a. Xác định thành phần, cấu trúc của TA-PEG-Gelatin
Tổng hợp NPCPEGNPC
Để tổng hợp TA-PEG-Gelatin cần phải hoạt hóa hai nhóm OH cuối của PEG bởi pnitrophenyl chloroformate tạo sản phẩm trung gian NPC-PEG- NPC theo phản ứng sau:
Hình 3.12: Sơ đồ tổng hợp PEG NPC Phổ 1H NMR đo trong dung môi H2O
Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPCPEGNPC đƣợc thể hiện qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (hình 3.13). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong PEG nhƣ pic đơn ở δ = 3,64ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên mạch PEG ở vị trí liên kết với nhóm (-O-CH2-CH2-).Tín hiệu pic ở δ = 4,42ppm là tín hiệu của proton H trên mạch PEG liên kết với nhóm NPC (NPC-O-CH2-). Hai tín hiệu pic ở δ = 7,38ppm và δ = 8,26ppm là tín hiệu của proton H của nhóm NPC (-CH=CH-). Các kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Park [117]. Mức độ hoạt hóa đạt khoảng 97% đƣợc tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methylene (PEG).
Tổng hợp TAPEGNPC
Trong giai đoạn này, liên kết urethane đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nguyên tử nitơ trong phân tử tyramin và nhóm C=O của hợp chất NPC-PEG- NPC tạo sản phẩm TA-PEG-NPC.
Hình 3.14: Sơ đồ tổng hợp TA- PEG - NPC Phổ 1H NMR đo trong dung môi H2O
Hình 3.15: Phổ 1H NMR của TAPEGNPC
Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của TAPEGNPC đƣợc thể hiện qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (hình 3.15). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton thơm của nhóm Tyramin ở δ= 6,77 và 7,02 ppm. Ngoài ra, ở vùng 8,29 – 8,38 ppm thể hiện tín hiệu của proton thơm (NPC). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Park [171]. Khoảng 67% NPC đƣợc thay thế bởi TA thu đƣợc từ kết quả tính tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton thơm liên hợp của TA.
Tổng hợp TA-PEG-Gelatin
Trong giai đoạn phản ứng này, phản ứng urethane đƣợc tạo thành từ nhóm NH2 trên mạch gelatin và nhóm C=O của sản phẩm trung gian NPC
Hình 3.16: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Gelatin Phổ 1H NMR đo trong dung môi H2O
Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của TA-PEG-Gelatin đƣợc thể hiện qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (hình 3.17). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong gelatin nhƣ mũi đơn ở vị trí 4,8 ppm (proton vị trí anomeric carbone của gelatin) và các mũi ở vị trí 0,8-4,6ppm (proton của các nhóm alkyl của gelatin.
Pic đơn ở δ = 3,64ppm là tín hiệu nhóm methylene của mạch PEG. Hai tín hiệu pic ở δ = 6,77ppm và δ = 7,09ppm là tín hiệu proton liên hợp vòng thơm của tyramin.
Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Park [116,117].
Phổ đồ FTIR của gelatin [phụ lục 15] có những pic 1636 và 1550 cm-1 đặc trƣng cho dao động N-H của amin, các pic này không xuất hiện trong phổ đổ FTIR của TA-PEG-gelatin [phụ lục 16] do phản ứng urethane đƣợc tạo thành từ nhóm NH2 trên mạch gelatin và nhóm C=O của sản phẩm trung gian NPCPEGTA khi tổng hợp TA-PEG-gelatin.
b. Xác định lượng TA trong TA-PEG-Gelatin
Lƣợng TA trong TA-PEG-Gelatin đƣợc xác định bằng phổ tử ngoại- khả kiến (UV-Vis). Kết quả tính toán lƣợng TA trong mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện qua bảng 3.3.
Bảng 3.3: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Gelatin
Đại lƣợng Kết quả
Độ hấp thu của dung dịch TA-PEG-Gelatin 1 mg/mL A 0,10724 Nồng độ TA C(mg/ml) 0,00839 Khối lƣợng TA có trong 1mg TA-PEG-Gelatin mTA(mg/1 mg TA-PEG-Gelatin) 0,00839
Khối lƣợng TA có trong 100mg TA-PEG-Gelatin mTA(mg/100mg TA-PEG- Gelatin) 0,83904 Số mol TA có trong 100 mg TA-PEG-Gelatin nTA(mmol/100mg TA-PEG- Gelatin) 0,00612
Kết quả phân tích lƣợng TA trong TA-PEG-Gelatin cho thấy trong 100mg TA-PEG-Gelatin có 0,83904mg TA tƣơng đƣơng 0,00612mmol TA.
3.2.2. Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin /BCP
a. Xác định lượng H2O2 tối thiểu để tạo gel
Theo nghiên cứu của Kurisawa [97] số mol H2O2 tối thiểu cần phản ứng là 60% số mol TA. Trên cơ sở đó, chúng tôi tính lƣợng H2O2 tối thiểu cần phản ứng với TA trong 100mg TA-PEG-Gelatin để tạo gel là 0,00367 mmol
tƣơng đƣơng lƣợng H2O2 là 0,0125% trong dung dịch TA-PEG-Gelatin 10%.
Ngoài ra nồng độ H2O2 không sử dụng cao hơn 0,25% vì sẽ gây độc đối với tế bào [119].
b. Khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Kết quả khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP bằng cách thay đổi lƣợng H2O2 và lƣợng HRP trong dung dịch TA-PEG-Gelatin đƣợc thể hiện thông qua hình 3.18 và hình 3.19. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.18: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lƣợng H2O2/TA-Gelatin tại
lƣợng HRP/TA-Gelatin là 0,00025% và nồng độ TA-PEG-Gelatin 10%
Hình 3.19: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin
là 0,0125% và nồng độ TA-PEG-Gelatin 10%
Các đồ thị trên cho thấy thời gian gel hóa của hydrogel khá nhanh trong vài phút, và lƣợng H2O2, lƣợng HRP ảnh hƣởng đến thời gian tạo gel.
Khi tăng lƣợng H2O2/TA-PEG-Gelatin từ 0,0125 lên 0,1% (lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin 0,0025%, nồng độ TA-PEG-Gelatin 10%) thời gian tạo gel của hydrogel TA-PEG-Gelatin tăng từ 50 đến 168 giây.
Khi tăng lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin từ 0,00013 đến 0,01 % (lƣợng H2O2/ TA-PEG-Gelatin 0,0125%, nồng độ TA-PEG-Gelatin 10%) thời gian tạo gel của hydrogel TA-PEG-Gelatin giảm từ 80 còn 77 giây.
Trong trƣờng hợp hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP thời gian tạo gel ít thay đổi so với thời gian tạo gel của hydrogel TA-PEG-Gelatin. Ví dụ: thời gian tạo gel của TA-PEG-Gelatin là 80 giây khi nồng độ TA-PEG- Gelatin 10%, lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin 0,0013% và lƣợng H2O2/TA-PEG- Gelatin 0,0125%; khi có thêm BCP với lƣợng 10% thời gian tạo gel là 77 giây.
3.3.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Hình 3.20: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau
Hình ảnh SEM đƣợc sử dụng để khảo sát hình thái học của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau (hình 3.20). Kết quả cho thấy hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP có cấu trúc không gian ba chiều xốp phù hợp cho ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.
3.3.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA- PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng theo thời gian đƣợc sử dụng để khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP, kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.21.
Hình 3.21: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo thời gian
Kết quả khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP cho thấy hydrogel không có BCP khối lƣợng suy giảm nhanh hơn so với hydrogel composit có BCP. Lƣợng BCP trong hydrogel composit càng tăng thì khối lƣợng (%) suy giảm của hydrogel composit càng nhỏ. Ví dụ: sau 3 tuần TA-PEG-Gelatin suy giảm 12% và TA-PEG-Gelatin-5%BCP suy giảm 11%, TA-PEG-Gelatin -10%BCP suy giảm 10%.
Hydrogel composit TA-PEG-Gelatin, TA-PEG-Gelatin 5%BCP và TA- PEG-Gelatin-10%BCP hydrogel composit có khối lƣợng mất đi sau 4 tuần là 20,89; 19,49 và 17,73%. Hydrogel TA-PEG-Gelatin có thời gian suy giảm dài hơn hydrogel TA-Gelatin. Thời gian suy giảm của hydrogel composit TA-
PEG-Gelatin/BCP và hydrogel TA-PEG-Gelatin dài hơn 4 tuần, điều này khẳng định PEG gắn lên mạch polymer gelatin làm gelatin khó phân hủy.
Tóm lại, hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP suy giảm gần 100% sau 42 giờ nhƣng sau khi biến tính gắn PEG vào gelatin thì khối lƣợng suy giảm chậm lại rõ rệt, sau 4 tuần hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin chỉ suy giảm gần 20% khối lƣợng.
3.3.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-PEG- Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP đƣợc khảo sát trên cơ sở độc tính tế bào của vật liệu và trên cơ sở sự bám dính và phát triển của tế bào trên vật liệu.
a. Tính tương hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP trên cơ sở độc tính tế bào
Hình 3.22: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG- Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp MTT trên tế bào xƣơng MG-63.
Kết quả khảo sát tính tƣơng hợp sinh học trên cơ sở độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP cho thấy: với các nồng độ pha loãng dung dịch chiết mẫu khác nhau (0, 25, 50, 75, 100%) cả hydrogel TA-PEG-Gelatin lẫn hydrogel composit TA-PEG- Gelatin/BCP đều có tỉ lệ sống của tế bào trên 97%.
Dựa trên tiêu chuẩn ISO 10993-5, 1999 (vật liệu không độc đối với tế bào khi tại các nồng độ pha loãng dung dịch chiết mẫu tỉ lệ tế bào sống đều cao hơn 70%), cho thấy hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP đều không độc đối với tế bào.
b. Tính tương hợp sinh học của hdrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP trên cơ sở sự bám dính và phát triển của tế bào trên vật liệu
Hình 3.23: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP sau thời gian 5
ngày
Khảo sát sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang. Nhân tế bào màu xanh sau khi nhuộm tế bào với thuốc nhuộm DAPI. Kết quả (hình 3.23) cho thấy: sau 5 ngày, tế bào bám và phát triển rất tốt thành 1 lớp phủ trên bề mặt cả hydrogel và hydrogel composit. Do đó có thể khẳng định tính tƣơng hợp sinh học cao của hydrogel TA-PEG-Gelatin và cả hydrogel composit TA-PEG-
Gelatin/BCP đối với tế bào xƣơng MG-63. Điều này có thể giải thích bởi gelatin và BCP đều có khả năng kích thích, thúc đẩy sự phát triển của tế bào, đặc biệt BCP thúc đẩy quá trình phát triển của tế bào xƣơng do BCP có khả năng hấp thụ protein của môi trƣờng nuôi cấy trong quá trình phát triển tế bào xƣơng[139-144]. Mặt khác các hạt BCP tạo tạo bề mặt gồ ghề giúp tế bào bám dính tốt [145, 146]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả thu đƣợc cho thấy hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP có nhiều tiềm năng ứng dụng trong tái tạo mô xƣơng.
3.3.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG- Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Hình 3.24: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Gelatin sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF
Khả năng tạo khoáng đƣợc sử dụng để dự đoán các hoạt tính sinh học của vật liệu trong nghiên cứu in vitro, in vivo chẳng hạn nhƣ khả năng tạo mầm và phát triển tinh thể apatite carbonate trên bề mặt của vật liệu [121,122].
Chúng tôi khảo sát sự hình thành khoáng apatite carbonate của hydrogel TA-PEG-Gelatin sau thời gian ngâm vật liệu 2 tuần trong dung dịch SBF và đƣợc đông khô. Quan sát hình ảnh SEM (hình 3.24) với kích thƣớc 100µm ta thấy hydrogel TA-PEG-Gelatin vẫn giữ đƣợc thành phần, cấu trúc
xốp. Hình ảnh SEM với kích thƣớc 10µm cho thấy trên bề mặt hydrogel xuất hiện các tinh thể lớn 1-2µm. Kết quả phân tích EDS các tinh thể đó (hình 3.24) cho thấy xuất hiện các nguyên tố Na (36,69%), Cl (50,91%) của muối NaCl trong dung dịch SBF và xuất hiện nguyên tố Au (12,40%) do lớp vàng phủ lên mẫu để phân tích EDS.
Hình 3.25: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG- Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF
Bảng 3.4: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong
dung dịch SBF
Mẫu nghiên cứu % khối lƣợng
C O Na P Cl Ca TA-PEG-Gelatin- 5%BCP 17,38 28,54 3,45 11,67 5,67 33,30 TA-PEG-Gelatin- 10%BCP 10,45 24,17 2,53 13,11 2,95 46,79
Khảo sát bằng hình ảnh SEM hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP (hình ) với lƣợng BCP 5% và 10%, sau thời gian ngâm vật liệu 2 tuần trong dung dịch SBF và đƣợc đông khô. Kết quả cho thấy hydrogel composit TA- PEG-Gelatin/BCP vẫn giữ đƣợc cấu trúc xốp. Hình ảnh SEM với kích thƣớc 3µm (hình 3.25) cho thấy trên bề mặt hydrogel composit xuất hiện các hạt tinh thể rất nhỏ. Phân tích EDS các hạt tinh thể trên (hình 3.25) cho thấy ngoài các nguyên tố Na, Cl còn xuất hiện nguyên tố C, O, P, Ca là các nguyên tố cấu thành calcium phosphate, calcium carbonate. Kết quả phân tích trong bảng 3.4 cho thấy phần lớn mầm tinh thể chứa các nguyên tố Ca, P, O, C là nguyên tố cấu thành calcium phosphate và calcium carbonate và phần còn lại là các tinh thể chứa nguyên tố Na, Cl.
Các kết quả nghiên cứu của Mohamed [123], Amir [124], Gu [125] khẳng định: BCP tăng cƣờng khả năng tạo khoáng với vai trò nhƣ các mầm apatite carbonate, đồng thời cũng là nguồn cung cấp ion calcium và ion phosphate cho quá trình phát triển mầm tinh thể và tinh thể apatite carbonate.
Phân tích cấu trúc pha của hydrogel composit trƣớc và sau khi ngâm hydrogel composit trong dung dịch SBF bằng phƣơng pháp nhiễu xạ XRD khẳng định sự hình thành khoáng apatit của hydrogel composit sau khi ngâm trong dung dịch SBF. Giản đồ nhiễu xạ XRD của hydrogel và hydrogel composit trƣớc khi ngâm SBF [phụ lục 17] có các pic tinh thể của PEG tại vị trí 9.10◦ và 23.30◦, và HAp 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411), sau khi ngâm hydrogel composit trong dung dịch SBF 7, 14 ngày giản đồ nhiễu xạ XRD xuất hiện thêm các pic của CaCO3 tại vị trí 2 theta 26,34; 33,24 điều này khẳng định sự tạo thành của khoáng apatit của hydrogel composit sau khi ngâm trong dung dịch SBF.
Do đó trên cơ sở kết quả thực nghiệm của luận án cho thấy hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP có hiệu quả trong quá trình hình thành và phát triển của khoáng apaptite carbonate.
3.4. HYDROGEL COMPOSIT HPA-CHITOSAN/BCP 3.4.1. Tổng hợp HPA-Chitosan
Sản phẩm HPA-Chitosan đƣợc tổng hợp thông qua phản ứng giữa nhóm amine của chitosan và nhóm carboxyl của HPA.
Hình 3.26: Sơ đổ tổng hợp HPA-Chitosan
Phổ 1H NMR của HPA-Chitosan trong dung môi H2O
Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của HPA-Chitosan đƣợc thể hiện qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của HPA-Chitosan (hình 3.27). Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của HPA-Chitosan có các tín hiệu của các proton có trong chitosan nhƣ các pic đơn ở vị trí từ 2–4 ppm là các tín hiệu D- glucosamine có trong chitosan. Pic đơn ở vị trí 2,056 chứng tỏ sự có mặt của proton H nhóm –NHCOCH3 trên mạch chitosan. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Nguyen [131], Tran [152], Ho [154], Nguyen [155].
Sự xuất hiện của pic đôi ở vị trí 6,892 và 7,216 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton Hb, Hc (nhóm -CH=CH- trong nhân thơm) và pic đơn ở vị trí 2,905 ppm chứng tỏ sự có mặt của proton Ha (nhóm -CH2-) của HPA. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Tran [152], Lee [153], điều này chứng tỏ HPA-Chitosan đã đƣợc tổng hợp thành công.
b. Xác định lượng HPA trong HPA-Chitosan
Lƣợng HPA trong HPA-Chitosan đƣợc xác định bằng phổ tử ngoại- khả kiến (UV-Vis). Kết quả tính toán lƣợng HPA trong mẫu nghiên cứu đƣợc