III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 24-06-
2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Trang 29
2.1. Đối tượng nghiên cứu
200 mẫu máu và niêm mạc má của 75 nam và 125 nữ được thu thập từ những người Việt Nam không có quan hệ huyết thống với nhau về mặt sinh học và có nguồn gốc từ các vùng khác nhau (mẫu được thu ngẫu nhiên). Mối quan hệ này được xác định trước tiên căn cứ vào mối quan hệ gia đình - xã hội của mỗi cá thể và sau đó điều này được xác nhận trở lại bằng phân tích và so sánh hồ sơ DNA thu được. Ngoài ra chúng tôi cũng căn cứ vào thông tin nguyên quán của các cá nhân để biết được phạm vi phân bố sinh học của họ nhằm đảm bảo tốt nhất mẫu có sự phân bố ngẫu nhiên.
Nghiên cứu thực hiện trong 5 tháng từ đầu tháng 6-2013 đến cuối tháng 10-2013 tại Trung Tâm Pháp Y TP.HCM.
2.2. Phương pháp và vật liệu
2.2.1. Hóa chất và thiết bị dụng cụ
Hóa chất: QIAamp DNA Mini kit, ethanol, Hi-Di™ Formamide, PowerPlex®18D PCR kit, nước cất khử ion,…
Thiết bị dụng cụ: tủ vô trùng, pipette eppendorf, 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tube, tips…Máy ủ nhiệt lắc Eppendorf Thermomixer comfort, máy vortex, máy ly tâm eppendorf, hệ thống luân nhiệt GeneAmp® PCR system 9700, hệ thống điện di mao quản Applied Biosystems 3500Gentic Analyzer, …
Trang 30
Hình 2.1. Sơđồ bố trí thí nghiệm
2.2.3. Phương pháp ly trích DNA
Nguyên tắc: bộ kit QIAgen sử dụng màng silica cùng với nồng độ muối cao ởđộ pH nhất định để hấp thu acid nucleic khỏi hỗn hợp thành phần khác của tế bào bị ly giải. Quá trình này cũng gồm một số bước cơ bản như những quy trình ly trích DNA dùng silica khác như: ly giải, gắn màng, rửa, thoi nhưng thực hiện bằng cách chuyển cột có gắn màng silica nên DNA đích thu được trong một tube sạch mới và hầu như không chứa chất ức chế trong dịch DNA ly trích được.
Tiến hành: 200 µl mẫu được ly giải trong dung dịch 20 µl protein K 100 µl Buffer AL, vortex và ủ trong vòng 10 phút ở nhiệt độ 560C. Sau đó, thêm 200 µl Ethanol và vortex hỗn hợp cho đều. Mẫu máu và niêm mạc má Thu nhận DNA Khảo sát kiểu hình Bảng tần suất alen Xác định tần suất
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp
Trang 31
Mẫu sau ly giải sẽ được chuyển hoàn toàn qua cột QIAamp Mini Spin Column. Ly tâm cột ở 8.000 vòng/ 1 phút để giữ lại các DNA trên màng và loại bỏ phần dịch lọc.
Tiến hành rửa cột lần thứ nhất với 500 µl buffer AW1, loại bỏ dịch rửa bằng cách ly tâm 8.000 vòng/ 1 phút. Rửa cột lần thứ 2 với 500 µl buffer AW2, loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng cách ly tâm 14.000 vòng/ 3 phút. Chuyển cột qua tube mới và quay khô với tốc độ tối đa trong 1 phút.
DNA được thoi khỏi màng bằng cách thêm 200 µl buffer AE hoặc nước cất, ủ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng (15-250C) và ly tâm ở 8.000 vòng/ 1 phút.
Hình 2.2. Sơđồ tiến hành ly trích mẫu
2.2.4. Phương pháp khảo sát kiểu hình
DNA sau khi ly trích được thực hiện thử nghiệm PCR và điện di mao quản nhằm xác định kiểu hình STR 18 locus của mẫu trên hệ thống thiết bị và hoá chất của hãng ABI đã được các phòng giám định cũng như bộ phận giám định gen quốc tế tin dùng. Các kiểu hình phát hiện được sẽđược lưu giữ trong tàng thư dữ liệu bằng các bản in và các tập tin gốc trên các đĩa CD để làm căn cước DNA cho cá nhân được khảo sát.
Tiến hành: DNA bộ gen được tiến hành khuếch đại các phân đoạn DNA thuộc 18 vùng marker mong muốn bằng dùng PowerPlex®18D PCR kit của Promega. Đây là kit chuyên biệt dùng cho giám định hồ sơ DNA được nhiều cơ quan giám định pháp y trên thế giới tín nhiệm.
Nguyên tắc: PowerPlex18D PCR Kit là bộ thuốc thửđa mồi với các trình tựđược thiết kếđặc hiệu dùng để khuếch đại 17 vùng lặp tetranucleotide và 1 vùng xác định giới tính Amelogenin chỉ gói gọn trong 1 phản ứng (Xem phụ lục 2). Kit có đủ 13 vùng cần thiết cho tiêu chuẩn CODIS (Combined DNA Index System) và thêm vào 4 vùng D2S1338, Penta E, Penta D, D19S433, giúp cho hồ sơ DNA của cá thể thu được phù
Trang 32
hợp với hầu hết các cơ sở dữ liệu danh tiếng được tin dùng trên thế giới. Điều này giúp cho việc xác định đối tượng trở nên dễ dàng hơn trên phạm vi đa quốc gia.
Bên cạnh đó kit PowerPlex18 dùng hệ thống 5 màu huỳnh quang để làm tăng khả năng phân tích đoạn một cách tự động. Trong đó, một số locus được đánh dấu huỳnh quang (màu xanh), Joe (màu xanh lá cây), TMR-ET (màu vàng) hoặc CXR-ET (màu đỏ)
và màu thứ 5 là CC5 (màu cam) được dùng cho việc đánh dấu các đoạn DNA thang chuẩn (CC5 ILS500). Do mỗi màu huỳnh quang phát ra tín hiệu huỳnh quang cực đại ở những bước sóng khác nhau nên trên hệ thống ABI 3500 trong quá trình thu thập dữ liệu, chúng được ghi nhận tách biệt nhau bằng thiết bị CCD (charge-coupled device). Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện đồng thời và định vị chính xác nhiều vùng STR hơn nữa mà chỉ cần chạy 1 phản ứng nhân bản DNA.
Hình 2.3. Màu huỳnh quang của các locus [44]
Tiến hành các chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR bao gồm: 96oC trong 2 phút (1 chu kỳ), 940C trong 10 giây (27 chu kỳ), 600C trong 1 phút (27 chu kỳ), 600C trong 20 phút (1 chu kỳ).
2.2.5. Phương pháp điện di mao quản
Nguyên tắc: thực hiện việc phân tích đoạn trên hệ thống điện di mao quản ABI 3500 để có thể thu được hồ sơ DNA tương ứng với các mẫu. Đây là hệ thống phân tích sử dụng cơ chế điện di mao quản. Cơ chế này cho phép tựđộng hóa hoàn toàn từ các thao tác hút mẫu, phân tách các đoạn DNA cũng như phát hiện chúng cho đến khả năng thao tác lặp liên tục trên rất nhiều mẫu tiếp theo mà chỉ cần 1 lần chuẩn bị và cài đặt ban đầu cho hệ thống.
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp
Trang 33
Hệ thống này cũng cho thấy ưu điểm nổi trội khác, đặc biệt là trong lĩnh vực pháp y có đối tượng mẫu hiếm, đó là khả năng chạy lặp lại nhiều lần một mẫu khi cần thiết mà không tiêu tốn thêm dịch mẫu gốc do hệ thống chỉ hút vào một lượng cực thấp mẫu cho 1 lần chạy. Kết quảđược xuất ra ngay trên máy tính điện tử nên không cần phải tốn thêm dụng cụ, hóa chất hay đòi hỏi thao tác cẩn thận như khi đọc gel thông thường. Tuy nhiên bất lợi lớn nhất của hệ thống này chính là chi phí ban đầu cao mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng dễ dàng đáp ứng được.
Hình 2.4. Sơđồ hệ thống điện di mao quản [4]
Các bộ phận cơ bản của máy điện di mao quản (CE) gồm mao quản mảnh, 2 lọ chứa dung dịch đệm và 2 điện cực gắn vào nguồn cao thế. Ngoài ra, hệ thống còn gồm nguồn sáng laser kích thích, bộ đọc huỳnh quang, khay mẫu tự động và một máy tính điện tử điều khiển việc hút mẫu và đọc tín hiệu (hình 2.4). Mao quản điện di làm bằng silica có đường kính tiêu chuẩn 50-100 µm và dài khoảng 36-50cm.
Tiến hành: dung dịch đệm dùng cho điện di mao quản cũng tương tự nhưđiện di gel thông thường; tuy nhiên thay vì dùng hệ gel thông thường làm thể nền phân tách, hệ thống CE dùng dung dịch polymer ở dạng sệt. Mỗi lần điện di mẫu là mỗi lần mao quản được thay dung dịch polymer mới và được hệ thống tiến hành tuần tự theo từng bước như sau: trước tiên, dung dịch polymer được đẩy vào trong lòng mao quản bằng lực tạo ra bởi ống tiêm. Sau đó điện thế phân tách được gia tăng đến 10000V và chạy trong 5
Trang 34
phút để kiểm tra bọt khí trong mao quản, đồng thời giúp cân bằng quá trình tách mẫu của hệ thống. Nếu có bọt khí trong mao quản, dòng điện sẽ quay về mức 0 do các ion không chảy được trong mao quản. Tiếp đó, mao quản được ngâm vào nước khử ion để loại bỏ muối trong dung dịch đệm có khả năng cản trở quá trình hút mẫu. Việc hút mẫu được thực hiện nhờ vào khay mẫu tựđộng dịch vào đúng vị trí và điện thế 15kV trong 5 giây được tạo ra để hút khoảng vài nanolít mẫu vào mao quản. Ngay lập tức mao quản được rửa lại bằng nước. Việc rửa nước lặp lại nhiều lần giúp loại bỏ tạp nhiễm bám bên ngoài mao quản. Tiếp đó, mao quản được ngâm trong nước sạch (vị trí 2) và quá trình điện di được khởi động. Khay mẫu dịch vào vị trí lọ chứa dung dịch đệm đầu (vị trí 1) và nguồn điện phân tách được thiết lập trong mao quản. Các phân tử DNA đã hút vào trước đó bắt đầu được phân tách trong dung dịch POP-4 polymer. Cuối cùng việc đọc tín hiệu được khởi động và kết quả được lưu ở dạng tập tin trên máy tính điện tử. Toàn bộ quá trình này kéo dài từ 30 đến 45 phút. Việc điện di mao quản tiêu tốn nhiều thời gian hơn điện di gel thông thường do điện thếđiện di sử dụng thấp hơn từ 10-100 lần.
Chúng tôi sử dụng phần mềm GeneMapper ® ID-X version 1.2 đi kèm hệ thống để phân tích chi tiết hồ sơ DNA của các mẫu nhằm tìm hiểu cụ thể các alen ID trong từng marker của 18 marker đặc trưng. Việc phân tích kết quả có thể tóm tắt như trong sơđồ sau:
Hình 2.5. Sơđồ phân tích kết quảđiện di mao quản
Phân tích dữ liệu thô để xác định hồ sơ DNA chính xác cho cá thểđó.
Sau khi có được hồ sơ DNA của từng cá thể, chúng tôi thực hiện tính tần suất các alen tương ứng theo công thức sau:
∑ (1) Ghi nhận dữ liệu Xác định Peak Phân biệt màu Định kích thước peak So sánh với Allelic Ladder Xác định Genotype
Chương 2. Vật liệu – Phương pháp
Trang 35
Trong đó: f(a): tần suất alen a; a: alen ID tương ứng với từng kiểu hình trong vùng gen khảo sát; n: số lượng cá thể khảo sát.
2.2.6. Tính tần suất các alen của 18 locus STR
Các kết luận thiếu độ chính xác trong các xét nghiệm quan hệ huyết thống hoàn toàn phụ thuộc vào dữ liệu tần suất các alen trong vùng gen STR khảo sát. Vì vậy, chúng tôi thực hiện lấy dữ liệu từ những người không có quan hệ huyết thống về mặt sinh học để xây dựng bảng tần suất alen có độ chính xác và tin cậy cao.
Số liệu thu thập được sẽ sử dụng phần mềm PowerstatsV12 của Promega để tính các chỉ số thống kê như xác suất nhận dạng cá thể người (Power of Discrimination), xác suất loại trừ PE (Power of Exclusion), chỉ số huyết thống PI (Paternity Index), xác suất trùng lắp (Matching Probability), tần số dị hợp tử (Heterozygosity), tần số đồng hợp tử (Homozygosity).
Các thông số thống kê:
-Thể dị hợp tử (heterozygotes) là cá thể có hai alen ở cùng một locus.
-Thể đồng hợp tử (homozygotes) là cá thể có hai alen giống nhau ở cùng một locus. -Tần số dị hợp tử (Heterozygosity) được kí hiệu là h trong công thức (2) [4]
(2)
Trong đó:
• n: tổng số cá thể được khảo sát trong nghiên cứu • nh:số lượng cá thể khảo sát có hai alen
Tần số đồng hợp tử có hai alen (Homozygosity) được ký hiệu là H trong công thức (3) Tần số dị hợp tử (h) cộng tần số đồng hợp tử (H) bằng 1 [4].
h + H = 1 (3)
Trang 36
Xác suất trùng lắp là xác suất một người có cùng dấu vân tay DNA với một người khác được chọn ngẫu nhiên trong quần thể, được tính theo công thức (4):
(4)
Trong đó i và j là tần số của các alen từ a đến n, Pij là tần số của các kiểu hình. Xác suất trùng lắp tổng của các locus bằng tích xác suất trùng lắp của từng locus [4].
Khả năng nhận dạng cá thể người (Power of Discrimination - PD)
Khả năng nhận dạng cá thể người trên một locus được tính bằng công cách lấy 1 trừ pM. Khả năng nhận dạng cá thể người trên tổng các locus được tính bằng phương trình (5) [4]:
(5)
Khả năng loại trừ (Power of Exclusion - PE)
Khả năng loại trừ được định nghĩa tần số của các cá thể có dấu vân tay DNA khác với cá thể được chọn lọc ngẫu nhiên trong quần thể trong xét nghiệm quan hệ huyết thống. PE được tính bằng công thức (6) [4]:
PE = h2 (1-2hH2) (6) Khả năng loại trừ của tất cả các locus (7):
(7)
Chỉ số huyết thống (Paternity Index - PI) [4]:
Phản ánh số lần giống nhau mà một người được kiểm tra là người cha sinh học hơn một người được chọn ngẫu nhiên trong quần thể. Chỉ số huyết thống được tính bằng công thức (8):
(8)
Chương 3. Kết quả – Biện luận
Trang 37
3.1. Kết quả ly trích mẫu
Kết quả ly trích cho thấy trong tổng số 200 trường hợp thực hiện ly trích DNA không có trường hợp nào gây ức chế phản ứng PCR tiếp theo sau cũng như không có trường hợp nào không ly trích được DNA. Hàm lượng DNA ly trích được từ 200µl mẫu ban đầu được định lượng tương đối bằng phương pháp đo mật độ quang OD 260/280. Chúng phân bố trong khoảng 40-110 ng/µl. Hiện tượng lệch này là do các nguyên nhân khách quan như sau: (i) Phương pháp đo hàm lượng DNA bằng bước sóng 260 và 280 nm chỉ là phương pháp định lượng tương đối. (ii) Hàm lượng tế bào máu mà cụ thể là tế bào bạch cầu trong các mẫu là không giống nhau. (iii) Trong máu toàn phần của người cho mẫu có thể có các DNA ngoại lai khác chẳng hạn HBV, HCV,…
Tuy nhiên, chúng tôi giảđịnh hàm lượng DNA đo được của dịch ly trích là hàm lượng DNA người để từđó thực hiện pha loãng và chạy phản ứng multiplex PCR tiếp theo. Bởi lẽđiều giảđịnh của chúng tôi đóng vai trò tương đối quan trọng trong xây dựng quy trình chuẩn phân tích hồ sơ DNA. Chúng tôi giả định như vậy vì: (i) theo lý thuyết chỉ cần 1 phân tử DNA đích hiện diện trong mix PCR là đủ để thu được lượng rất lớn bản sao của nó sau 27 chu kỳ. (ii) theo thực nghiệm chỉ cần đưa vào phản ứng PCR 0.5-1.25 ng/phản ứng là đủ. Do đó giảđịnh này cần được tiếp tục khẳng định bằng kết quả thực nghiệm.
Thực tế minh chứng điều giả định này hợp lí bởi tất cả 200 mẫu đều thu được hồ sơ DNA. Điều này cho thấy QIAamp DNA Mini kit là kit phù hợp cho quá trình ly trích DNA người của quy trình phân tích hồ sơ DNA từ mẫu máu toàn phần và mẫu phết niêm mạc má với ưu điểm là cho sản phẩm có độ tinh sạch cao, ổn định và thời gian thực hiện ly trích tương đối ngắn (khoảng 30 phút).
3.2. Kết quả khảo sát kiểu hình của 18 marker
Căn cứ vào chiều cao của các peak, chúng tôi thấy rằng để kết luận một marker là dị hợp thì tỷ lệ giữa hai peak là lớn hơn 0.6. Trong trường hợp đồng hợp, chỉ có một peak duy nhất và chiều cao peak lớn hơn 500 RFU (đơn vị huỳnh quang). Kết quả khảo sát kiểu hình của 18 locus được thể hiện qua bảng 3.1 (phụ lục 4, 5 và 6)
Trang 38
Bảng 3.1. Tóm tắt kiểu hình khảo sát trên 18 marker
Trong 200 cá thể khảo sát, trong đó có 75 nam và 125 nữ, chúng tôi nhận thấy rằng số cá thể dị hợp tử trong các locus gấp 3 – 5 lần số cá thể đồng hợp tử, số cá thể dị hợp tử cao điều này cho thấy rằng có sự đa dạng về alen hơn và do đó nó sẽ có ít cơ hội cho một sự kết hợp ngẫu nhiên [10], số cá thể đồng hợp tử là không quá cao trong các locus khảo sát. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận rằng quần thể ở trạng thái cân bằng Hardy - Weiberg đối với 17 locus STR đang khảo sát. Điều này là hợp lí vì tất cả các đối tượng được lấy mẫu đều đến từ các vùng miền khác nhau trên nước Việt Nam.
3.3. Kết quả xác định tần suất alen của 18 marker
Từ kết quả thống kê của 18 locus STR, chúng tôi tiến hành xây dựng cơ sở dữ liệu về tần suất alen của 18 STR marker ở cộng đồng người Việt Nam bằng công thức (1) đã