6. Giả thuyết khoa học
1.3.1.2. Phương pháp chuyến gen giản tiếp
■ Chuyển gen nhờ virus
Virus được sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ thâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy nhiên đế trở thành vector chuyển gen thì virus cần có các tiêu chuẩn sau:
- Genome virus là DNA chứ không phải RNA.
- Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ thành tế bào 5
(plasmodest).
- Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào.
- Có phổ ký chủ rộng.
- Không gây hại hoặc gây hại không đáng kể.
Tuy nhiên hiện nay việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng, do virus về nguyên tắc không truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chuyến gen nhờ vi rút phải tiến hành bằng phương pháp vô tính. Điều này không phải thực hiện được với tất cả các loài cây. Đây chính là một nhược điềm lớn của phương pháp chuyển gen bang virus.
■ Chuyên gen thông qua vi khuân Agrobacterium
Từ những năm đầu của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện ra một loại vi khuấn Agrobacterium có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật.
Agrobacterium là một loại vi khuẩn gram âm. Cả chủng A. tumefaciens
và A. rhizogenes đều được sử dụng phổ biến trong chuyển gen vào thực vật. Theo cơ chế tự nhiên, hai loại này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy root) [2], [15], [19]. Những tế bào của khối u hay lông rễ có thể phát triển in vỉtro khi vắng mặt bất cứ chất ĐHST thực vật nào. Đây là do trong tế bào của các dạng hoang dại A. tumefaciens và A. rhizogenes
chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid). Ti- plasmid có kích thước khoảng 200 kb đã được xác định trình tự, chứa một đoạn DNA có chiều dài khoảng 25 kb gọi là T- DNA (transfer DNA) có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ chế tự thiên [27]. Do đó Agrobacterium là một hệ
thống chuyến gen tự nhiên. Bằng cách cải biên (cắt bỏ các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyến và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng. Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyến gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.
Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã được áp dụng thành 5
công trên nhiều đối tượng cây trồng đặc biệt là cây hai lá mầm như: khoai tây, cà chua, thuốc lá [22], đậu tương, bông...và một số cây hoà thảo như: lúa, ngô đã làm cho phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn [13], [29], [31]. Sự chuyển nạp nhờ vi khuẩn vào cây một lá mầm khó thành công do cây một lá mầm như hoà thảo thường không có phản ứng với sự thương tổn.
vết thương không dẫn đến sự phản phân hoá tế bào lân cận. Mặt khác, vi khuẩn
khó gắn kết với thành tế bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm, hoạt động của vùng vir bị ức chế.
- Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid:
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm
và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30°c. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập (hình 1.1) dài khoảng 200 kb và có trọng lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng VIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp.
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chuyến từ vi khuấn sang genom của cây chủ và tồn tại bền vững ở đó. Tuy nhiên, vùng này không mă hoá những sản phấm trung gian cho quá trình chuyến T-DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (gen chv).
Hình 1.1.Cấu trúc Ti-plasmid
- cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA:
Ket quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp gần như hoàn toàn dài khoảng 25 bp, gọi là đoạn biên (hình 1.2). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyên T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật.
H
Hình 1.2. Cẩu trúc đoạn T-DNA Ở đoạn biên phải
(Righ boder-RB) có yếu tố điều khiển cỉs cần cho quá trình
chuyến T-DNA. Đoạn biên trái (Left boder-LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyến T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [7], [41].
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật là một đoạn DNA liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một
đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá
những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u
như tmsl, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng
6
Cảc gen gây khói u sản sinh cytokinin Tống hợp opin
Vùng gây khối u (One)
hợp
auxin và cytokinin [30].
- Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào ở cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất của phenol như: Acetosyringon, hydroxy-acetosyringon... Dưới tác dụng dẫn dụ của các hợp chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào cây chủ. Protein VirA nằm trên thành tế bào vi khuẩn Agrobacterium sẽ nhận biết sự có mặt và tương tác với các phân tử acetosyringon. Tiếp đến VirA sẽ phosphoryl hoá protein VirG làm cho VirG trở thành dạng hoạt động. Đen lượt VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE cũng như tăng cường
mức độ phiên mã của gen virG bằng cách tương tác với trình tự điều hoà của VIR box. Sợi dưới của T-DNA bị cắt ở vị trí giữa nucleotid thứ 3 và 4 của trình tự biên nhờ hoạt động của VirDl/VirD2 endonuclease [38]. Đồng thời với quá trình cắt là quá trình tổng hợp mới sợi thay thế cho sợi bị cắt. Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T, sợi T được chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5’ đi trước [50]. Đầu 5’ của sợi T được liên kết đồng hoá trị với protein VirD2 ở vị trí axit amin tyrosine 29 [27].
Trong quá trình di chuyển, protein VirE2 gắn với sợi T tạo thành phức hợp T dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của các enzyme thuỷ phân và các enzyme endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ. Protein VirB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khuẩn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T có thể được vận chuyển sang tế bào cây chủ [50]. Protein VirD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trò là tín hiệu nhận biết trong hệ thống vận chuyển này [30]. Sau khi T- DNA qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên (hình 1.3).
Tại đó nhờ sự điều khiển của gen thực vật mà các gen trên T-DNA bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triến thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u [6], [49].
- Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumeỷaciens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyến gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh hoàn chỉnh cây chuyển gen từ các tế bào và mô mang gen chuyến nạp. Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến
nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn, các yếu tố liên quan đến thực vật và một số các yếu tố khác. Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuân, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen
vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector. Các yếu tố liên quan
đến thực vật gồm: loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích [14], [22].
Mật độ vi khuẩn cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển nạp T-DNA. Theo Hiei và cộng sự (1994) thì mật độ vi khuân Agrobacterium thích hợp nhât cho chuyên gen vào lúa từ 1,0 X 106 đến 1,0 X 1010 cfu/ml [29], mật độ này cũng đã được nhiều thử nghiệm thành công ở ngô [31].
Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng chuyển T-DNA của các gen vir. Tăng khả năng biếu hiện của các gen vir đạt được bằng cách gây tiền
cảm ứng vi khuẩn với họp chất phenol như acetosyringone (AS). Tiền xử lý 6
trong môi trường chứa AS đã làm tăng tần suất biến nạp gen ở các cây thuốc lá. Bổ sung AS vào môi trường nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chuyến gen thông qua Agrobacterỉum.
Ngoài ra pH của môi trường lây nhiễm cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự chuyến nạp T-DNA vào tế bào thực vật. Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi giá
trị pH dao động từ 5,2 - 5,8.
Nhiệt độ thích hợp cho chuyên nạp T-DNA phụ thuộc vào loài và mô thực vật. Đối với lá cây thuốc lá thì nhiệt độ thích hợp là 22°c. Hiệu quả chuyển gen vàongô thu được ở nhiệt độ 20°c cao hơn ở 23°c khi sử dụng vector nhị thể [26], còn nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen vào huyền phù ở lúa là 23 - 25°c và ở ngô là 23°c [26].