Hay còn gọi là Zero-net-flux, phƣơng pháp này sử dụng thuốc ở dịch kẽ mô, dựa trên nguyên lý các chất khuếch tán thẩm tách ngƣợc (RD, retrodialysis) qua màng bán thấm theo gradient nồng độ [50, 57]. Truyền vào các dịch truyền có nồng độ phân tử thuốc khác nhau đã biết qua kim thăm dò (Cin), sau đó sẽ đo nồng độ mẫu thu đƣợc Cout. Dịch đƣợc truyền với tốc độ ổn định sao cho nồng độ thuốc trong dịch kẽ mô là một hằng số. Khi đó, hiệu suất in vivo của kim thăm dò (EF, extraction fraction) tại dịch kẽ mô đƣợc tính theo công thức [21, 57, 106]:
trong đó:
Cin là nồng độ của dịch truyền vào
Cout là nồng độ của dịch thu đƣợc
Cm là nồng độ chất phân tích trong dịch kẽ mô bao quanh kim thăm dò.
Trƣờng hợp đặc biệt khi Cin= 0, EF chính bằng hiệu suất tƣơng đối (RR, relativerecovery).
Hình 2.11. Phương pháp no - net - flux trong hiệu chỉnh in vivo
Đồ thị trên thể hiện quan hệ tuyến tính giữa Δ = Cout– Cin và Cin. Độ dốc của
đồ thị chính là hiệu suất tƣơng đối (Hình 2.11) [39, 66].
2.2.5.2. Phương pháp ngoại suy tốc độ dòng chảy (ZFR)
Hiệu suất tƣơng đối phụ thuộc vào tốc dòng chảy, sự thay đổi của tốc độ truyền dịch dẫn tới sự thay đổi của hiệu suất tƣơng đối, phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: tốc độ truyền dịch vào thay đổi, trong khi nồng độ dịch truyền vào Cin
bằng 0, còn nồng độ chất phân tích trong dịch kẽ mô là hằng định. Lúc này, hiệu suất của kim thăm dò phụ thuộc vào tốc độ truyền dịch và đƣợc tính theo công thức [20, 40]:
Với
trong đó:
Cout là nồng độ dịch thu đƣợc
Cm là nồng độ dịch xung quanh kim thăm dò r là hệ số chuyển khối
A là diện tích màng bán thấm F là tốc độ truyền dịch.
Ngƣời ta giả định rằng tính thấm và diện tích của màng bán thấm là không đổi trong suốt quá trình thử nghiệm. Nồng độ thực của chất phân tích trong dịch kẽ mô bao quanh kim thăm dò đƣợc xác định bằng cách dùng phép ngoại suy trên đồ thị khi tốc độ truyền dịch F = 0 và hệ thống đạt cân bằng, lúc đó Cout = Cm.
Phƣơng pháp này có nhƣợc điểm chính là tốn nhiều thời gian do tốc độ dòng chảy nhỏ, có trƣờng hợp cần đến 12h để lấy đủ lƣợng mẫu cần thiết [20].
2.2.5.3. Phương pháp thẩm tách ngược (RD)
Phƣơng pháp thẩm tách ngƣợc (RD, retrodialysis) hiện là phƣơng pháp đƣợc sử dụng đƣợc nhiều nhất [3, 21], là trƣờng hợp đặc biệt của phƣơng pháp No - net – flux, sử dụng chính chất đƣợc nghiên cứu hoặc dùng một chất chuẩn nội thêm vào dịch truyền vào kim thăm dò [95, 97]. Chất chuẩn nội lý tƣởng phải giống thuốc không những về tính chất vật lý (khả năng khuếch tán qua màng, độ tan...) mà còn cả về đặc tính sinh học (chuyển hóa, liên kết protein...) [20, 49]. Giả định rằng hệ số khuếch tán qua màng bán thấm theo cả hai chiều là nhƣ nhau, nồng độ dịch kẽ mô
Cm = 0, thì hiệu suất của thuốc chính là hiệu suất của chất chuẩn nội. Hiệu suất này
đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa nồng độ bị mất đi (Δ = Cin – Cout) và nồng độ ban đầu Cin
của chất chuẩn nội theo công thức [99, 106]:
Chất chuẩn nội cần phải có độ phân tán, độ dẫn truyền… tƣơng tự nhƣ chất phân tích, vì thế ngƣời ta thƣờng chọn chất chuẩn nội là đồng phân phóng xạ hoặc đồng phân deuteri (2H) với chất phân tích.
Các phƣơng pháp hiệu chỉnh đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Tùy vào từng nghiên cứu cụ thể, việc lựa chọn phƣơng pháp cần đƣợc cân nhắc sao cho có thể tính đƣợc chính xác hiệu suất của kim thăm dò.
2.3. QUY TRÌNH CHUNG CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO TRONG NGHIÊN CỨU Y DƢỢC HỌC
Kỹ thuật thẩm tách micro trong nghiên cứu y dƣợc học đƣợc tiến hành theo một quy trình chung gồm 5 bƣớc [7]:
Bước 1: Chuẩn bị các kim thăm dò, dung dịch truyền có thành phần và nồng độ tƣơng ứng với dịch tại mô đích cần nghiên cứu và các đối tƣợng nghiên cứu (ngƣời, chuột, thỏ, lợn, khỉ, mèo…).
Bước 2: Cấy kim thăm dò vào mô đích tác dụng của thuốc (não, cánh tay, bắp đùi, lƣng….)
Bước 3: Truyền dịch có thành phần và nồng độ tƣơng ứng với dịch tại mô đích với tốc độ rất chậm (từ 0,1 - 5 μl/phút), dịch thẩm tách thu đƣợc sẽ có chứa các phân tử thuốc/chất chuyển hóa.
Bước 4: Định lƣợng nồng độ phân tử thuốc/chất chuyển hóa/chất nội sinh trong dịch thẩm tách thu đƣợc bằng phƣơng pháp phân tích thích hợp (HPLC, UPLC [89, 91, 102], LC – MS…).
Bước 5: Hiệu chỉnh lại nồng độ thuốc/chất chuyển hóa/chất nội sinh thông qua hiệu suất in vitro hoặc in vivo của màng bán thấm.