a. Tổng hợp TA-PEG-Chitosan
Hình 2.3: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Chitosan TAPEGchitosan qua 3 giai đoạn:
Tổng hợp NPCPEGNPC, hai nhóm OH cuối của PEG sẽ đƣợc hoạt
Tổng hợp TAPEGNPC, trong giai đoạn này, liên kết urethane đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nguyên tử nitơ trong phân tử tyramin và nhóm
C=O của hợp chất NPC-PEG-NPC tạo sản phẩm TAPEGNPC.
Tổng hợp TAPEGchitosan, trong giai đoạn phản ứng này, phản ứng urethane đƣợc tạo thành từ nhóm NH2 trên mạch chitosan và nhóm C=O của sản phẩm trung gian NPCPEGTA.
-Chuẩn bị dung dịch chitosan
Hòa tan 0,7 g chitosan (MW = 100.000 − 300.000 ) trong 70 mL nƣớc, pH=1 ở nhiệt độ phòng. Sau khi chitosan tan hoàn toàn, nhỏ từ từ từng giọt dung dịch NaOH 1M để đƣa dung dịch chitosan về pH = 4.
-Tổng hợp TA-PEG-Chitosan
Đun nóng chảy 10 g PEG (2,5 mmol) ở 65o
C kết hợp hút chân không liên tục trong 2 giờ. Sau khi PEG nóng chảy hoàn toàn cho 1,521 g NPC (7,5 mmol), tiếp tục khuấy và hút chân không liên tục trong 3 giờ. Cho 30 mL THF vào hỗn hợp tiếp tục khuấy trong khoảng 1 giờ, sau đó để nguội. PEG đã đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc kết tủa trong diethyl ether, kết tủa đƣợc lọc bằng phễu lọc hút chân không. Sau đó kết tủa đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, thu đƣợc chất bột rắn màu trắng là NPCPEGNPC.
Hòa tan hoàn toàn 0,384g TA (2,8 mol) trong 5mL DMF và 35 mL THF, sau đó nhỏ từng giọt hỗn hợp trên vào 40 mL dung dịch có chứa 10 g NPCPEGNPC (2,3 mmol) trong THF, khuấy trong 24 giờ. Dùng phƣơng pháp cô quay ở 40oC để đuổi dung môi THF, sản phẩm sau phản ứng đƣợc kết tủa bởi diethyl ether. Sau đó kết tủa đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, thu đƣợc chất bột rắn màu trắng là NPCPEGTA.
Hòa tan 3,8 gam NPCPEGTA trong 30 mL nƣớc cất rồi nhỏ từng giọt dung dịch vào dung dịch chitosan đã chuẩn bị, khuấy trong 24 giờ ở nhiệt
độ phòng. Để loại bỏ hoàn toàn một lƣợng nhỏ các nhóm NPC còn dƣ, dung dịch ở dạng huyền phù chứa 0,5 g TA đƣợc nhỏ giọt vào hỗn hợp và tiếp tục khuấy trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng thu đƣợc dung dịch chứa TA-Te- Chitosan. Sau đó tiến hành thẩm tách bằng nƣớc muối và nƣớc cất với màng thẩm tách MWCO 14.000 Da, khoảng 4 giờ thay nƣớc 1 lần, quá trình thẩm tách kéo dài 3 ngày. Dung dịch sau khi thẩm tách đƣợc đông sâu ở −80oC và tiến hành đông khô trong 24 giờ thu đƣợc sản phẩm TAPEGchitosan dạng xốp màu trắng.
Sử dụng phƣơng pháp 1
H-NMR xác định thành phần, cấu trúc của TAPEGchitosan.
Xác định lƣợng TA trong TA-PEG-Chitosan bằng phƣơng pháp UV- Vis. Đo độ hấp thu A của dung dịch TA-PEG-Chitosan ở nồng độ 1mg/mL và dùng đƣờng chuẩn của nồng độ TA và độ hấp thu A tại bƣớc sóng 270nm [phụ lục 14] để xác định lƣợng TA trong TA-PEG-Chitosan.
b. Tổng hợp in situ hydrogel TAPEGChitosan
Hydrogel TA-PEG-Chitosan đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-PEG-Chitosan với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG-Chitosan đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-PEG-Chitosan đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.
c. Tổng hợp in situ hydrogel TA-PEG-Chitosan/BCP
Hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-PEG- Chitosan với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, BCP đƣợc phân tán đều trong dung dịch TA-PEG-Chitosan bằng phƣơng
pháp khuấy trộn, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG-Chitosan/BCP đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-PEG-Chitosan/BCP đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.