6. Giả thuyết khoa học
1.3.1.1. Phương pháp chuyến gen trực tiếp
■ Chuyến gen nhờ kỹ thuật xung điện (electroporation)
Kỹ thuật này áp dụng cho việc chuyển gen vào tể bào trần. Người ta chuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200- 600 v/cm trong khoảng thời gian ngắn 4-5 phần nghìn giây. Ket quả làm cho màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời có đường kính khoảng 30 | Am, mà qua đó các DNA biến nạp ở bên ngoài có thể xâm nhập vào trong tế bào. Quá trình biến nạp được thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc các “buồng xung điện” có các tấm cực bằng kim loại đặt cách nhau 1 - 4 mm. Sau quá trình điện xung, tế bào trần được nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc để tách các tế bào trần đă thu nhận DNA. Sau đó các tế bào trần này được nuôi cấy tái sinh cây và tiếp tục chọn lọc. Các yếu tố chính tác động lên hiệu quả biến nạp bằng xung điện bao gồm: cường độ điện trường, điện dung, tính chất ion và nồng độ đệm, thời gian tiền xử lý.
■ Kỹ thuật chuyên gen nhờ Silicon Carbide
Silicon Carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi Silicon Carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 |J.m và dài khoảng 1 0 -
8 0 Ịim. Khi lắc một huyền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc với Silicon Carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập vào. Sau đó các tế bào này được nuôi cấy tạo callus, tái sinh cây và chọn lọc để tách ra những cây mang gen chuyến [14]. Huyền phù tế bào đơn thường được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyến là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen.
Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kích thước sợi Silicon Carbide, thông số vortex, dụng cụ chứa mẫu, nguyên liệu thực vật và đặc điểm tế bào thực vật, đặc biệt là độ dày của thành tế bào.
Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, chi phí thấp và áp dụng được cho nhiều loài thực vật. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất là hiệu quả chuyển gen thấp và tổn thương gây ra cho tế bào có thể ảnh hưởng tới khả năng tái sinh sau này [46].
■ Chuyên gen bằng sủng bẳn gen
Chuyển gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là các phần tử kim loại nặng (wonfam hay vàng) có kích thước hiển vi (0,5 - 5 |Um) có tỷ trọng cao để đạt được gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào [14], [42].
ưu điêm:
- Có thế áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào.
- Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh.
- Dễ sử dụng, quy trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể được xử lý trong thời gian ngắn.
- Các vector được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi các trình tự DNA cho đoạn T- DNA như chuyển gen bằng Agrobacterium.
- Cần một lượng nhỏ DNA plasmid.
- Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thế quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp.
Nhược điêm:
- Nhiều bản sao được chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vững.
- Tần số biến nạp thấp, thường xuyên nhận được thế khảm.
- Thiết bị đắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thể mua được, giá thành vật tư đắt.
■ Biến nạp bằng hoả chất PEG ịpolyethylene glycol)
Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp chuyển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chuyến gen vào các tế bào trần.
Ớ nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế bào trần [14].
Ưu điêm:
- Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công.
- Có thế chuyến gen vào tế bào trần của bất kỳ loài thực vật nào
- Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền
Nhược điểm:
- Quá trình biến nạp khó điều khiển, số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thể lớn.
- Tần số biến nạp thành công biến động giữa các thí nghiệm.
- Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen.
- Đòi hỏi một hệ thống tái sinh tể bào trần vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài cây trồng do phụ thuộc vào các yếu tố ngoài thí nghiệm như: loài, kiếu gen trong loài, phản ứng tổn thương và tái sinh.
■ Phương pháp vỉ tiêm
Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết 5
bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào. Kỹ thuật này có ưu điểm là: lượng DNA được biến nạp là tuỳ ý và xác định, DNA được đưa vào đúng vị trí mong muốn, thậm trí là nhân tế bào. Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thể thực hiện đ- ược và có thế biến nạp vào các loài cây trồng, có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa được DNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [14].
■ Phương pháp vĩ tiêm
Sử dụng kim tiêm có đường kính lớn hơn đường kính tế bào để đưa DNA vào tế bào. Các tế bào này bị phá vỡ và DNA xâm nhập vào các tế bào bị tốn thương, sau đó được chuyển vào các tế bào bên cạnh. Kỹ thuật này đơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen thấp [24]. Chuyển gen bằng vĩ tiêm thường áp dụng cho những đối tượng có bầu nhụy lớn, dễ thao tác.
■ Phương pháp Agrolistic
Phương pháp Agrolistic kết hợp ưu điểm của hai phương pháp bắn gen và chuyến gen thông qua Agrobacterium. Trong phương pháp này, vector thiết
kế có đoạn T-DNA mang gen quan tâm được chuyến đồng thời với các gen mã hoá protein virDlvà virD2 vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật bắn gen, nhờ đó kích thích sự gắn kết của T-DNA trong hệ gen thực vật [44].