trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA- PEG-Chitosan oxi hóa với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, BCP đƣợc phân tán đều trong dung dịch TA-PEG-Chitosan oxi hóa bằng phƣơng pháp khuấy trộn, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.
2.4 KHẢO SÁT CÁC TÍNH CHẤT CỦA HYDROGEL VÀ
HYDROGEL COMPOSIT
2.4.1. Khảo sát thời gian tạo gel của hydrogel và hydrogel composit
Thời gian để hình thành gel, thời gian các chất tƣơng tác, phản ứng để hình thành các liên kết ngang. Thời gian tạo gel đƣợc xác định từ khi cho các chất phản ứng với nhau đến khi các chất tạo khối không thể chảy xuống khi dốc ngƣợc xuống trong 1 phút [96, 97].
2.4.2. Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composit
Mẫu đƣợc làm khô bằng phƣơng pháp đông khô, sau đó rút chân không và phủ một lớp vàng mỏng để quan sát hình thái mẫu bằng máy FESEM (JSM-635F, JEOL).
2.4.3. Khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel và hydrogel composit composit
Khối lƣợng suy giảm của hydrogel và hydrogel composit đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trọng lƣợng theo thời gian. Mẫu hydrogel và hydrogel composit sau khi đông đƣợc cân để xác định khối lƣợng (W0). Mẫu đƣợc cắt theo khối vuông theo kích thƣớc 1 cm3, đƣợc ngâm trong 10 mL dung dịch
PBS chứa trong tuýp nhựa 50mL. Sau thời gian 7, 14, 21, 28 ngày mẫu hydrogel composit đƣợc rửa bằng nƣớc cất, đông khô và cân để xác định khối lƣợng (Wt) [98]. Phần trăm khối lƣợng suy giảm đƣợc tính nhƣ sau:
Khối lƣợng suy giảm (%) = x 100%
2.4.4. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel và hydrogel composit
Nuôi cấy tế bào
Tế bào xƣơng MG-63 đƣợc sử dụng trong đánh giá độ tƣơng hợp sinh học của các mẫu nghiên cứu. Tế bào MG-63 đƣợc nuôi cấy trong đĩa Petri với mật độ 1 x 104 tế bào/cm2 trong môi trƣờng Dulbecco’s Eagle (DMEM; Gibco BRL, USA) bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bò (FBS; Gibco BRL, USA), 100 U/ml penicillin (Gibco BRL, USA) và 100 µg/ml streptomycin (Gibco BRL, USA). Đĩa cấy đƣợc đặt trong điều kiện môi trƣờng không khí ẩm với 5% CO2 ở 37°C. Sau ba ngày, tế bào đƣợc thu hoạch bằng cách xử lý với Trypsin-EDTA (Gibco BRL, USA). Sau đó dung dịch chứa tế bào đƣợc ly tâm, thay thế bằng dung dịch PBS và đƣợc dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Đánh giá độc tính tế bào
Phƣơng pháp MTT đánh giá độc tính tế bào ở cấp độ “in vitro”. Phƣơng pháp này dựa trên phản ứng của enzyme của tế bào sống với MTT, màu vàng nhạt của MTT chuyển sang màu xanh đặc trƣng của phức MTT và enzyme. Độc tính của mẫu đƣợc xác định dựa trên tiêu chuẩn (tiêu chuẩn ISO 10993-5, 1999).
Dung dịch chiết của mẫu trong DMEM đƣợc sử dụng để đánh giá độc tính tế bào của mẫu. Để lấy dịch chiết, các mẫu trƣớc tiên đƣợc xử lý bằng dung dịch ethanol 70% để khử trùng và sau đó rửa sạch với PBS để loại bỏ ethanol. Bƣớc tiếp theo, mẫu đƣợc ngâm trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào
DMEM và đƣợc đặt bên trong tử ấm (incubator) điều kiện 37o
C, tốc độ lắc 120vòng/phút trong thời gian ba ngày. Sau khi ủ, dịch chiết của mẫu đƣợc lọc qua màng lọc khuẩn (kích thƣớc lỗ 22µm) và pha loãng với các nồng độ khác nhau 100%, 75%, 50%, 25%.
Các dịch chiết đã pha loãng trên đƣợc cho vào đĩa cấy 96 giếng chứa tế bào MG-63(1×104 tế bào/giếng) đã đƣợc ủ 24 giờ, và đĩa cấy 96 giếng này đƣợc giữ trong tủ ấm 3 ngày. Sau đó 20 µl dung dịch MTT (5 mg/ml) đƣợc cho vào các giếng nuôi và đĩa cấy 96 giếng đƣợc giữ trong tủ ấm 4 giờ. Cuối cùng, loại bỏ dung dich trong đĩa cấy, cho vào mỗi giếng 200 µl DMSO. Độ hấp thụ của dung dịch đƣợc đo tại bƣớc sóng 595 nm bằng bộ đọc ELISA (EL, 312, Biokinetics reader, Bio-Tek instruments). Các mẫu đƣợc thí nghiệm lặp lại 4 lần.
Đánh giá sự bám dính và phát triển của tế bào trên vật liệu