6. Giả thuyết khoa học
1.2.4. Các yếu tổ ảnh hưởng đến nuôi cấy invitro
Môi trường nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống ỉn vỉtro. Ngoài chức năng làm giá thể cho mẫu cấy, môi trường nuôi cấy còn có nhiệm vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn tại, phân hoá và phát triến. Vấn đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thế.
- Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vỉtro. Thành
phần của môi trường hoá học thay đối theo loài cây, bộ phận cây,mục đích
nuôi cấy
nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2].
+ Nhóm nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là nguyên tố muối khoáng được sừ dụng ở nồng độ trên 30 ppm, bao gồm các nguyên tố sau: N, p, K, s, Mg và Ca. Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và có chức năng xây nên thành tế bào.
+ Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo...tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô. Neu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển callus rất nhanh, nhưng có hiệu xuất tái sinh thấp. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượngphụ thuộc
vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy.
+ Nguồn cacbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon đế mẫu nuôi cấy có thể tổng hợp được các chất hữu co* giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn cacbon bổ
sung là đường xaccarozơ và glucozơ với liều lượng 20-30g/lít. Guatheret (1959) cho thấy đối với phần lớn các mô, đường xaccarozơ và glucozơ là nguồn cacbon tốt nhất [13]. Trong trường họp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: maltozơ, lactozơ hay fructozơ.
+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả
năng tự tông hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triên nhanh của chúng. Các vitamin thường được sử dụng như: Bt (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxy hóa khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1-10 mg/1. B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzim khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin, nồng độ thường dùng từ 0,1-1 mg/1. B5 (axit nicotinic) đi vào thành phần các enzim oxy hóa khử dehydrrogenase xúc tác việc tách hydro khỏi các axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,5-1 mg/1. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tông hợp thành tê bào thực vật [13].
+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của callus và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, myo-inositol và các chất hoạt tính auxin, các gluoxit của xytokinin.
+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của
toàn bộ quá trình nuôi cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất điều hoà sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, đê nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thê để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm
chất là auxin, xytokinin và gibberellin. .
Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự dãn tế bào, sự hình thành rễ bất định và callus. Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng các loại auxin là: IAA, NAA và 2,4-D. Các loại auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-0,5 mg/1 tuỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy.
Các chất thuộc nhóm xytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là: Kinetin và BAP. Tỉ lệ giữa auxin và xytokinin quy định sự biệt hoá của mô, tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành callus. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ auxin/xytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bang 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo callus.
+ Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế đã chứng minh pH thấp (pH<4,5) hoặc cao (pH>7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Cụ thế, nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy. Thông thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5-6,5 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro.
+ Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đối chất trong mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của mô nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25±2°c.
+ Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận
nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12-16 giờ/ngày. Ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000-3000 Lux, tương đương với khoảng cách 30cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường độ thấp là phù hợp với nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy callus có thể không cần ánh sáng. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng. Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của callus. Nguồn chiếu sáng bằng đèn Compact 3U có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây và cây hoa chuông [10].
1.3.Co’ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật 1.3.ĩ. Các phương pháp chuyên gen vào thực vật