6. Giả thuyết khoa học
1.3.2.1. Hệ vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với
vùng T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyến và xâm nhập của T-DNA vào hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể trong đó vùng T-DNA và vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng A. tumeỷaciens.
Đoạn khòi động Gen quan tâm Đoan khởi dộng \ / у Đoạn kểt
thúc
Gen chỉ thi chọn lọc Đoạnbiênphai thực vật ' 1
Đoạn kết thúc --Л
Đoạn biên trá/ гPLASMID.NHO
Hình 1.4. Sơ đồ câu trúc vector nhị thê
Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm:
- Các đơn vị sao chép để DNA plasmid có thế tự nhân lên trong cả E. coỉỉ và Agrobacterium.
- Các gen chọn lọc, gen chỉ thị.
- Vùng đa nhân dòng nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải đế chèn gen 6 Vùng T-AON Vùn Vùng khởi đàu Gen chì thi chon lọc vi vùng khởi dâu sao chép cùa Vùng khải dâu sao chép cùa
mong muốn.
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng vir được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và biên phải, biên trái. Plasmid này đượccải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacterium, khi các gen trên vector bô trợ hoạt động thì các sản phâm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyến gen dẫn đến việc chuyến đoạn T-DNA sang tế bào thực vật.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững trong E. coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector nhị thể có một số ưu điểm như:
- Không xảy ra quá trình tái tố hợp giữa các plasmid.
- Kích thước vector khá nhỏ.
Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E. coli sang A. tumeýhcỉens
đã tăng lên. Hiện nay, vector nhị thể được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen [6].
ĩ.3.2.2. Hệ vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng nằm trên plasmid vi khuấn (như vector của E. coli) với vùng T-DNA trên
Ti- plasmid của A. tumeỷciciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ
vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid (hình 1.5).
Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
(1) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của vi khuẩn.
(2) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được sử dụng để bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước lớn và thiếu vùng MCS). Chúng được nhân lên trong E. coỉỉ và chuyển sang A. tumeýaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thế sao chép trong A. tumeýaciens nên chúng mang những đoạn tương đồng với T-DNA.
(3) Vector trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di động
(mob) và gen chuyến {tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào A.
tume/aciens [48].
Hình 1.5. Sơ đồ câu trúc vector liên hợp
1.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nưóc