Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trên một pha tĩnh đƣợc cố định trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao [2]. Các thuốc đƣợc nghiên cứu bằng kỹ thuật thẩm tách micro hầu hết có bản chất thân nƣớc nên sắc ký phân bố pha đảo thƣờngđƣợc dùng, ngoài ra có thể sử dụng cột trao đổi ion. Các thông số khác của cột sắc ký (chiều dài cột, kích thƣớc hạt, đƣờng kính trong) đƣợc xác định dựa theo khoảng cách lấy mẫu mong muốn và yêu cầu về độ nhạy.
Phần lớn các máy sắc ký lỏng cần lƣợng mẫu phân tích tối thiểu là 10μl. Nếu tốc độ truyền dịch vào là 1μl/phút thì sau khoảng thời gian phân tích khoảng 15 – 30 phút, chúng ta sẽ thu đƣợc một lƣợng dịch từ 15 đến 30μl, lƣợng này đủ để phân tích bằng các máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tốc độ truyền dịch càng chậm thì hiệu suất kim thăm dò càng cao, tuy nhiên thời gian phân tích sẽ kéo dài. Cột mao dẫn đƣợc sử dụng để tăng độ nhạy và rút ngắn thời gian phân tích [70].
Mẫu sau khi lấy có thể bảo quản đông lạnh với nhiệt độ thích hợp trong khi chờ định lƣợng (offline microdialysis) [75, 105]. Ngày nay, với những tiến bộ trong phân tích hóa học cho phép thiết kế một hệ thống lấy mẫu và định lƣợng trực tiếp (online microdialysis) [22, 73] nồng độ thuốc trong dịch kẽ mô một cách nhanh chóng, giúp cho việc giám sát nồng độ thuốc tại mô, tạo ra khả năng điều chỉnh tức thời liều dùng của thuốc trên từng bệnh nhân cụ thể [22].
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật tách khác nhau [2]. Tuy vậy, một máy sắc ký lỏng luôn đƣợc cấu tạo gồm các bộ phận cơ bản sau:
1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thƣờng là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp. Cần phải có bộ phận khử khí để đuổi khí hòa tan trong pha động bằng các cách nhƣ lọc (màng lọc 0,45μm), chạy siêu âm, sục khí trơ…do khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, nhiễu đƣờng nền.
Pha động thƣờng đƣợc chứa trong bình thủy tinh. Có 2 kiểu thực hiện chƣơng trình dung môi: trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc ở áp suất cao.
2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cẩn đáp ứng các yêu cầu:
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên. - Đảm bảo bơm lƣu lƣợng lặp lại trong khoảng 2-3μl/phút đến 20
mL/phút.
- Cẩn chế tạo từ vật liệu thích hợp để đảm bảo chịu đƣợc tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).
3. Hệ tiêm mẫu
Hệ tiêm mẫu là một van tiêm có vòng chứa mẫu dung tích từ 0,5-20μl, dể dàng tự động hóa, đƣợc điều khiển và kiểm soát bằng phần mềm máy tính.
Cột đƣợc chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10- 30 cm, đƣờng kính 4-10mm, bao gồm cột nhồi, cột bảo vệ và điều nhiệt cột.
5. Detector
Phát hiện chất phân tích dựa trên tính chất của chất phân tích nhƣ hấp thụ bức xạ UV, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện… Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại,
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lƣợng hoặc nồng độ thấp,
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng, - Khoảng hoạt động tuyến tính rộng, - Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
Có nhiều loại detector nhƣ detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn…
6. Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu
Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống; máy in…