Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen hệ identifiler từ quần thể người hoa ở các tỉnh phía nam

MỞ ĐẦU Trong khoa học hình sự, giám định gen (ADN) mở phương pháp truy nguyên cá biệt xác hiệu quả, giúp nhà điều tra tìm thủ phạm vụ án thơng qua việc phân tích dấu vết, mẫu vật Giám định gen ứng dụng kỹ thuật, công nghệ đại sinh học phân tử nhằm phân tích đặc điểm dấu vết mẫu vật hay cá thể người dựa tảng giám định sinh học Để bảo đảm tính khoa học tính pháp lý, phòng giám định ADN phải tuân thủ nghiêm ngặt quy định Hiệp hội ADN hình quốc tế trang bị phương tiện, thiết bị, người, hóa chất…, đặc biệt trình độ cơng nghệ [9] Một phịng giám định ADN đạt chuẩn phải có điều kiện mang tính bắt buộc khảo sát xây dựng sở liệu tần suất alen gen ứng dụng phù hợp với quần thể người [10] Việt Nam có 54 dân tộc, dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn (gần 90%) [1] có đề tài khoa học cấp Bộ khảo sát tần suất alen 15 gen người Việt (Kinh), người dân tộc H'mông, dân tộc Khmer theo hệ Identifiler [9,12] Còn lại dân tộc khác chưa tiến hành khảo sát tần suất alen xây dựng sở liệu ứng dụng vào công tác giám định Đề tài nghiên cứu: “Khảo sát xây dựng sở liệu tần suất alen 15 gen hệ Identifiler từ quần thể người Hoa tỉnh phía Nam”, yêu cầu cần thiết thực tế giám định Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Xây dựng sở liệu tần suất alen 15 gen (ADN) hệ Identifiler quần thể người Hoa tỉnh phía Nam - Đánh giá tính đa hình 15 gen (ADN) hệ Identifiler quần thể người Hoa, phát alen hiếm, alen đặc trưng đề xuất khả ứng dụng công tác giám định ADN vụ việc liên quan đến người Hoa Việt Nam Giả thuyết nghiên cứu - Quần thể người Hoa có alen đặc trưng 15 gen hệ Identifiler, mang giá trị truy nguyên cao - Có khác tần suất alen 15 gen hệ Identifiler quần thể người khác khác có ý nghĩa sở liệu tần suất kết luận giám định Những điểm ý nghĩa thực tiễn đề tài - Xây dựng bảng tần suất alen 15 gen hệ Identifiler quần thể người Hoa tỉnh phía Nam, sở pháp lý để xác định độ tin cậy tính xác kết luận giám định ADN liên quan tới người Hoa lực lượng kỹ thuật hình nước - Đưa số liệu so sánh tần suất alen quần thể người Hoa với quần thể người Việt (Kinh), Thái Lan Malaixia Đánh giá khác biệt số loại alen, tần suất alen quần thể Bổ sung vào sở liệu tần suất chung quần thể người Việt nam giới Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học đời giám định gen Bản chất di truyền nằm cấu trúc nhiễm sắc thể.Nhiễm sắc thể nằm nhân tế bào.Nhiễm sắc thể cấu trúc từ phân tử ADN kết hợp với protein kiềm (histon) Phân tử ADN chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mạch đơn chuỗi nucleotide Hướng hai mạch đơn chuỗi xoắn kép ngược hai mạch đối song song [28] Những đặc điểm quan trọng mơ hình cấu trúc ADN tính đặc thù việc kết cặp base phân cực ngược chiều hai sợi đơn 5'  3', 3'  5') chúng có tầm quan trọng đặc biệt với nhiều hoạt động chức ADN tự chép, phiên mã dịch mã Hình 1.1: Cấu tạo ADN nhân tế bào NST Nhân tế bào Phân tử ADN sợi đơi Vùng đích PCR Các nucleotit Có nhiều phương pháp sử dụng để xác định cá thể người: nhận biết qua vân tay, tiếng nói, nhận biết yếu tố di truyền [13]…nhưng khả phân biệt thấp Phải đến thập kỷ 80, 90 nhà khoa học hình ứng dụng công nghệ gen (DNA-Technology) vào việc xác định tội phạm Năm 1984, Alec Jeffreys cộng trường đại học Leicester (Anh) nghiên cứu đoạn ADN mã hoá cho myoglobin máu người phát trình tự base nitơ lặp lại số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10-15 bp (base pair), đoạn lặp gọi tiểu vệ tinh [28] Các tiểu vệ tinh phát thấy tế bào vị trí khác hệ gen người Điều đáng ý số lần lặp lại đoạn lặp cá thể khác khác Đây đặc điểm quan trọng để phân biệt khác cá thể (truy nguyên cá thể) Giám định gen cho mục đích tư pháp đời từ Giám định gen truy nguyên cá thể người, xác định quan hệ huyết thống, xác định hài cốt [14] Tháng 10 năm 1990, Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) thức bắt đầu Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP Celera cơng bố trình tự đầy đủ hệ gen người Theo đó, gen người có khoảng 35.000 gen, có hàng chục gen nghiên cứu ứng dụng để xác định huyết thống truy nguyên cá thể [18] 1.2 Di truyền quần thể “Quần thể tập hợp cá thể lồi, sống khoảng khơng gian xác định, vào thời điểm định, có khả sinh sản tạo thành hệ hữu thụ” [42] 1.2.1 Định luật Hardy - Weinberg [42] Năm 1908, Geoffrey Hardy (Anh) Wilhelm Weinberg (Đức) đồng thời nghiên cứu định luật Hardy-Weinberg, nội dung sau: “Trong quần thể có số lượng lớn, giao phối tự ngẫu nhiên vào cân bằng, khơng có chọn lọc khơng có đột biến, tần số tương đối alen gen có khuynh hướng trì khơng đổi từ hệ sang hệ khác” [12, 47] Định luật Hardy-Weinberg gồm tính chất quan trọng: (1) Gọi p tần số alen A, q tần số alen a alen kết hợp với cách ngẫu nhiên quần thể tần số kiểu gen AA, Aa, aa thể qua đẳng thức:p2 + 2pq + q2 = (2) Tần số kiểu gen không đổi qua hệ miễn tần số alen không đổi, gọi trạng thái cân quần thể Nếu gen có tới alen (p, q r) phân bố tần số alen tuân theo công thức: (p + q + r)2 = Với n alen (p1, p2 ,p3 pn) cơng thức là:(p1 + p2 + p3 + pn)2 = Kiểu kết hôn Bố Mẹ Con Tần số 2 AA AA p xp =p AA Aa p x 2pq = 2p q Aa AA 2pq xp = 2p q AA aa p xq =pq aa AA q xp =pq Aa Aa 2pq x 2pq = 4p q Aa aa 2pq x q = 2pq aa Aa q x 2pq = 2pq aa aa q xq =q 1(p ) 2 2 3 1/2(2p q) 1/2(2p q) 2 2 1/2(2p q) 1(p q ) 2 1(p q ) 2 1/2(2p q) 2 aa AA Aa 2 1/4(4p q ) 2 1/2(4p q ) 1/2(2pq ) 3 1/2(2pq ) 2 1/4(4p q ) 1/2(2pq ) 1/2(2pq ) 1(q ) Tổng p 2pq q Bảng 1.1: Tần số kiểu kết hôn tần số kiểu gen hệ sau theo định luật HardyWeinberg 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trạng thái cân định luật Hardy - Weiberg Các yếu tố làm thay đổi ngẫu nhiên tần số alen quần thểlà: Tình trạng kết đồng huyết gây đột biến gen; Sự di dân; Sự phiêu bạt di truyền dòng chảy gen (phát tán chậm chạp gen) 1.3 Giám định ADN 1.3.1 Các gen sử dụng giám định - Các gen lựa chọn sử dụng giám định STR có chiều dài 400 base để dễ dàng phân tích Các đoạn STR có đặc tính: đa hình mức độ dị hợp tử cao (>70%); Dễ dàng phối hợp thành phức thực PCR; Sản phẩm PCR ổn định 1.3.2 Vai trò sở liệu tần suất alen Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng trừ trường hợp sinh trứng [8] Mỗi quần thể người (tộc người) khác có đặc điểm di truyền đặc trưng thể phân bố tần suất alen quần thể [47] Do vậy, giám định ADN nhà khoa học hình ngồi lựa chọn, nghiên cứu locus (vị trí nhiễm sắc thể) có tính đa alen (đa hình) cao cần khảo sát tần suất phân bố alen quần thể locus gen để sử dụng Quần thể nghiên cứu khảo sát phải đạt yêu cầu thống kê, di truyền như: mẫu đảm bảo tính ngẫu nhiên, khơng có quan hệ huyết thống [8, 9] Để có tần suất alen, phải tìm số lần xuất alen quần thể nghiên cứu sau tính tần suất lý thuyết alen theo luật di truyền quần thể [27] Kiểm định xem tần suất alen có chấp nhận với mức xác suất chọn Giám định gen (ADN) đòi hỏi sở khoa học vững để tính tốn xác suất người ngẫu nhiên quần thể người có cấu trúc di truyền đặc trưng trùng lặp với ADN mẫu vật (thu thập trình điều tra, phá án) Nếu khơng có tần suất alen khơng tính tốn tần suất xuất kiểu gen quần thể định [8, 10, 47] Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận người có phải cha đẻ mẹ đẻ người không, phải dựa vào khả cho nhận alen phải vào tần suất alen để tính số quan hệ huyết thống (Paternity Index - PI), từ tính độ tin cậy đạt Mặt khác, sở khoa học để so sánh độ tin cậy trường hợp phân tích nhiều gen gen 1.4 Tình hình nghiên cứu nước khảo sát tần suất alen sử dụng giám định ADN 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới Từ năm 1990, nhà Khoa học hình giới sử dụng kỹ thuật phân tích gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) cho mục đích giám định ADN [34] Các tập đồn nghiên cứu khoa học giới sản xuất KIT phân tích tổ hợp locus có trình tự lặp lại ngắn: KIT locus (hệ Profiler Plus hãng Perkin-Elmer, Mỹ), KIT 15 locus (hệ Identifiler hãng AB, hệ Power Plex 16 hãng Promega) [14] Mỗi phịng thí nghiệm giám định gen (ADN) phải đạt tiêu chất lượng trang thiết bị máy móc người phải có nghiên cứu, khảo sát cơng bố kết tần suất alen hệ locus gen quần thể người để ứng dụng giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ khảo sát sử dụng tần suất liệu ADN theo hệ Identifiler nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng 357 người Mỹ gốc Phi [20, 21].Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), quốc gia khác lại có khảo sát khác tần suất alen theo hệ Identifiler cộng đồng người Eurasia quốc gia đó: 384 người Nga, 300 người Hy Lạp, 139 người Rumani [47, 52] Năm 2006, 2008 Thái lan, Malaixia công bố kết khảo sát 15 gen người Malaixia [44, 46] Nhật Bản công bố kết khảo sát 15 gen hệ Identifiler người Nhật năm 2013 [43] Từ năm 2012 đến 2015, Trung Quốc công bố bảng tần suất alen gen STR dân tộc phía nam Trung Quốc [22], tần suất alen 15 gentừ cá thể người dân tộc Hán vùng miền Trung Quốc [45, 50], tần suất, alen 15 gen từ cá thể người phía Bắc Trung Quốc [25, 34, 35] Năm 2016, Indonesia công bố tần suất alen 15 gen hệ Identifiler khảo sát từ dân tộc Indonesia [53] Năm 2016, Malaixia công bố thông tin alen 15 gen hệ Identifiler khảo sát từ 341 cá thể người Malaixia [54] Kit Identifiler Kit phức hợp nhân đồng thời 16 gen STR, gen qui định giới tính, 15 gen qui định tính trạng nằm NST thường Các khảo sát tần suất alen tiến hành nghiên cứu 15 gen Tên locus Vị trí NST Trình tự đoạn lặp D8S1179 8q24.13 phức hợp TCTA/TCTG - 20 D21S11 21q21.1 phức hợp TCTA/TCTG 12 - 43.2 D7S820 7q21.11 GATA - 16 CSF1PO 5q33.3-34 AGAT - 17 D3S1358 3p21.31 phức hợp TCTA/TCTG - 26 TH01 11p15.5 TCAT - 14 D13S317 13q22-31 TATC - 17 D16S539 16q24.1 GATA - 17 D2S1338 2q35 phức hợp TGCC/TTCC 10 - 31 D19S433 19q12 phức hợp AAGG/TAGG 5.2 - 20 vWA 12p12-pter phức hợp TCTA/TCTG 10 - 25 TPOX 2p23-2per AATG - 16 D18S51 18q21.3 AGAA 5.3 - 40 Amelogenin X: p22.1-22.3 Các alen X, Y Y: p11.2 D5S818 5q21-31 AGAT - 29 FGA 4q28 phức hợp CTTT/TTCC 12.2 - 51.2 Bảng 1.2 Các locus gen hệ Identifiler [37] Đặc điểm số locus gen STR hệ Identifiler: Gen D8S1179 (D8) định vị nhiễm sắc thể (NST) số 8; Gen D21S11 (D21) định vị NST số 21; Gen D7S820 (D7) định vị NST số 7; Gen CSF1PO (CSF) định vị NST số 5; Gen D3S1358 (D3) định vị NST số 3; Gen HUMTH01 (THO1) định vị NST số 11; Gen D13S317 (D13) định vị NST số 13; Gen D16S539 (D16) định vị NST số 16; Gen D2S1338 (D2) định vị NST số 2; Gen D19S433 (D19) định vị NST số 19; Gen vWA định vị NST số 12; Gen TPOX NST số 2; Gen D18S51 (D18) NST số 18; Gen D5S818(D5) định vị NST số 5; Gen FGA: Định vị NST số Hình 1.2: Sơ đồ gen hệ Identifiler 1.5 Tình hình nghiên cứu nước Ở Việt Nam, giám định gen triển khai từ tháng năm 1999, Viện Khoa học hình - Bộ Cơng an Tồn máy móc trang thiết bị người đào tạo trang bị theo chương trình chuyển giao cơng nghệ Cộng hịa liên bang Úc Từ năm 2002 đến 2016, có nghiên cứu, khảo sát xây dựng tần suất alen gen hệ NinePlex II (9 gen), hệ Identifiler (ID) quần thể người dân tộc Kinh, dân tộc H’mông, dân tộc Khmer nghiệm thu ứng dụng kết luận giám định, giúp quan tố tụng giải có hiệu nhiều vụ việc [8, 9] Việt Nam thông báo bảng tần suất alen locus gen hệ Nineplex II đối tượng người Kinh cho Interpol Các nghiên cứu khoa học để xây dựng sở pháp lý vững kết luận giám định truy nguyên cá thể xác định huyết thống phục vụ tố tụng hình dân vụ án, vụ việc có liên quan đến quần thể người Việt Nam [9,14] Hình 1.3: Bộ KIT Identifiler thương mại hãng Applied Biosystems sử dụng phân tích ADN Việt Nam 1.6 Tình hình nghiên cứu alen hệ Identifiler người Hoa Việt nam sở khoa học để xác định số mẫu khảo sát Theo Tổng điều tra dân số nhà năm 2009, người Hoa Việt Nam có dân số 823.071 người, cư trú tập trung : Thành phố Hồ Chí Minh rải rác tỉnh: Đồng Nai (95.162 người), Bình Dương (18.783 người), Sóc Trăng (64.910 người), Kiên Giang (29.850 người), An Giang (14.318 người), Bạc Liêu (20.082 người) , Tây Ninh (4.542 người) số tỉnh khác [1, 17]…Hàng năm số lượng vụ việc liên quan đến người Hoa trưng cầu giám định ADN Phân viện KHHS có chiều hướng gia tăng Cụ thể năm 2013 có 47 vụ, năm 2014 có 56 vụ, năm 2015 có 69 vụ năm 2016 có 73 vụ Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu khảo sát phân bố alen 15 locus gen hệ Identifiler quần thể người Hoa 1.6.1 Cơ sở xác định số lượng mẫu nghiên cứu Theo Hội đồng nghiên cứu quốc gia Hoa Kỳ năm 1996 [21, 38] khuyến cáo alen nên tính năm lần để tần suất tính đáng tin cậy Do tần số thấp alen 5/2N, N số lượng mẫu khảo sát từ quần thể 2N số lượng NST Với quy ước thế, số lượng mẫu khảo sát ảnh hưởng tới tần suất alen tối thiểu sau: Số lượng mẫu khảo sát (N) 100 Số lượng nhiễm sắc thể (2N) 200 Tần suất tối thiểu alen (5/2N) 0.025 200 400 0.0125 500 1000 0.005 1000 2000 0.0025 10000 20000 0.00025 Bảng 1.3: Tần suất tối thiểu alen ứng với số lượng mẫu khảo sát Theo John M Butler [20],số lượng mẫu lớn xác suất lý thuyết thực tế tiệm cận tới với độ tin cậy cao Theo tác giả Chakraborty vàonăm 1992 [21], số lượng mẫu khảo sát thông thường 100-150 mẫu ADN từ cá thể khơng có quan hệ huyết thống đủ cho locus STR có từ đến 15 alen Theo tác giả John Buckleton (2005), chọn 200 mẫu khảo sát cho quần thể số lượng tiêu chuẩn xác lựa chọn phổ biến [32] Với sở trên, để kết nghiên cứu đảm bảo tính khoa học, bảng tần suất alen Interpol Hiệp hội ADN hình Châu Á áp dụng việc giám định ADN chúng tơi chọn số lượng mẫu khảo sát quần thể người Hoa tỉnh phía Nam 200 người Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp điều tra khảo sát thực tế: Tiến hành thu mẫu cá thể người Hoa khơng có quan hệ huyết thống với nhau, đảm bảo đại diện ngẫu nhiên, tuân theo điều kiện định luật Hardy - Weinberg Kết hợp sở Tư Pháp, quyền địa phương để xác minh nhân thân, kiểm tra giấy tờ tùy thân (căn cước, chứng minh thư nhân dân, hộ chiếu, giấy khai sinh) hỏi trực tiếp người thu mẫu - Phương pháp thực nghiệm khoa học: Phân tích kiểu gen 200 cá thể theo Quy trình giám định ADN(TCVN - AN 2013) ban hành kèm theo Thông tư số 46/2013/TT-BCA ngày 05/11/2013 Bộ trưởng Bộ Công an - Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất alen hệ Identifiler người Hoa - Phương pháp so sánh: tiến hành so sánh tần suất alen người Hoa với số quần thể người khác để đánh giá alen hiếm, alen đặc trưng, tính đa hình khả ứng dụng thực tế giám định - Phương pháp xin ý kiến chuyên gia: chuyên gia đầu ngành ý kiến quý báu liên quan đến lý luận thực tiễn giám định 2.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Tiến hành thu 200 mẫu máu 200 cá thể người Hoa thành phố Hồ Chí Minh tỉnh phía Nam chia thành đợt: + Đợt 1: Thu 100 mẫu máu từ ngày từ ngày 29 tháng 12 năm 2015 đến ngày 28 tháng 02 năm 2016 + Đợt 2: Thu 100 mẫu máu từ ngày từ ngày 01 tháng năm 2016 đến ngày 15 tháng năm 2016 - Phân tích mẫu bao gồm bước tách chiết ADN, định lượng ADN, nhân bội ADN, điện di máy điện di mao quản, kết lập bảng 200 kiểu gen mẫu nghiên cứu - Xử lý số liệu thống kê, kiểm định tần suất kiểu gen kết thực tế tính tốn lý thuyết với độ tin cậy p = 0,05 Tính tốn đưa bảng tần suất alen locus gen hệ Identifiler cho 200 cá thể người Hoa 2.3 Nội dung nghiên cứu: 2.3.1 Thu mẫu Thu mẫu máu mang tính ngẫu nhiên, khơng có quan hệ huyết thống, phiếu thơng tin mẫu thiết kế hình 2.1 Hình 2.1: Phiếu thu mẫu (danh ADN) DANH BẢN ADN Số thứ tự: Ký hiệu: Ngày thu mẫu: Họ tên: Nam/Nữ: Tên gọi khác: Sinh ngày: Quê quán: HKTT: Quốc tịch: Dân tộc: Ghi chú: - Phạm vi thu mẫu thành phố Hồ Chí Minh tỉnh phía Nam gồm: Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng Bạc Liêu, nơi có nhiều người Hoa sinh sống - Kết hợp sở Tư pháp, quyền địa phương để xác định nhân thân, kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh ) - Hỏi trực tiếp người thu mẫu - Dùng kim chích đầu ngón tay thấm trực tiếp vào giấy FTA - Đảm bảo chất lượng mẫu khơng bị lẫn, nhiễm, khơ tự nhiên, đóng gói riêng rẽ, ghi ký hiệu cho mẫu Hình 2.2: Thẻ FTA chuyên dụng để thu mẫu máu Kết thu thập đủ 200 mẫu cá thể người Hoa đạt tiêu chuẩn nghiên cứu (Phụ lục 01) 2.3.2 Phân tích mẫu Tiến hành phân tích theo Quy trình giám định ADN chuẩn hoá tài liệu TCVN - AN 2013: Qui trình giám định ADN Viện Khoa học hình ban hành theo Thơng tư 46/2013/TT-BCA ngày 05/11/2013-Bộ trưởng Bộ Cơng an) Gồm có bước sau: Hình 2.3: Sơ đồ qui trình giám định ADN 2.3.2.1.Tách chiết ADN Nguyên tắc: Mọi nghiên cứu liên quan đến công nghệ ADN bắt đầu việc thu nhận lượng ADN đủ lớn, nguyên vẹn có độ tinh để tiến hành bước phân tích Có nhiều phương pháp tách chiết ADN, nhiên Phân viện KHHS, chọn phương pháp tách chiết vô cơ, sử dụng chelex 100, phương pháp có nhiều ưu điểm thao tác đơn giản hiệu cao, bị nhiễm ADN tách chiết loại bỏ hoàn toàn chất ức chế phản ứng PCR Tên hoá chất, thiết bị STT Dung dịch Chelex 100, tỷ lệ 5% Block nhiệt khô cho ống1,5ml (1000C) kèm nhiệt kế Máy li tâm ống 1,5ml 14.000v/p Tủ an toàn sinh học Ống nghiệm loại 1,5ml (eppendorf) Giá đỡ cho ống eppendorf 1,5ml Các đầu típ 10µl, 200µl 1000µl pipetman tương ứng Bảng 2.1: Hóa chất thiết bị cho tách chiết AND 200 mẫu máu người Hoa tách chiết ADN chelex 5% theo quy trình:- Rửa dH2O (nước cất lần khử ion) ống 1,5 ml - Cho 200 ml chelex 5%, ủ 560C 30 phút 10 - Xác định bình phương tiêu chuẩn (α) so sánh giá trị bình phương tính với α: Nếu bình phương tính nhỏ α phân bố thực tế mẫu nghiên cứu phù hợp với phân phối lý thuyết Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân tích ADN 200 mẫu máu người Hoa 3.1.1 Kết thu, bảo quản mẫu, tách chiết định lượng ADN - Số lượng 200 thẻ FTA thu mẫu máu 200 cá thể người Hoa bảo quản theo quy định phòng giám định ( phụ lục 1) Tách chiết ADN từ 200 mẫu máu người Hoa theo phương pháp vô sử dụng dung dịch Chelex 100 nồng độ 5% Định lượng ADN theo phương pháp Realtime PCR sử dụng kít Quantifiler Human DNA Quantification (hãng Applied Biosystems) Kết định lượng 200 mẫu đủ điều kiện cho bước phân tích 3.1.2 Kết thực PCR, điện di phân tích kiểu gen Tiến hành 200 phản ứng PCR với kit Identifiler dựa nồng độ ADN định lượng (thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt theo nhà sản xuất, điện di máy giải trình tự ABI 3130, phân tích ADN phần mềm Gene Maper ID v3.2) Kết thu 200 bảng kiểu gen khác 200 mẫu (phụ lục 2) Hình 3.1: Hình ảnh điện di điển hình máy điện di 3130 AmpFlSTR® Identifiler™ D8S1179 6FAM (blue) D3S1358 D7S820 D21S11 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 VIC (green) TPOX D19S433 D18S51 VWA NED (yellow) AMEL D5S818 FGA PET (red) GS500 LIZ size standard LIZ (orange) 15 CSF1PO Hình 3.2: Kiểu gen cá thể người Hoa (ký hiệu HOA112) 3.2 Kết xử lý số liệu thống kê 3.2.1.Kết quan sát alen gen, tính tần suất số Từ 200 kiểu gen hệ Identifiler 200 cá thể người Hoa, quan sát tổng số 6000 alen, gồm 53 loại alen (từ đến 34.2)với tần suất số loại alen locus gen khác (Phụ lục 3) 3.2.2 Kết tần suất alen 15 locus gen Locus/ D8 D21 D7 CSF D3 Alen S1179 S11 S820 1P0 S1358 9.1* 9.3 10 11 11.1* 12 12.2 13 13.2 14 0.138 0.098 0.135 0.205 0.162 - 0.005 0.155 0.078 0.005 0.145 0.325 0.002 0.252 0.032 - 0.002 0.048 0.235 0.262 0.385 0.065 0.002 0.05 16 TH01 0.085 0.252 0.058 0.488 0.055 0.062 - D13 D16 S317 S539 0.005 0.322 0.118 0.14 0.23 0.152 0.028 0.005 0.27 0.095 0.288 0.21 0.105 0.03 Locus/ D8 D21 D7 CSF D3 Alen S1179 S11 S820 1P0 S1358 14.2 15 15.2 15.3** 16 16.2 17 17.2 18 19 20 21 21.2* 22 22.2* 23 23.2* 24 24.2* 25 26 27 28 28.2 29 29.2 29.3** 30 30.2 31 31.2 31.3** 32 32.2 32.3** 33 33.2 33.3** 34.2 0.16 0.095 0.008 0.86 0.85 0.959 0.704 0.352 12.88 18.31 0.002 0.032 0.002 0.235 0.005 0.002 0.305 0.002 0.072 0.082 0.002 0.032 0.152 0.002 0.002 0.058 0.005 0.002 0.865 0.811 0.941 0.634 0.317 6.52 7.81 0.79 0.778 0.918 0.573 0.286 8.54 12.59 0.715 0.721 0.874 0.472 0.236 1.42 7.81 0.345 0.328 0.218 0.055 0.005 0.735 0.721 0.872 0.47 0.235 1.88 7.81 Hobs Hexp PD PE PEB CHI(2TT) CHI(2lt) TH01 0.665 0.681 0.857 0.423 0.212 2.86 3.84 D13 D16 S317 S539 0.75 0.786 0.923 0.586 0.293 17.64 18.31 0.002 0.8 0.779 0.917 0.573 0.286 3.89 12.59 Bảng 3.2: Tổng hợp tần suất alen 15 locus gen hệ Identifiler người Hoa (nhóm gen) 17 Locus/ D2 D19 Alen S1338 S433 9.1* 9.3 10 11 11.1* 12 12.2 13 13.2 14 14.2 15 15.2 15.3** 16 16.2 17 17.2 18 19 20 21 21.2* 22 22.2* 23 23.2* 24 24.2* 25 26 27 28 28.2 29 29.2 29.3** 30 30.2 31 31.2 31.3** 32 32.2 32.3** 33 33.2 33.3** 0.002 0.002 0.002 0.008 0.005 0.012 0.09 0.068 0.2 0.11 0.04 0.038 0.23 0.128 0.06 0.005 0.09 - 0.065 0.005 0.272 0.038 0.252 0.088 0.062 0.168 0.008 0.012 0.018 0.005 0.005 0.002 - vWA TPOX 0.28 0.022 0.168 0.185 0.218 0.095 0.032 0.185 - 0.005 0.55 0.098 0.025 0.302 0.02 - 18 D18 D5 S51 S818 0.002 0.015 0.032 0.195 0.17 0.188 0.122 0.092 0.062 0.045 0.032 0.022 0.012 0.005 0.002 0.092 - 0.032 0.008 0.092 0.2 0.265 0.215 0.182 0.005 - FGA 0.002 0.02 0.095 0.045 0.122 0.008 0.202 0.01 0.185 0.005 0.142 0.01 0.088 0.045 0.02 - Locus/ D2 D19 Alen S1338 S433 34.2 0.9 0.859 0.965 0.723 0.362 7.36 12.59 0.775 0.816 0.943 0.643 0.322 4.37 7.81 Hobs Hexp PD PE PEB CHI(2TT) CHI(2lt) vWA TPOX 0.805 0.801 0.932 0.613 0.306 11.54 12.59 0.62 0.595 0.773 0.291 0.146 2.07 3.84 D18 D5 S51 S818 0.88 0.865 0.968 0.735 0.368 2.45 12.59 0.785 0.801 0.93 0.611 0.306 3.6 12.59 FGA 0.895 0.868 0.969 0.739 0.37 7.89 12.59 Bảng 3.3 : Tổng hợp tần suất alen 15 locus gen hệ Identifiler người Hoa (nhóm gen) Trong đó: - Hobs: Dị hợp tử quan sát; - Hexp: Dị hợp tử mong đợi; - PD: Khả phân biệt; - PE: Khả loại trừ; - PEB: Xác suất khơng bao gồm quan hệ dịng Y - CHI (2TT): chi-square test mẫu nghiên cứu - CHI(2LT): chi-square test với mức giá trị 5% theo lý thuyết - (*): alen khơng có hệ thống thang alen chuẩn; - (**): alen đặc trưng) 3.2.3 Đánh giá phù hợp theo định luật Hardy - Weinberg Tính tốn số thấy tất gen bảng tần suất có giá trị 2tt