KHO SAT VAI TRO CA PROTEIN p62 TRONG q

KHẢO SÁT VAI TRỊ CỦA PROTEIN P62 TRONG Q TRÌNH HÌNH THÀNH MITOPHAGY Nguyễn Kiều Linh, Hồ Nguyễn Anh Minh, Bùi Chí Bảo Trung tâm Y Sinh học Phân Tử, Đại học Y Dược, 217 Hồng Bàng quận 5, Tp Hồ Chí Minh TĨM TẮT Nhiều protein chủ chốt LC3, PARKIN, PINK, DJ-1 tham gia vào trình mitophagy q trình suy thối ti thể tế bào trước tín hiêu oxy hố stress.Tuy nhiên chế tương tác protein p62 mã hóa từ gene SQSTM1 với LC3 trình mitophagy chưa hiểu rõ Nghiên cứu tiến hành dòng tế bào HeLa giảm biểu gen P62 trình tự can thiệp shRNA thơng qua hệ thống TRExTM system Kết biểu kiểm tra phương pháp RT-PCR nhuộm ti thể nhằm xác định rõ vai trị P62 q trình mitophagy Đề tài chứng minh protein P62 giúp bảo vệ tế bào chống lại điều kiện stress nhờ vào chế hình thành mitophagy thơng khả tương tác với phân tử bị ubiquitin hóa màng ti thể PINK1 Từ đó, mở nhiều hướng nghiên cứu cho nghiên cứu chuyên sâu q trình mitophagy Từ khóa: autophagy, mitophagy, ROS, P62, palmitate, tetracycline, ti thể MỞ ĐẦU Autophagy (hoặc autophagocytosis) chế dị hóa làm phân hủy protein sai hỏng tế bào, bào quan, ngăn ngừa tích tụ protein bất thường thơng qua túi lysosome Autophagy có khả phá hủy số lượng lớn thành phần tế bào chất nhờ vào lysosome Q trình cịn cho phép tế bào tái sử dụng thành phần tế bào cung cấp acid amin điều kiện tế bào bị thiếu nguồn dinh dưỡng [1] Autophagy chia thành ba hình thức chính: macroautophagy, micro- autophagy autophagy có liên quan đến chaperone (Chaperone mediated autophagy - CMA) Quá trình macroautophagy liên quan đến hình thành lớp màng đôi autophagosome nhờ vào phối hợp hoạt động protein liên quan đến autophagy (Atg), giúp bao quanh bào làm sản sinh phần gốc oxy quan phần tế bào chất Sau tự ROS (reactive oxygen species) tế bào chất, autophagosome dung H2O2 Tuy nhiên, tế bào điều kiện hợp với lysosome thơng qua chế nội stress oxy hóa, lượng ROS tăng cao làm nhập bào (endocytosis) Trong lysosome, tổn thương nhân bào quan thành autophagosome bị phân khác có ti thể Các ti thể bị hư hủy hệ enzyme hydrolases Micro- hỏng thủy phân tui lysosome autophagy lại liên quan trực tiếp đến việc thông qua hình thức mitophagy Đến nuốt vật liệu tế bào chất vào có nhiều cơng trình nghiên cứu lysosome Theo đường CMA, bề mitophagy Ở nấm men, protein Atg32 có mặt màng lysosome có thụ thể LAMP- vai trị quan trọng định hướng 2A membrane trình mitophagy [3] Ở tế bào động vật có protein) chúng gắn với protein vú, có protein NIX tham gia q trình loại cần phân hủy để chuyển vào màng bỏ ti thể tế bào hồng cầu biệt Con đường có tính chọn lọc cao hoá [4] Các gen liên quan đến bệnh phân hủy protein chứa Parkinson mã hoá cho protein α- motif liên quan đến KFERQ pentapeptide NUCLEIN, PARKIN, PINK1, DJ-1 Ngồi ra, autophagy cịn phân tham gia trình mitophagy [5] Các loại đưa vào vật liệu mà phân hủy nghiên cứu cho thấy việc giảm Nếu trình phân hủy ribosome điện màng làm ti thể bị phân mảnh gọi ribophagy, phân hủy ti thể “fission”, đồng thời tăng biểu gọi mitophagy [2] PINK1 tạo điều kiện thuận lợi cho Trong tế bào, ti thể (mitochrondria) đóng PARKIN hướng bám vào ti thể dẫn tới vai trị quan trọng, chúng xem hình thành autophagosome để phân hủy ti “nhà máy lượng” tế bào nhờ vào thể việc tạo nhiều ATP thơng qua q trình Gần đây, nghiên cứu ức chế q trình hơ hấp Tuy nhiên, q trình vận autophagy mitophagy khiến hàm lượng chuyển điện tử màng ti thể, điện tử P62 tích tụ cao tế bào Những chuyển từ oxy đến phân tử nước nghiên cứu khác cho thấy cấu trúc P62 (lysosome associated có nhiều domain đặc biệt thiệp có cấu trúc kẹp tóc “short hairpin domain KIR (keap interacting region) RNA” (shRNA) để làm giảm biểu gen giúp cho P62 tương tác với phân tử mục KEAP1 associated (Invitrogen), tetracycline kích hoạt gen domain) giúp P62 gắn với phân tử bị mục tiêu shRNA thơng qua làm Ubiquitin giảm biểu protein P62 UBA hóa (Ubiquitin Vùng LRS (LC3 tiêu P62 Khi có tetracycline recognition sequence) giúp nhận biết chuỗi Phƣơng pháp LC3 vùng LIR (LC3 interacting region) Nuôi cấy tế bào: Tế bào HeLa P62 giúp P62 phản ứng LC3 gen thị nuôi cấy môi trường DMEM q trình autophagy[6] Kết hợp với (Welgen, Hàn Quốc) (có sẵn10% huyết nghiên cứu trước đó, giả thuyết thai bị, 1% kháng sinh P62 liên quan đến tính ổn định peniciline streptomycin) để tăng sinh tế bào bị stress trình Để cảm ứng giảm biểu gen HeLa P62 mitophagy có chọn lọc Như để ni mơi trường DMEM có nghiên cứu rõ vai trò P62 chứa tetracycline 100 ng/ml Tế bào HeLa trình mitophagy, nghiên cứu knock P62 ni mơi trường DMEM có down gen P62 nuôi cấy tế bào chứa tetracycline 100ng/ml 1mM điều kiện stress khảo sát trình hình palmitate (Sigma) để cảm ứng trình thành mitophagy mitophagy giảm biểu gen NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên liệu Dòng tế bào HeLa (ATCC- CCL 2TM) knock down gen P62 cách sử dụng hệ thống T-RExTM system từ trường đại học Sung Kuyn Kwan, Hàn Quốc Dựa vào hệ thống biểu T-REx system TM (Invitrogen, Cat, No K1020-01), tế bào HeLa chuyển đoạn RNA can P62 Tế bào nuôi cấy mơi trường cảm ứng mitophagy hóa chất palmitate, rapamycin (Sigma) hay môi trường thiếu serum RT-PCR: Tế bào HeLa P62 sau nuôi cấy đạt khoảng 80% diện tích đĩa ni cấy tách chiết RNA RNeasy Mini kit (QIAGEN) RNA sau tách chiết làm khn dựa vào đặc tính Enzyme Reverse Transcriptase, tổng hợp mạch cDNA Sau đó, cDNA mitophagy Bên cạnh đó, tế bào HeLa P62 nhân số lượng thông qua phản ứng ni cấy cảm ứng q trình khuếch đại (PCR) với mồi đặc hiệu P62 mitophagy giảm biểu gen GAPDH để kiểm tra biểu gen P62 nhuộm trực tiếp với thuốc Phương pháp nhuộm ti thể: tế bào nhuộm MiTo Tracker để quan sát ti thể nuôi cấy môi trường cảm ứng Quy trình thực đƣợc tóm tắt theo nhuộm với DAPI (Sigma) MitoTracker hình (Invitrogen) để quan sát hình thành Hình 1: Quy trình tiến hành KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết khảo sát nồng độ tetracycline khơng có vạch sản phẩm Như vậy, nồng độ tetracycline 150 200 ng/ml trình biểu gen bị ức chế Khi xét phản ứng RT-PCR với mồi hoàn toàn Tuy nhiên, gen P62 gen chứng nội GAPDH, ta thấy giếng cần thiết cho tế bào thành 5,6,7,8 có vạch sản phẩm Có phần đường truyền tín hiệu Nrf2 khác biệt giếng 1,2,3,4 điện di với giúp phiên mã sản phẩm chống oxy sản phẩm đặc hiệu mồi P62 hóa [7] Nên ta ức chế mạnh biểu ta xử lí tế bào với nồng độ tetracycline gen P62 ảnh hưởng mạnh khác trình biểu gen P62 đến sức sống tế bào, nồng độ bị ảnh hưởng Khi nồng độ tetracycline tetracycline chọn để cảm ứng giảm tăng biểu gen P62 biểu gen P62 cho thí nghiệm sau giảm, mẫu nồng độ tetracycline là 100 ng/ml(hình 2) tương ứng 150 ng/ml 200 ng/ml Hình 2: Kết RT-PCR với mồi đặc hiệu (P62 giếng 1,2,3,4; GAPDH giếng 5,6,7,8,9) giếng tế bào khơng xử lí hóa chất, giếng tế bào xử lí tetracycline 100 ng/ml, giếng tế bào xử lí tetracycline nồng độ 150 ng/ml, giếng tế bào xử lí tetracycline 200 ng/ml Trong đó, giếng chứng âm khơng có cDNA 2 Kết khảo sát môi trƣờng cảm ứng mitophagy thể, khiến ti thể bị hư hại phải tăng mạnh trình dung hợp phân tách Theo kết hình xử lí tế bào HeLa Tuy nhiên, điều kiện stress ti thể với hóa chất rapamycin, palmitate hình thành q trình phân tách khơng mơi trường khơng có serum ti thể bị bền vững nên thường bị phân hủy theo tích tụ nhiều so với mẫu đối chứng đường mitophagy [8] Như vậy, tích tụ ti thể xem dấu hiệu trình mitophagy Mặc dù rapamycin thường dùng đối chứng dương trình hình thành autophagy Nhưng quan sát kết nhuộm, ta thấy rapamycin khơng cảm ứng q trình mitophagy tốt palmitate Do đó, mơi trường có chứa palmitate thích hợp để cảm ứng q trình mitophagy cho thí nghiệm sau Kết khảo sát vai trị P62 mơi trƣờng cảm ứng mitophagy Theo kết hình 4, ti thể bị tích tụ Hình 3: Kết nhuộm tế bào với DAPI (xanh dương) Mito Tracker (màu đỏ) môi trường cảm ứng Mitophagy A môi trường đối chứng không xử lí hóa chất, B mơi trường khơng có serum, C mơi trường có rapamycin 100 ng/ml, D mơi trường có palmitate 1mM Ngun nhân tượng chất làm tăng tín hiệu stress ti nhiều mơi trường có xử lí palmitate (mẫu C D) mẫu A B ti thể khơng có khác biệt rõ Ở mẫu B, có tetracycline mơi trường làm giảm biểu gen P62 nhiên mơi trường khơng có chất cảm ứng gây stress cho tế bào nên ti thể trạng thái bình thường Riêng mẫu C D có xử lí với palmitate để cảm ứng q trình mitophagy ti thể xuất tích tụ với mẫu D đồng thời giảm biểu P62 tích tụ biểu mạnh nhiều Điều giải thích xử lí tế bào palmitate có tích tụ ti thể trình mitophagy xảy để phân hủy lượng ti thể hư hại Với mẫu D ti thể tích tụ nhiều chế mitophagy bị ảnh hưởng P62 nên khơng có khả phân hủy ti thể Ti thể bị hư hại tích tụ tế bào, bên cạch trình phân tách diễn làm cho lượng tín hiệu huỳnh quang tăng lên đột ngột Như có khả Hình 4: Kết nhuộm tế bào với Mito protein P62 tham gia vào trình Tracker (màu đỏ) mơi trường cảm hình thành mitophagy ứng Mitophagy A môi trường đối Thảo luận chứng không xử lí hóa chất, B mơi Một nghiên cứu gần phân tích trường có tetracycline 100 ng/ml, C protein tương tác với PARKIN môi trường có palmitate 1mM, D mơi q trình ubiquitin hóa tập trường có palmitate 1mM tetracycline hợp protein màng ti thể bị 100 ng/ml ubiquitin hóa PINK1, MFN2, P62 [9] Trong cấu trúc protein P62 lại Theo nghiên cứu trước khẳng có domain tương tác với phân tử bị định PINK1 PARKIN có vai trị quan ubiquitin hóa protein LC3 trọng trình mitophagy giúp ti thể marker cho trình autophagy Điều hình thành màng autophagosome [5] Bên cho thấy có khả vai trị cạnh đó, bệnh nhân bị Parkinson đột protein P62 trình mitophagy biến gene PARKIN hàm lượng P62 bị tích thơng khả tương tác với phân tử tụ nhiều tế bào, trình bị ubiquitin hóa màng ti thể mitophagy bị ức chế [10] PINK1 LC3 nhờ vào domain LIR điều kiện stress để hình thành auto- mitophagy Điều này, giúp hiểu biết thêm phagosome để phân hủy ti thể thơng tin q trình Protein P62 có nhiều domain dó mitophagy vai trị P62 đồng có khả tương tác với nhiều loại thời giúp xây dựng mô hình tế bào bị cảm protein khác Nhiều nghiên cứu cho ứng mitophagy cách hiệu tạo tiền thấy P62 có tham gia vào đường đề, định hướng cho nghiên cứu tín hiệu mTOR, NFκB trình chuyên sâu sau, cần tiến hành hình thành khối u [11] Mặt khác, theo kết thêm thí nghiệm kiểm tra vai trị nghiên cứu cho thấy P62 palmiate lên trình mitophagy, kiểm tra tham gia vào trình mitophgagy giúp vai trị mitophagy tế bào thải loại ti thể hư hỏng Hơn Lời cảm ơn: Chúng tơi gửi lời cảm ơn mitophagy cịn giúp tế bào tránh khỏi đến dự án TRIG Đại học Y Dược trình apoptosis nhờ vào khả phân hủy HCM hỗ trợ trang thiết bị Cảm ơn Viện ti thể hư hỏng trước chúng thải Y cyctochrome c kích hoạt apoptosis Ở Kyunkwan cung cấp nguồn tế bào HeLa dòng tế bào ung thư trình lại ảnh knock down P62 Đồng thời gửi lời hưởng đến khả điều trị thuốc cảm ơn đến Dr Lee Chang Woo Dr Giúp cho tế bào ung thư tồn Shin Jaekyoon Sinh Samsung trường Y Sung trước điều kiện stress thuốc gây tránh q trình apoptosis Chính mà vai trị hình thành hay ức chế khối u p62 cần phải nghiên cứu thêm KẾT LUẬN Dựa vào kết thu được, nghiên cứu tìm môi trường cảm ứng mitophagy tốt 1mM palmitate TÀI LIỆU THAM KHẢO de Duve, C., Walttiaux, R "Functions of lysosome." Annual Review Physiology (1966): 435-492 Mizhusima, N., Nonoru, M "Autophagy prosess and function." Genes & Develpoment (2007): 9-14 3.Kanki, T., Tomotake, K "Nix: A Nghiên cứu chứng minh vai trò receptor protein P62 có liên quan đến q trình mammals." Autophagy (2010): 433-435 protein for mitophagy in 4.Richard, "Mechanism J., of Youle & Derek, mitophagy." P and mammalian longevity by the P62- Nature Keap1-Nrf2-Nqo1 cascade." Embo reports Reviews Molecular Cell Biology (2011): 9-14 (2012): 150-156 Dieter, A K., Asa, B "Mitochondria 5.Tomotake, K., Ke, W., Yang, C., and Mitophagy: The Yin and Yang of Cell Misuzu, B "Atg32 is a mitochondrial Death Control" Circulation Research protein that confers selectivity during (2012) , 1208-1221 mitophagy."Developmental cell (2010): 89-109 6.Shin, I., Daichi, M., Kyohei, A., Satoru, Shireen, A.S., Malavika, R., Virginia, G.P., Mathew, E.S Edward, L.H., Steven, P.G., Wade, H "Landscape of the ubiquitylome in U., Takeshi, T., Jun, H., Yu-shin, S., PARKIN-dependent Komatsu, M., Keiji, T., Masahiro, S., and response to mitochondrial depolarization." Hidehito, T "Crystal Structure of the Nature (2013): 372-376 Ubiquitin-associated (UBA) Domain of 10 Thangiah, G., Nilmini, V., Marina, P62 and Its Interaction with Ubiquitin." J S., and Jeganathan, R.B “Sequestosome Biol Chem (2011): 31864-31874 1/p62: across disease” Biomarkers (2012), Kwon, J., Han, E., Bui, C.B., Shin, W., 1–5 Lee, J., Lee, S., Choi, Y.B., Lee, A.H., 11 Alexandre, P., Mina, F., Patrick, A Lee, K.H., Park, C., Obin, M.S., Park, "When autophagy memts cancer through S.K., Seo, Y.J., Oh, G.T., Lee, H.W., Shin, p62/SQSTM1." America Journal Cancer J "Assurance of mitochondrial integrity Research (2012): 397-413 THE ROLE OF PROTEIN P62 IN MITOPHAGY Nguyen Kieu Linh, Ho Nguyen Anh Minh, Bui Chi Bao University of medicine and pharmacy Hochiminh city SUMARY Mitophagy has been increasingly implicated in diseases including neurodegenerative disease, diabetes, and cancer Several proteins such as Nix, Parkin, Pink1…show that they involve in regulation of mitophagy More recently, the Sequestosome (P62) together with LC3 have formed a special sequestration that scavengers damaged organelles and proteins However, the sequestration of mitochondria after damage is poorly understood Therefore, we studied on the role of P62 role in mitophagy targeting damaged mitochondria We performed a T-RexTM system to control the expression of P62 in the HeLa cell lines This system was used to examine the molecular mechanism whether the mitophagy would be required P62 or not In this results, we found the accumulation of damaged mitochondria in absence of P62 More experiences with mitophagy are needed to carry out the role of P62 to remove damaged mitochondria These results would be useful for more insights of mechanism of mitophagy that related to aging disease such as Parkinson, Alzheimer and cancer Họ tên: CN NGUYỄN KIỀU LINH, CN HỒ NGUYỄN ANH MINH, TS BÙI CHÍ BẢO Cơ quan: Trung tâm Y Sinh học phân tử, đại học Y Dược tp, Hồ Chí Minh Địa liên hệ: Đại học Y dược Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh - Tel: 0838535159 Email:bcbao@ump.edu.vn ... ubiquitin hóa PINK1, MFN2, P62 [9] Trong cấu trúc protein P62 lại Theo nghiên cứu trước khẳng có domain tương tác với phân tử bị định PINK1 PARKIN có vai trị quan ubiquitin hóa protein LC3 trọng trình... associated (Invitrogen), tetracycline kích hoạt gen domain) giúp P62 gắn với phân tử bị mục tiêu shRNA thông qua làm Ubiquitin giảm biểu protein P62 UBA hóa (Ubiquitin Vùng LRS (LC3 tiêu P62 Khi có... memts cancer through S.K., Seo, Y.J., Oh, G.T., Lee, H.W., Shin, p62/ SQSTM1." America Journal Cancer J "Assurance of mitochondrial integrity Research (2012): 397-413 THE ROLE OF PROTEIN P62 IN