a. Tổng hợp Tyramin-Tetronic-Chitosan
Hình 2.2: Các bƣớc tổng hợp Tyramin-Tetronic-Chitosan Tyramin-Tetronic-Chitosan đƣợc tổng hợp qua 3 giai đoạn:
Tổng hợp TetronicNPC, trƣớc hết chúng tôi hoạt hóa 4 nhóm −OH cuối mạch của tetronic bởi pnitrophenyl chloroformate (NPC) tạo sản phẩm Tetronic NPC.
Tổng hợp Tyramin-Tetronic-NPC, Tetronic-NPC đƣợc dùng làm tác chất cho phản ứng ghép với tyramin (TA). Trong phản ứng này liên kết urethane đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nguyên tử nitơ trong phân tử tyramin và nhóm C=O của hợp chất Tetronic-NPC tạo sản phẩm là TA- Tetronic-NPC.
Tổng hợp Tyramin-Tetronic-Chitosan, trong giai đoạn phản ứng này, nhóm NH2 trên mạch chitosan sẽ tấn công vào liên kết C=O của hợp chất NPC-PEG-TA tạo sản phẩm Tyramin-Tetronic-Chitosan.
-Chuẩn bị dung dịch chitosan
Hoà tan 0,5 g chitosan (MW = 100.000 300.000, độ deacetyl hóa 85%) trong 50 mL nƣớc cất ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm axit HCl 10% chỉnh pH = 1. Sau khi chitosan tan hoàn toàn, nhỏ từ từ từng giọt dung dịch NaOH 1M để đƣa dung dịch chitosan về pH = 4.
-Tổng hợp TyraminTetronicchitosan
Đun nóng chảy 3,6 g Tetronic (0,80 mmol) trong bình cầu hai cổ 100 mL ở nhiệt độ 65oC, kết hợp hút chân không liên tục. Cho 1,2g NPC (6
mmol) vào tetronic đã nóng chảy, khuấy và hút chân không trong 4 giờ . Cho 30 mL THF vào hỗn hợp tiếp tục khuấy trong khoảng 1 giờ, sau đó để nguội. Tetronic đã đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc kết tủa trong diethyl ether. Sau đó kết tủa đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, chất bột rắn màu trắng thu đƣợc là NPCTetronicNPC.
Nhỏ từng giọt dung dịch chứa 0,406 g TA (3 mmol) hòa tan trong 5 mL DMF và 25 mL THF dung dịch tetronic đã hoạt hóa, khuấy trong 24 giờ thu đƣợc dung dịch tyramintetronicpnitrophenyl carbonate ester (TA-Te- NPC). Dung dịch TA-Te-NPC đƣợc kết tủa trong diethyl ether, kết tủa đƣợc lọc qua phễu lọc hút chân không, sản phẩm đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, thu đƣợc TA-Te-NPC là chất bột rắn màu trắng. Hòa tan hoàn toàn TA-Te-NPC vào 30 mL nƣớc và nhỏ từng giọt vào dung dịch chitosan, khuấy liên tục trong 24 giờ. Để loại bỏ hoàn toàn một lƣợng nhỏ các nhóm NPC còn dƣ, 0,5 g TA trong nƣớc đƣợc nhỏ giọt vào hỗn hợp dung dịch và tiếp tục khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thu đƣợc dung dịch TA- Te-Chitosan. Sau đó tiến hành thẩm tách bằng nƣớc muối và nƣớc cất với màng thẩm tách MWCO 14.000 Da, khoảng 4 giờ thay nƣớc 1 lần, quá trình thẩm tách kéo dài 3 ngày. Dung dịch sau khi thẩm tách đƣợc đông khô ở −80o
C trong 24 giờ thu đƣợc chất rắn màu trắng là sản phẩm TA-Te-Chitosan. Sử dụng phƣơng pháp 1
H-NMR xác định thành phần, cấu trúc của TA- Te-Chitosan.
Xác định lƣợng TA trong TA-Te-Chitosan bằng phƣơng pháp UV-Vis. Đo độ hấp thu A của dung dịch TA-Te-Chitosan ở nồng độ 1mg/mL và dùng đƣờng chuẩn của nồng độ TA và độ hấp thu A tại bƣớc sóng 270nm [phụ lục 14] để xác định lƣợng TA trong TA-Te-Chitosan.
Hydrogel TA-Te-Chitosan đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-Te-Chitosan với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-Te-Chitosan đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-Te-Chitosan đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.
c. Tổng hợp in situ hydrogel TA-Te-Chitosan/BCP
Hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-Te-Chitosan với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, BCP đƣợc phân tán đều trong dung dịch TA-Te-Chitosan bằng phƣơng pháp khuấy trộn, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-Te- Chitosan/BCP đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-Te- Chitosan/BCP đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.