II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ
* Phương pháp lấy mẫu:
- Với chim Trĩ dưới 2 tuần tuổi, lấy máu động mạch cổ với lượng 0,5ml/con
- Với chim Trĩ trên 2 tuần tuổi, lấy máu tĩnh mạch gốc cánh với lượng 1ml/con.
Sau khi lấy máu vào bơm tiêm nhựa, bẻ gập kim, đậy nắp, để nghiêng
lạnh và gửi đến khoa Thú y – trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội để kiểm tra hàm lượng kháng thể.
* Phương pháp kiểm tra kháng thể:
- Phương pháp xử lý huyết thanh
+ Chắt huyết thanh trong bơm tiêm nhựa ra ống nghiệm , đem ly tâm 1500 vòng/phút trong 5-10 phút.
+ Chắt huyết thanh trong ống nghiệm vừa ly tâm ra ống nghiệm mới, đánh dấu ống.
+ Xếp các ống nghiệm chứa huyết thanh vừa chắt được vào khay, đem
xử lý nhiệt ở 560C/30 phút trong nồi hấp cách thủy để diệt bổ thể.
+ Huyết thanh đã được xử lý bảo quản ở nhiệt độ 40C để dùng ngay
hoặc cất giữ ở -200C để dùng sau.
- Phương pháp làm phản ứng HA
+ Dụng cụ và dung dịch:
• Dung dịch chống đông (citrate natri 1%)
Citrat natri 1g
Nước cất 100ml
• Dung dịch pha loãng kháng nguyên và hồng cầu: Nacl 0,85%
Nacl 8,5g
Nước cất vừa đủ 1000ml + Tiến hành phản ứng:
• Chuẩn bị hồng cầu gà: Máu gà trống khỏe mạnh đã trưởng thành,
không có kháng thể cúm và Newcastle. Dùng bơm kim tiêm 5ml hút sẵn 1ml dung dịch Citrat natri 1% rồi sau đó lấy máu ở tĩnh mạch cánh hút tới 5ml. Cho máu từ bơm kim tiêm vào ống nghiệm rồi ly tâm 1000-1500 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi ly tâm xong hút bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh
lý (NaCl 0,85%) vào ống nghiệm, lắc đều. Ly tâm như trên khoảng 3 lần để rửa hồng cầu, lần ly tâm cuối cùng hút bỏ phần nước trong phía trên.
Pha hồng cầu thành dung dịch 1% bằng cách pha 1ml hồng cầu ở trên với 99 ml nước muối sinh lý.
• Bảo quản dung dịch hồng cầu 1% ở nhiệt độ 4-80C. Hồng cầu sau khi
pha có thể dùng trong 4-5 ngày. Hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng.
• Xử lý huyết thanh: 560C/30 phút trong nồi đun cách thủy.
• Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên (HA): Kháng nguyên để tan ở nhiệt
độ phòng; Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu vi lượng (HA)
+ Cách tiến hành phản ứng:
Phản ứng được tiến hành theo sơ đồ sau:
Giếng Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC(-) Nước sinh lý (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng nguyên Newcastle (µl) 25
Hiệu giá virus 1/2 1/4 1/8 1/1 6
1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Hồng cầu gà 1%
(µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Dùng micropipettes nhỏ vào tất cả các giếng, mỗi giếng 25µl nước sinh
lý. Sau đó, cho vào giếng thứ nhất 25µl kháng nguyên Newcastle. Trộn đều
rồi hút sang giếng thứ hai 25µl, tiếp tục làm tương tự như vậy cho đến giếng thứ 10 thì hút bỏ đi 25µl. Lúc này hiệu giá kháng nguyên pha loãng từ giếng 1
đến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8;…đến 1/512 1/1024. Tiếp đó cho vào tất cả các giếng 25µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ, để yên trong 30 phút rồi đọc kết quả.
+ Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: hồng cầu bị ngưng kết rải thành mảng ở đáy giếng Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, nước ở bên trong.
Hiệu giá ngưng kết: Đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng trước giếng không ngưng kết.
Hiệu giá phản ứng HA là độ pha loãng virus cao nhất mà ở đó vẫn còn ngưng kết hồng cầu, người ta gọi đó là 1 đơn vị HA. Trong phản ứng HI phải
sử dụng kháng nguyên là virus Newcastle pha ở 4 đơn vị HA, để phản ứng
chính xác hơn cần xác định 4 đơn vị HA.
Xác đinh 4 đơn vị HA
Trên tấm nhựa microtest plate dùng 4 dãy, 4 giếng. Nhỏ vào mỗi giếng 25µl nước sinh lý. Nhỏ vào giếng 1 của 4 dãy: 25µl kháng nguyên đã pha ở 4 đơn vị HA, trộn đều, hút 25µl từ giếng 1 sang giếng 2 và làm tương tự cho tới giếng thứ 3 hút bỏ đi 25µl. Hiệu giá HA của các giếng là: giếng thứ 1 có 2 đơn vị HA, giếng thứ 2 có 1 đơn vị HA, giếng 3 có 0,5 đơn vị HA. Sau đó nhỏ hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, giếng thứ 4 làm đối chứng chỉ có nước sinh lý và hồng cầu.
Lắc nhẹ tấm nhựa, để yên 30 phút rồi đọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết hồng cầu chỉ xảy ra đến giếng thứ 2 thì kháng nguyên pha đúng ở 4 đơn vị HA.
- Phương pháp làm phản ứng HI
+ Chuẩn bị
• Hồng cầu gà 1%
• Huyết thanh cần chuẩn đoán
• Nước muối sinh lý
+ Cách tiến hành phản ứng
Phản ứng được tiến hành theo sơ đồ sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC (-) ĐC (+) Nước sinh lý (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh gà (µl) 25 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Kháng nguyên Newcastle (4HA) (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Hồng cầu gà 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Dùng khay nhựa có 96 giếng đáy chữ U (có 8 dãy giếng, mỗi dãy giếng dùng cho một mẫu huyết thanh).
Dùng micropipettes nhỏ vào tất cả các giếng, mỗi giếng 25µl nước sinh lý, riêng ô đối chứng (+) cho 50µl nước sinh lý.
Sau đó cho vào ô thứ nhất 25µl huyết thanh cần kiểm tra, trộn đều rồi hút sang giếng thứ hai 25µl. Tiếp tục làm như vậy cho tới giếng thứ 10 rồi hút bỏ 25µl đi. Lúc này hiệu giá huyết thanh pha loãng từ giếng 1 đến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8….đến 1/512; 1/1024.
Tiếp đó cho 25µl kháng nguyên pha ở 4 đơn vị HA vào tất cả các giếng trừ giếng đối chứng (+). Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút cho kháng nguyên kết hợp với kháng thể nếu có.
Tiếp tục cho hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng, lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 phút rồi đọc kết quả.
+ Đọc kết quả
Phản ứng âm tính: hồng cầu bị ngưng kết rải đều dưới đáy ống nghiệm. Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, nước bên trong do virus Newcastle bị kháng thể kháng Newcastle có trong huyết thanh trung hòa không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
Hiệu giá HI là độ pha loãng huyết thanh cao nhất tại đó kháng thể vẫn còn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Thông qua hiệu giá HI người ta đánh giá mức độ miễn dịch của đàn
chim. Hiệu giá HI (log2) từ 1/8 trở lên được coi là có khả năng bảo hộ với
bệnh Newcastle. Hiệu giá HI càng cao thì khả năng bảo hộ càng lớn.