Dịch truyền vào khi sử dụng kỹ thuật thẩm tách micro phải vô khuẩn, có thành phần, áp suất thẩm thấu và pH tƣơng tự nhƣ dịch tại mô cấy kim thăm dò [83, 85]. Thành phần của các dung dịch hay dùng cho kỹ thuật thẩm tách micro đƣợc ghi trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các dung dịch truyền sử dụng trong kỹ thuật thẩm tách micro
Thành phần Nhà sảnhu xuất
Dịch truyền cho mô não Dung dịch CNS
MgCl2 0,85 mmol/l CaCl2 1,2 mmol/l NaCl 147 mmol/l
KCl 2,7 mmol/l Hãng CMA, Thụy
Điển
Dịch truyền cho mô ngoại vi (mô da và các mô tổ chức của cơ thể) Dung dịch T1 [14, 35] Na+ 147 mmol/l Ca2+ 2,3 mmol/l K+ 4 mmol/l Cl- 156 mmol/l Hãng CMA, Thụy Điển Dung dịch Ringer [44] Na+ 147 mmol/l Ca2+ 2,25 mmol/l K+ 4 mmol/l Cl- 156 mmol/l Baxter, Utrecht, Hà Lan
Nhũ tƣơng vô trùng Intralipid (IL) [10] Dầu đậu nành 200 g Phospholipid trứng 12 g Glycerol anhydrid 22 g NaOH và H2O (lƣợng vừa đủ để điều chỉnh pH=8) Fresenius Kabi, Midrand, Nam Mỹ 2.2.4. Định lƣợng các phân tử thuốc
Sau khi lấy mẫu, việc định lƣợng mẫu là không thể thiếu, trong kỹ thuật thẩm tách micro, lƣợng mẫu thu đƣợc rất nhỏ (cỡ vài chục microlit) nên đòi hỏi các phƣơng pháp định lƣợng phải có độ nhạy cao nhƣ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC - MS)…
2.2.4.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trên một pha tĩnh đƣợc cố định trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao [2]. Các thuốc đƣợc nghiên cứu bằng kỹ thuật thẩm tách micro hầu hết có bản chất thân nƣớc nên sắc ký phân bố pha đảo thƣờngđƣợc dùng, ngoài ra có thể sử dụng cột trao đổi ion. Các thông số khác của cột sắc ký (chiều dài cột, kích thƣớc hạt, đƣờng kính trong) đƣợc xác định dựa theo khoảng cách lấy mẫu mong muốn và yêu cầu về độ nhạy.
Phần lớn các máy sắc ký lỏng cần lƣợng mẫu phân tích tối thiểu là 10μl. Nếu tốc độ truyền dịch vào là 1μl/phút thì sau khoảng thời gian phân tích khoảng 15 – 30 phút, chúng ta sẽ thu đƣợc một lƣợng dịch từ 15 đến 30μl, lƣợng này đủ để phân tích bằng các máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tốc độ truyền dịch càng chậm thì hiệu suất kim thăm dò càng cao, tuy nhiên thời gian phân tích sẽ kéo dài. Cột mao dẫn đƣợc sử dụng để tăng độ nhạy và rút ngắn thời gian phân tích [70].
Mẫu sau khi lấy có thể bảo quản đông lạnh với nhiệt độ thích hợp trong khi chờ định lƣợng (offline microdialysis) [75, 105]. Ngày nay, với những tiến bộ trong phân tích hóa học cho phép thiết kế một hệ thống lấy mẫu và định lƣợng trực tiếp (online microdialysis) [22, 73] nồng độ thuốc trong dịch kẽ mô một cách nhanh chóng, giúp cho việc giám sát nồng độ thuốc tại mô, tạo ra khả năng điều chỉnh tức thời liều dùng của thuốc trên từng bệnh nhân cụ thể [22].
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật tách khác nhau [2]. Tuy vậy, một máy sắc ký lỏng luôn đƣợc cấu tạo gồm các bộ phận cơ bản sau:
1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thƣờng là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp. Cần phải có bộ phận khử khí để đuổi khí hòa tan trong pha động bằng các cách nhƣ lọc (màng lọc 0,45μm), chạy siêu âm, sục khí trơ…do khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, nhiễu đƣờng nền.
Pha động thƣờng đƣợc chứa trong bình thủy tinh. Có 2 kiểu thực hiện chƣơng trình dung môi: trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc ở áp suất cao.
2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cẩn đáp ứng các yêu cầu:
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên. - Đảm bảo bơm lƣu lƣợng lặp lại trong khoảng 2-3μl/phút đến 20
mL/phút.
- Cẩn chế tạo từ vật liệu thích hợp để đảm bảo chịu đƣợc tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).
3. Hệ tiêm mẫu
Hệ tiêm mẫu là một van tiêm có vòng chứa mẫu dung tích từ 0,5-20μl, dể dàng tự động hóa, đƣợc điều khiển và kiểm soát bằng phần mềm máy tính.
Cột đƣợc chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10- 30 cm, đƣờng kính 4-10mm, bao gồm cột nhồi, cột bảo vệ và điều nhiệt cột.
5. Detector
Phát hiện chất phân tích dựa trên tính chất của chất phân tích nhƣ hấp thụ bức xạ UV, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện… Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại,
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lƣợng hoặc nồng độ thấp,
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng, - Khoảng hoạt động tuyến tính rộng, - Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
Có nhiều loại detector nhƣ detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn…
6. Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu
Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống; máy in…
2.2.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
Với sự tiến bộ tiến bộ của khoa học kỹ thuật, phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ đang dần chiếm ƣu thế và đƣợc sử dụng rộng rãi trong 10 năm trở lại đây. Sắc ký lỏng (liquid chromatography-LC) là một kỹ thuật cơ bản dùng để phân tách các chất. Khối phổ (mass spectrometry –MS) trở thành một detector ngày càng đƣợc dùng phổ biến cho phân tích online [22, 73] hoặc offline [75, 105] chất thẩm tách micro thu đƣợc. Phƣơng pháp này cung cấp những thông tin về khối lƣợng phân tử, cấu trúc hóa học, tên hợp chất, số lƣợng hợp chất và độ tinh khiết của mẫu phân tích. Những dữ liệu này làm chắc chắn thêm các kết quả định tính và định lƣợng.
Nguyên lý hoạt động của khối phổ là đo trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z) đƣợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu, qua đó xác định các đồng vị hóa học mà không dùng bức xạ điện từ nhƣ các kỹ thuật quang phổ. Tỷ số m/z đƣợc biểu thị bằng đơn vị khối lƣợng nguyên tử (1 đơn vị khối lƣợng nguyên tử bằng 1/12 khối lƣợng của Carbon 12C) hoặc bằng Dalton (1 dalton bằng khối lƣợng của nguyên tử Hydro) [2]. Khối phổ cung cấp cho ta những thông tin về khối lƣợng phân tử, cấu trúc hóa học của hợp chất, số lƣợng hợp chất và độ tinh khiết của mẫu phân tích. Những dữ liệu này làm tăng thêm độ tin cậy của các kết quả định tính và định lƣợng [2].
Sắc ký lỏng kết nối khối phổ hay khối phổ ghép (tandem mass spectrometry) làm tăng đáng kể tính chọn lọc và độ nhạy của phƣơng pháp phân tích. Giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam [2]. Nồng độ các chất trong mẫu thẩm tách micro rất nhỏ, thành phần tƣơng đối phức tạp, bao gồm cả thuốc, các chất chuyển hóa của thuốc và các chất khác có trong dịch ngoại bào. Sử dụng LC – MS giúp cho kết quả thu đƣợc chính xác hơn và có giá trị hơn [48]. Vì vậy rất nhiều nghiên cứu về thẩm tách micro đã sử dụng phƣơng pháp này để định lƣợng [53, 59, 71, 72].
2.2.5. Hiệu chỉnh kết quả thu đƣợc
Kỹ thuật thẩm tách micro dựa vào sự khuếch tán các phân tử thuốc theo gradient nồng độ qua màng bán thấm, chịu ảnh hƣởng bởi khả năng thẩm tách của
màng kim thăm dò, nên nồng độ thuốc trong dịch thu đƣợc chƣa phản ánh đƣợc nồng độ thuốc thực chất tại mô đích. Trong đa số các trƣờng hợp, nồng độ đo đƣợc thấp hơn nồng độ thực tế tại dịch kẽ mô. Vì thế, ngoài việc chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật thẩm tách micro trong nghiên cứu thuốc, các nghiên cứu còn đề cập đến sự cần thiết phải có phƣơng pháp hiệu chỉnh lại lƣợng thuốc thu đƣợc tại mô [56].
Tỷ lệ giữa nồng độ trong dịch thu đƣợc và nồng độ thực trong dịch kẽ mô của một chất đƣợc gọi là hiệu suất tƣơng đối, còn lƣợng chất đó thu đƣợc trong một đơn vị thời gian gọi là hiệu suất tuyệt đối. Xác định hiệu suất tuyệt đối là đủ để so sánh giữa các giá trị đo đƣợc. Tuy nhiên, muốn biết chính xác nồng độ trong dịch kẽ mô thì cần phải tính hiệu suất tƣơng đối bằng các phƣơng pháp in vivo hay in vitro
[106].
Hình 2.10. Mô hình đánh giá hiệu suất màng bán thấm kim thăm dò in vitro
Hiệu suất tƣơng đối in vitro đƣợc xác định một cách đơn giản bằng cách cố định giá trị nồng độ dịch xung quanh màng bán thấm trên kim thăm dò và đo giá trị nồng độ thu đƣợc [22]. Tỷ lệ giữa nồng độ thuốc trong dịch thu đƣợc lấy ra từ đầu thu của kim thăm dò (Cout) và nồng độ thuốc đã biết khi đặt kim thăm dò vào dung dịch này (Cin) chính là hiệu suất tƣơng đối in vitro (Hình 2.10).
Tính hiệu suất kim thăm dò in vivo phức tạp hơn và gặp phải nhiều khó khăn do ảnh hƣởng của nhiều yếu tố dƣợc động học, dƣợc lực học nhƣ đặc điểm sinh lý của mô và tƣơng tác giữa mô đích với phân tử thuốc [22]. Hiện nay, các phƣơng
pháp tính hiệu suất in vivo thƣờng đƣợc sử dụng gồm có: No - net - flux (NNF)[39], ngoại suy tốc độ dòng chảy (ZFR, extrapolation to zero-flow rate) [20], thẩm tách ngƣợc (RD, retrodialysis) [91], tốc độ dòng chảy rất chậm (SFR, very slow flow rate) [12]… Tuy phức tạp và gặp nhiều khó khăn trong quá trình tính toán, kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp in vivo lại đáng tin cậy hơn và giúp xác định nồng độ thực của thuốc trong dịch kẽ mô một cách chính xác.
2.2.5.1. Phương pháp No- net - flux (NNF)
Hay còn gọi là Zero-net-flux, phƣơng pháp này sử dụng thuốc ở dịch kẽ mô, dựa trên nguyên lý các chất khuếch tán thẩm tách ngƣợc (RD, retrodialysis) qua màng bán thấm theo gradient nồng độ [50, 57]. Truyền vào các dịch truyền có nồng độ phân tử thuốc khác nhau đã biết qua kim thăm dò (Cin), sau đó sẽ đo nồng độ mẫu thu đƣợc Cout. Dịch đƣợc truyền với tốc độ ổn định sao cho nồng độ thuốc trong dịch kẽ mô là một hằng số. Khi đó, hiệu suất in vivo của kim thăm dò (EF, extraction fraction) tại dịch kẽ mô đƣợc tính theo công thức [21, 57, 106]:
trong đó:
Cin là nồng độ của dịch truyền vào
Cout là nồng độ của dịch thu đƣợc
Cm là nồng độ chất phân tích trong dịch kẽ mô bao quanh kim thăm dò.
Trƣờng hợp đặc biệt khi Cin= 0, EF chính bằng hiệu suất tƣơng đối (RR, relativerecovery).
Hình 2.11. Phương pháp no - net - flux trong hiệu chỉnh in vivo
Đồ thị trên thể hiện quan hệ tuyến tính giữa Δ = Cout– Cin và Cin. Độ dốc của
đồ thị chính là hiệu suất tƣơng đối (Hình 2.11) [39, 66].
2.2.5.2. Phương pháp ngoại suy tốc độ dòng chảy (ZFR)
Hiệu suất tƣơng đối phụ thuộc vào tốc dòng chảy, sự thay đổi của tốc độ truyền dịch dẫn tới sự thay đổi của hiệu suất tƣơng đối, phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: tốc độ truyền dịch vào thay đổi, trong khi nồng độ dịch truyền vào Cin
bằng 0, còn nồng độ chất phân tích trong dịch kẽ mô là hằng định. Lúc này, hiệu suất của kim thăm dò phụ thuộc vào tốc độ truyền dịch và đƣợc tính theo công thức [20, 40]:
Với
trong đó:
Cout là nồng độ dịch thu đƣợc
Cm là nồng độ dịch xung quanh kim thăm dò r là hệ số chuyển khối
A là diện tích màng bán thấm F là tốc độ truyền dịch.
Ngƣời ta giả định rằng tính thấm và diện tích của màng bán thấm là không đổi trong suốt quá trình thử nghiệm. Nồng độ thực của chất phân tích trong dịch kẽ mô bao quanh kim thăm dò đƣợc xác định bằng cách dùng phép ngoại suy trên đồ thị khi tốc độ truyền dịch F = 0 và hệ thống đạt cân bằng, lúc đó Cout = Cm.
Phƣơng pháp này có nhƣợc điểm chính là tốn nhiều thời gian do tốc độ dòng chảy nhỏ, có trƣờng hợp cần đến 12h để lấy đủ lƣợng mẫu cần thiết [20].
2.2.5.3. Phương pháp thẩm tách ngược (RD)
Phƣơng pháp thẩm tách ngƣợc (RD, retrodialysis) hiện là phƣơng pháp đƣợc sử dụng đƣợc nhiều nhất [3, 21], là trƣờng hợp đặc biệt của phƣơng pháp No - net – flux, sử dụng chính chất đƣợc nghiên cứu hoặc dùng một chất chuẩn nội thêm vào dịch truyền vào kim thăm dò [95, 97]. Chất chuẩn nội lý tƣởng phải giống thuốc không những về tính chất vật lý (khả năng khuếch tán qua màng, độ tan...) mà còn cả về đặc tính sinh học (chuyển hóa, liên kết protein...) [20, 49]. Giả định rằng hệ số khuếch tán qua màng bán thấm theo cả hai chiều là nhƣ nhau, nồng độ dịch kẽ mô
Cm = 0, thì hiệu suất của thuốc chính là hiệu suất của chất chuẩn nội. Hiệu suất này
đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa nồng độ bị mất đi (Δ = Cin – Cout) và nồng độ ban đầu Cin
của chất chuẩn nội theo công thức [99, 106]:
Chất chuẩn nội cần phải có độ phân tán, độ dẫn truyền… tƣơng tự nhƣ chất phân tích, vì thế ngƣời ta thƣờng chọn chất chuẩn nội là đồng phân phóng xạ hoặc đồng phân deuteri (2H) với chất phân tích.
Các phƣơng pháp hiệu chỉnh đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Tùy vào từng nghiên cứu cụ thể, việc lựa chọn phƣơng pháp cần đƣợc cân nhắc sao cho có thể tính đƣợc chính xác hiệu suất của kim thăm dò.
2.3. QUY TRÌNH CHUNG CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO TRONG NGHIÊN CỨU Y DƢỢC HỌC
Kỹ thuật thẩm tách micro trong nghiên cứu y dƣợc học đƣợc tiến hành theo một quy trình chung gồm 5 bƣớc [7]:
Bước 1: Chuẩn bị các kim thăm dò, dung dịch truyền có thành phần và nồng độ tƣơng ứng với dịch tại mô đích cần nghiên cứu và các đối tƣợng nghiên cứu (ngƣời, chuột, thỏ, lợn, khỉ, mèo…).
Bước 2: Cấy kim thăm dò vào mô đích tác dụng của thuốc (não, cánh tay, bắp đùi, lƣng….)
Bước 3: Truyền dịch có thành phần và nồng độ tƣơng ứng với dịch tại mô đích với tốc độ rất chậm (từ 0,1 - 5 μl/phút), dịch thẩm tách thu đƣợc sẽ có chứa các phân tử thuốc/chất chuyển hóa.
Bước 4: Định lƣợng nồng độ phân tử thuốc/chất chuyển hóa/chất nội sinh trong dịch thẩm tách thu đƣợc bằng phƣơng pháp phân tích thích hợp (HPLC, UPLC [89, 91, 102], LC – MS…).
Bước 5: Hiệu chỉnh lại nồng độ thuốc/chất chuyển hóa/chất nội sinh thông qua hiệu suất in vitro hoặc in vivo của màng bán thấm.
2.4. ƢU NHƢỢC ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO
2.4.1. Ƣu điểm
Cho phép xác định nồng độ của phân tử thuốc ở dạng tự do [7, 9], ở dạng này thuốc mới có tác dụng và có mối tƣơng quan thuận với hiệu quả điều trị, từ đó cung cấp những thông tin về dƣợc động học của thuốc [7, 21].
Kỹ thuật thẩm tách micro có thể dùng để lấy mẫu nhiều chất khác nhau (dao động từ 5 - 100 kDa), chủ yếu là các phân tử có trọng lƣợng thấp (thƣờng từ 10 – 30 kDa) [106].
Kỹ thuật này ít xâm lấn [94], dùng đƣợc trên ngƣời, ngay cả trong trƣờng hợp cấp cứu hoặc chăm sóc tích cực [21].
Kim thăm dò đƣợc dùng nghiên cứu trên nhiều mô khác nhau [30, 31, 67, 96, 103] (Hình 2.12).
Hình 2.12. Cấy kim thăm dò ở não (trái) và ở bả vai (phải) [79]
Có thể cấy nhiều kim thăm dò vào cùng một mô đích [25, 61, 108].
Ứng dụng kỹ thuật thẩm tách micro trong điều trị tại mô đích, nơi mà các phân tử thuốc không thể phân bố đến các mô bệnh [7, 62].
Có thể kết hợp với nhiều phƣơng pháp phân tích hóa học nhƣ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC – MS [33, 37, 86, 104]….
Lấy đƣợc mẫu sạch trong đó chất phân tích không bị ảnh hƣởng bởi hoạt tính của enzym. Mẫu lấy đƣợc có thể định lƣợng trực tiếp ngay, không mất thời gian chuẩn bị hay làm sạch [52].
Không làm mất cân bằng nội môi, không làm mất dịch của cơ thể vì chỉ có