những thuận lợi bất lợi ứng dụng kỹ thuật PCR giám định mẫu pháp y 13 1.4 Một số STR thường dùng 14 1.4.1 Những đặc tính mong muốn STR dùng pháp y 13 1.4.2 Những kit STR thương mại hóa 14 1.5 Các kỹ thuật sử dụng việc tạo hồ sơ DNA 15 1.5.1 Đặc điểm 18 locus STR khảo sát 15 1.5.2 Kỹ thuật multiplex PCR – STR 19 1.5.3 Kỹ thuật điện di mao quản tự động 20 1.5.4 Kỹ thuật phân tích hồ sơ DNA 20 1.5.5 Những tượng thường gặp đọc kết điện di mao quản 22 1.6 Tình hình nghiên cứu STR ngồi nước 25 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.2 Phương pháp vật liệu 29 2.2.1 Hóa chất thiết bị – dụng cụ 29 2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 29 2.2.3 Phương pháp ly trích DNA 30 2.2.4 Phương pháp khảo sát kiểu hình 31 2.2.5 Phương pháp điện di mao quản 32 2.2.6 Tính tần suất alen 18 locus STR 35 ii KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN 37 3.1 Kết ly trích mẫu 37 3.2 Kết khảo sát kiều hình 18 marker 37 3.3 Kết xác định tần suất alen 18 marker 38 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 56 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLPs Amplified Fragment Length Polymorphisms bp Base pair CE Capillary electrophoresis DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid MLPS Multi-Locus Probes PCR Polymerase Chain Reaction RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphisms POP Probability of Paternity STRs Short Tandem Repeats SLPs Single-Locus Probes SNP Single-nucleotide polymorphism VNTRs Variable Number Tandem Repeats CODIS Combined DNA Index System dNTP 2’ – deoxynucléoid 5’ – triphosphat Hobs Observed heterozygosity Hexp Expected heterozygosity OD Optical density PE Probability of exclusion PD Power of discrimination PIC Polymorphism information content pM Matching probability TPI Typical Paternity Index RFU Relative Fluorescence Units iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các mơ hình cấu trúc chuỗi xoắn kép Hình 1.2 Cấu trúc lõi lặp Hình 1.3 Mơ điện di gel Hình 1.4 Điện di gel vùng marker STR Hình 1.5 Các trường hợp primer dimer 11 Hình 1.6 Cấu trúc hairpin 11 Hình 1.7 Mồi gắn thêm đuôi hiệu chỉnh 15 Hình 1.8 Bảng 13 tiêu chuẩn CODIS 18 Hình 1.9 Các kiểu trình tự lặp STR 19 Hình 1.10 Kỹ thuật điện di mao quản tự động 20 Hình 1.11 Hình ảnh stutter vài alen 21 Hình 1.12 Cơ chế liên quan việc hình thành đỉnh phụ nhỏ 21 Hình 1.13 Mơ hình non-template addition 23 Hình 1.14 Hình điện di thơ cho thấy hai peak màu xanh dương gây nhiễu thành peak xanh tô xanh 23 Hình 1.15 Hiện tượng nhiễu Peak 24 Hình 1.16 Hiện tượng thiếu GenScan 24 Hình 1.17 Hiện tượng dư DNA đích 25 Hình 1.18 Hiện tượng thiếu DNA đích 26 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Hình 2.2 Sơ đồ tiến hành ly trích mẫu 31 Hình 2.3 Màu huỳnh quang locus 32 Hình 2.4 Sơ đồ hệ thống điện di mao quản 33 Hình 2.5 Sơ đồ phân tích kết điện di mao quản 34 Hình 3.1 Sự không đồng chiều cao peak 49 Hình 3.2 Peak có đỉnh chẻ 50 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Tóm tắt kiểu hình khảo sát 18 marker 38 Bảng 3.2 Tổng hợp alen có tần số cao thấp 18 locus 39 Bảng 3.3 Tần suất alen 18 locus khảo sát 40 Bảng 3.4 Các alen xuất lần với tần suất 0.003 43 Bảng 3.5 Hồ sơ DNA mẫu giám định huyết thống 47 Bảng 3.6 So sánh số PD PE nghiên cứu nước 48 vi TÓM LƯỢC Dưới áp lực phát triển xã hội mạnh mẽ, việc nhận dạng xác cá nhân cụ thể điều cần thiết Ngày ngành sinh học phân tử giúp việc giám định trở nên dễ dàng xác mức độ DNA – STR STR “dấu vân tay DNA” bất biến cá thể Trong phạm vi đề tài này, chúng tơi dùng PowerPlex®18D PCR kit để thiết lập liệu kiểu hình STR 18 loci: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1P0, Amelogenin, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338 Penta E, Penta D 200 người Việt Nam, từ tính tần suất alen để ứng dụng vào giám định quan hệ huyết thống, nhận dạng cá thể hay xác định thủ phạm Kết thu sau: lập hồ sơ 200 cá thể thành lập sở liệu tần suất alen 18 marker STR Trong đó, alen có tần suất cao alen thuộc marker TPOX đạt tần suất 0.568 thấp đạt 0.003 alen marker Penta D, alen marker D13S317, alen marker Penta E, alen 8.3 marker D7S820, alen marker D3S1358, D8S1179, D19S433 Penta E, alen 10.3 D7S820, alen 11 marker TH01, alen 11.1 marker D7S820 D19S433, alen 11.2 marker D19S433, alen 13 marker TPOX, alen 15 marker CSF1PO, D5S818, D13S317 D16S539, alen 16 marker FGA, alen 17.2 marker D19S433, alen 18 marker D8S1179, alen 18.2 marker D19S433, alen 22.2, 23.1, 25.2, 26.2, 29 marker FGA, alen 24.2 marker D2S1338, alen 28.2, 29.1, 29.2, 29.3, 30.3, 33, 34.2 marker D21S11, alen 30 31 marker D18S51 vii Trang 63 Trang 64 Phụ lục Hồ sơ DNA số mẫu khảo sát Trang 65 Trang 66 Trang 67 Trang 68 Trang 69 Phụ lục Biểu đồ tần suất alen 18 STR marker Tan suat 40% D3S1358 Tổng số alen xác định được: alen 34.0% 34.8% Alen có tần suất cao alen số 16 30% (34.8%) 19.8% 20% 10% Alen có tần suất thấp alen số 19 6.0% 5.3% 0.3% 0% 14 15 16 17 18 (0.3%) 19 Alen TH01 50.0% Tan suat 38.3% 34.0% 40.0% Tổng số alen xác định được: alen Alen có tần suất cao alen số 30.0% (38.3%) 20.0% 13.0% 10.0% 6.8% 2.8% 5.0% 0.3% 0.0% 9.3 10 11 Alen có tần suất thấp alen số 11 (0.3%) Alen D5S818 Tổng số alen xác định được: alen 40% Alen có tần suất cao alen số 11 Tan suat 29.3% 30% 20% 21.5% (29.3%) 21.3% 16.3% 6.3% 10% 4.3% 0.8%0.3% 0.3% 0% 10 11 12 13 14 15 Alen có tần suất thấp alen số 15 (0.3%) Alen Trang 70 D18S51 23.8% 25% 18.5% 20% Tan suat 15.3% 13.8% 15% 10% 6.8% 6.8% 5.8% 5% 2.8% 2.3% 1.8% 1.3% 0.5% 0.3% 0.3% 0.5% 0% 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 30 31 Alen Tổng số alen xác định được: 15 alen Alen có tần suất cao alen số 15 (23.8%) Alen có tần suất thấp alen số 30 (0.3%) 31 (0.3%) D21S11 30% 27.5% 27.8% Tan suat 25% 20% 16.0% 15% 10% 6.8% 5.0% 5% 0.5% 0.3% 0.3% 0.3% 0.3% 0.3% 2.0% 5.5% 4.3% 2.8% 0.3% 0.3% 0.3% 0% 26 28 28.2 28.3 29 29.1 29.2 29.3 30 30.2 30.3 31 31.2 32 32.2 33 33.2 34.2 Alen Tổng số alen xác định được: 18 alen Alen có tần suất cao alen số 30 (27.8%) Alen có tần suất thấp alen số 28.2, 28.3, 29.1, 29.2, 29.3, 30.3, 33, 34.2 (0.3%) Trang 71 D13S317 Tổng số alen xác định được: alen 40% Tan suat 30.3% 30% Alen có tần suất cao alen số 22.5% 18.3% (30.3%) 16.0% 9.5% 20% 10% 2.5% 0.5% 0.3% 0.3% 0% 10 11 12 13 14 15 Alen có tần suất thấp alen số 15 (0.3%) Alen D16S539 Tan suat 40% 31.3% Alen có tần suất cao alen số 11 25.5% 30% 18.3% 13.3% 20% 10% Tổng số alen xác định được: alen (31.3%) 8.5% 0.5% 2.0% 0.3% 0.5% 0% 10 11 11.3 12 13 14 15 Alen có tần suất thấp alen số 15 (0.3%) Alen vWA 30% 25.5% Alen có tần suất cao alen số 14 24.8% 25% Tan suat Tổng số alen xác định được: alen 21.3% 20% (25.5%) 14.3% 15% Alen có tần suất thấp alen số 15 10.5% 10% 2.0% 1.8% 5% 0% 14 15 16 17 18 19 20 Alen Trang 72 (1.8%) Tan suat D7S820 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 35.3% 21.3% 16.5% 15.8% 5.3% 1.0% 1.0% 0.3% 8.3 9.1 0.3% 10 10.3 2.8% 0.3% 11 11.1 12 13 0.5% 14 Alen Tổng số alen xác định được: 12 alen Alen có tần suất cao alen số 11 (35.3%) Alen có tần suất thấp alen số 8.3, 10.3 11.1 (0.3%) FGA 25% 20.0% Tan suat 20% 17.5% 14.0% 15% 10% 13.8% 8.3% 7.0% 6.0% 5.5% 5% 1.0% 0.3% 1.0% 1.8% 0.3% 0.3% 1.8% 0.3% 0.3% 1.0% 0.3% 0% 16 18 19 20 21 21.2 22 22.2 23 23.1 23.2 24 24.2 25 25.2 26 26.2 27 Alen Tổng số alen xác định được: 19 alen Alen có tần suất cao alen số 22 (20%) Alen có tần suất thấp alen số 16, 22.2, 23.1, 25.2, 26.2, 29 (0.3%) Trang 73 29 Tổng số alen xác định được: 10 alen D8S1179 18.3% 15.8% 15.3%15.5% 13.0% 11.5% 20% Alen có tần suất cao alen số 15 (18.3%) 8.3% 10% Alen có tần suất thấp alen số 5% 2.0% 0.3% 0.3% 18 (0.3%) 0% 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Alen TPOX Tổng số alen xác định được: alen Tan suat 80% 58.0% 60% Alen có tần suất cao alen số 30.0% 40% 20% 7.3% 0.3% 3.3% (58%) 1.0% 0.3% 12 13 0% 10 11 Alen có tần suất thấp alen số 13 (0.3%) Alen Penta D 40% Tổng số alen xác định được: 10 alen 32.8% Alen có tần suất cao alen số 30% Tan suat Tan suat 15% (32.8%) 20% 10% 14.8%14.8% 11.3% 11.0% 7.3% 4.5% 0.3% 2.0% Alen có tần suất thấp alen số 1.5% 0% 10 11 12 13 14 15 Alen Trang 74 (0.3%) 35% D19S433 29.5% 30% 24.0% Tan suat 25% 20% 14.3% 15% 10.5% 8.5% 10% 3.3% 5% 4.0% 3.3% 1.3% 0.5% 0.3% 0.3% 0.3% 0.3% 0% 11.2 12 12.2 13 13.2 14Alen14.2 15 15.2 16 16.2 17.2 18.2 Tổng số alen xác định được: 14 alen Alen có tần suất cao alen số 13 (29.5%) Alen có tần suất thấp alen số 9, 11.2, 17.2, 18.2 (0.3%) D2S1338 30% 24.3% Tan suat 25% 20% 17.0% 15% 7.5% 10% 5% 15.0% 14.0% 6.8% 6.8% 3.5% 3.0% 0.8% 0.5% 0.8% 0.3% 0% 16 17 18 19 20 21 22 Alen Tổng số alen xác định được: 13 alen Alen có tần suất cao alen số 19 (24.3%) Alen có tần suất thấp alen số 24.2 (0.3%) Trang 75 23 23.3 24 24.2 25 26 Tan suat CSF1PO 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Tổng số alen xác định được: alen 35.0% Alen có tần suất cao alen số 28.5% 12 (35%) 19.8% Alen có tần suất thấp alen số 10.5% 15 (0.3%) 4.3% 1.3% 0.3% 0.5% 10 11 12 13 14 15 Alen Penta E 30.0% 27.5% 25.0% Tan suat 20.0% 15.0% 15.0% 10.0% 5.0% 7.3% 6.3% 6.5% 6.3% 5.5% 4.5% 3.0% 5.8% 5.5% 3.3% 1.0% 1.5% 0.8% 0.3% 0.3% 0.0% 10 11 12 13 14 15 16 Alen Tổng số alen xác định được: 17 alen Alen có tần suất cao alen số 11 (27.5%) Alen có tần suất thấp alen số (0.3%) Trang 76 17 18 19 20 21 22 23 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: BÙI THỊ THU THẢO Ngày, tháng, năm sinh: 26-08-1980 Nơi sinh: Bình Dương Địa liên lạc: 624 Cộng Hòa, phường 13, quận Tân Bình, Tp.HCM Q TRÌNH ĐÀO TẠO Năm 2003-2008: sinh viên trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM, khoa Kỹ Thuật Mơi Trường Q TRÌNH CƠNG TÁC 2001-2006: cơng tác khoa xét nghiệm BV.Nguyễn Tri Phương Tp.HCM 2009-5/2010: công tác PKĐK Việt An 6/2010 đến nay: công tác Trung Tâm Pháp Y Tp.HCM Trang 77 ... sau: lập hồ sơ 200 cá thể thành lập sở liệu tần suất alen 18 marker STR Trong đó, alen có tần suất cao alen thuộc marker TPOX đạt tần suất 0.568 thấp đạt 0.003 alen marker Penta D, alen marker. .. thực có hệ thống sở liệu STR định Chúng thực đề tài ? ?Bước đầu thành lập sở liệu tần suất alen 18 STR marker? ?? nhằm bước đầu đáp ứng cho yêu cầu cần thiết tối thiểu Qua sở liệu STR thu mở rộng này,... 13 marker TPOX, alen 15 marker CSF1PO, D5S 818, D13S317 D16S539, alen 16 marker FGA, alen 17.2 marker D19S433, alen 18 marker D8S1179, alen 18. 2 marker D19S433, alen 22.2, 23.1, 25.2, 26.2, 29 marker