Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel

24 giếng, tế bào MG-63 đƣợc cấy lên vật liệu với mật độ 5104 tế bào/giếng. Sau thời gian 5 ngày nhân tế bào đƣợc nhuộm với DAPI (20mg/mL) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, mẫu đƣợc rửa 3 lần bằng dung dịch PBS. Tế bào đã đƣợc nhuộm màu trên hydrogel composit đƣợc quan sát qua kính hiển vi huỳnh quang [99].

2.4.5. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel composit composit

Chuẩn bị dung dịch SBF theo bảng 2.2

Bảng 2.2 Các chất để pha 1000mL SBF có pH=7,4

Chất Số lƣợng

NaCl 8,035g

NaHCO3 0,355g

K2HPO4.3H2O 0,231g MgCl2.6H2O 0,311g 1,0 M HCl 39mL CaCl2 0,292g Na2SO4 0,072g (CH2OH)3CNH2 6,118g

Mẫu hydrogel và hydrogel composit sau khi đông khô đƣợc cắt theo khối vuông 1 cm3, sau đó ngâm trong ống nhựa chứ 10mL dung dịch SBF pH 7,4. Sau thời gian ngâm14 ngày, mẫu đƣợc rửa bằng nƣớc cất để loại bỏ các muối tan, sau đó đông khô mẫu. Phân tích khoáng hình thành trên bề mặt hydrogel composit bằng hình ảnh SEM, và phƣơng pháp EDS [100].

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3. 1. TỔNG HỢP BCP

3.1.1. Kết quả phân tích XRD của BCP

Hình 3.1: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P = 1,53 tại các pH: (a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11

Giản đồ nhiễu xạ tia X của các mẫu nghiên cứu đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P = 1,53 (hình 3.1), tại pH=7 và pH=9 có các pic đặc trƣng của β- TCP: 25,80 (10 10); 27,77 (214); 31,03 (0210); 34,37 (220); 52,94 (20 20) [62, 104, 105] và các pic đặc trƣng của HAp: 25,90 (002); 29,14 (210); 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411) [101-103]. Điều này khẳng định các mẫu đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P = 1,53, tại pH=7 và pH=9 là BCP (hỗn hợp β-TCP và HAp).

Giản đồ nhiễu xạ tia X với tỉ lệ mol Ca/P = 1,53 (hình 3.1) tại pH=11 chỉ tồn tại các pic đặc trƣng của HAp: 25,90 (002); 29,14 (210); 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411) [101-103]. Điều này khẳng định các mẫu đó là HAp tại pH=11.

Trong khi đó, giản đồ nhiễu xạ tia X với tỉ lệ mol Ca/P=1,57 [phụ lục 3] cũng cho kết quả giống nhƣ với tỉ lệ mol Ca/P=1,53, sản phẩm tại pH=7 và pH=9 có hai pha tinh thể β-TCP và HAp và tại pH=11 chỉ tồn tại pha HAp.

Tuy nhiên, giản đồ nhiễu xạ tia X với tỉ lệ mol Ca/P=1,61 [phụ lục 4] tại pH=7 sản phẩm có hai pha tinh thể β-TCP và HAp, còn tại pH=9 và pH=11 sản phẩm chỉ có 1 pha HAp.

Các công trình nghiên cứu trƣớc [62] cho thấy với tỉ lệ mol Ca/P=1,50 thì tổng hợp đƣợc β-TCP, còn với tỉ lệ mol Ca/P=1,67 [64, 65] thì sẽ tổng hợp đƣợc HAp, nên khi tỉ lệ mol Ca/P càng gần 1,67 thì xu thế tạo thành sản phẩm HAp càng nhiều. Tuy nhiên, khi môi trƣờng phản ứng càng base thì phản ứng càng có xu thế tạo thành sản phẩm HAp. Do đó với tỉ lệ mol Ca/P=1,53 và 1,57 tại pH=7 và pH=9 phản ứng vẫn có xu hƣớng tạo thành β- TCP, nên sản phẩm có hai pha tinh thể β-TCP và HAp. Còn tỉ lệ mol Ca/P=1,53 và 1,57 tại pH=11 sản phẩm tạo thành chỉ có HAp.

Với tỉ lệ mol Ca/P=1,61 tại pH=7 phản ứng vẫn có xu hƣớng tạo thành β-TCP, nên sản phẩm có hai pha tinh thể β-TCP và HAp. Còn tỉ lệ mol Ca/P=1,61 tại pH=9 và pH=11 sản phẩm tạo thành chỉ có HAp.

Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu đã đƣợc công bố của Bahman Mirhadi (2011) [62], Byong- Taek Lee [63].

Thành phần HAp hoặc β-TCP, theo Sylvie Raynaud [106] đƣợc tính toán dựa trên các pic nhiễu xạ là mặt phẳng (2 1 0) tại 2θ = 29,14° hoặc mặt phẳng (2 1 1) 2θ = 31,86° đối với HAp và mặt phẳng (0 2 10) tại 2θ= 31,08° đối với β-TCP (các pic này đƣợc đánh dấu bằng mũi tên trên hình 3.1). Tỷ lệ

cƣờng độ đƣợc sử dụng để phân tích định lƣợng calcium phosphate hai pha chứa HAp và β-TCP đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn của R1 theo lƣợng (%) HAp [phụ lục 8] hoặc đƣờng chuẩn của R2 theo lƣợng (%) β-TCP [phụ lục 9]. Phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp của các mẫu nghiên cứu đƣợc tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Tổng hợp các thông số và phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp theo tỉ lệ mol Ca/P

Tỉ lệ mol pH R2 %mβ-TCP %m HAp 1,53 7 2,8 35,8 64,2 9 2,7 33,8 66,2 11 0,0 0,0 100,0 1,57 7 2,4 26,3 73,7 9 1,6 18,8 81,2 11 0,0 0,0 100,0 1,61 7 2,1 23,6 76,4 9 0,0 0,0 100,0 11 0,0 0,0 100,0

Theo các nghiên cứu của Carlos A. Garrido [52] sản phẩm BCP với tỉ lệ % khối lƣợng -TCP:HAp là 35: 65 phù hợp với ứng dụng cho xƣơng. Cho nên trong luận án này, chúng tôi sử dụng sản phẩm BCP có % khối lƣợng - TCP:HAp là 33,8: 66,2 dùng tạo hydrogel composit nhằm giúp xƣơng phát triển (BCP đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P là 1,53, pH môi trƣờng phản ứng là 9).

3.1.2. Kết quả phân tích IR của BCP

Hình 3.2: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53: (a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11

Phổ đồ FTIR cho thấy pic 3573 cm1 tƣơng ứng với các dao động của nhóm OH trong HAp và pic 635 cm-1 là dao động giãn của nhóm OH trong HAp. Các dải rất mạnh tại 1032 cm-1 và 1092 cm-1 tƣơng ứng với các nhóm PO4-3. Pic 962 cm-1 tƣơng ứng với dao động bất đối xứng của liên kết P-O trong nhóm PO43-, và các pic 603 cm-1 và 570 cm-1 tƣơng ứng với dao động uốn của PO4 trong HAp [62, 104, 105, 107-112].

Kết qủa phân tích này khẳng định mẫu nghiên cứu có chứa HAp.

Do đó kết hợp kết quả phân tích FTIR với kết quả phân tích XRD có thể khẳng định tùy theo điều kiện phản ứng sẽ thu đƣợc sản phẩm là BCP (hỗn hợp β-TCP và HAp) hoặc HAp.

3.1.3. Kết quả khảo sát hình thái của BCP bằng hình ảnh SEM

Hình thái học của sản phẩm BCP và HAp đƣợc quan sát bằng hình ảnh SEM.

Kết qủa hình SEM cho thấy: phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm (hình 3.3) cho sản phẩm kích thƣớc nano và kích thƣớc các hạt tƣơng đối đồng đều. Trong khi đó phƣơng pháp kết tủa không sử dụng sóng siêu âm [111] cho sản phẩm có kích thƣớc micro và đa phân tán (hình 3.4).

Điều này có thể đƣợc giải thích bởi sóng siêu âm làm tăng hiệu ứng hóa học và hiệu ứng vật lý, quá trình tạo-vỡ bọt xảy ra gần bề mặt phân pha lỏng- rắn làm giảm sự tích tụ của các hạt. Ngoài ra sóng siêu âm tăng tốc độ tạo mầm tinh thể dẫn đến sản phẩm tạo thành có kích thƣớc nhỏ hơn khi không sử dụng sóng siêu âm [113-115]. Vì vậy, trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm để tổng hợp BCP.

Hình 3.3: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp bằng phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,61 tại pH=9

Hình 3.4: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa không sử dụng sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,67; tại pH=8 (h-1) và pH=9 (i-1)

[111]

Hình 3.5: Hình ảnh SEM của HAp và β-TCP tại các điều kiện phản ứng khác nhau

Phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm từ các phản ứng với các tỉ lệ mol Ca/P (1,53; 1,57; 1,61) tại các pH khác nhau (7; 9; 11) đều có kích thƣớc nano từ 70 đến 100 nm và tƣơng đối đồng đều.

3.2. HYDROGEL COMPOSIT TA-GELATIN/BCP 3.2.1. Tổng hợp TA-Gelatin 3.2.1. Tổng hợp TA-Gelatin

a. Xác định thành phần, cấu trúc của TA-Gelatin

Sản phẩm TA-Gelatin đƣợc tổng hợp thông qua phản ứng giữa nhóm amine của tyramin và nhóm carboxyl của gelatin.

Hỉnh 3.6: Sơ đồ tổng hợp TA-Gelatin Phổ 1H NMR của TA-Gelatin đƣợc đo trong H2O

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của TA-Gelatin đƣợc thể hiện qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (hình 3.7). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong gelatin nhƣ pic đơn ở vị trí 4,8 ppm (proton vị trí anomeric carbone của gelatin) và các pic ở vị trí 0,8-4,6ppm (proton của các nhóm alkyl của gelatin. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Park [116, 117].

Sự xuất hiện của pic đôi ở vị trí 6,754; 7,105 ppm trong phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của TA-Gelatin chứng tỏ sự có mặt của proton Ha, Hb (nhóm -CH=CH- trong nhân thơm) của tyramin. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Park [116, 117], điều này chứng tỏ TA-Gelatin đã đƣợc tổng hợp thành công.

b. Xác định lượng TA trong TA-Gelatin

Lƣợng TA trong TA-Gelatin đƣợc xác định bằng phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis). Kết quả tính toán lƣợng TA trong mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện qua bảng 3.2.

Bảng 3.2: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Gelatin

Đại lƣợng Kết quả

Độ hấp thu của dung dịch TA- Gelatin 1 mg/mL

A

0,08608

Nồng độ TA C(mg/ml)

0,00537 Khối lƣợng TA có trong 1mg TA-

Gelatin mTA(mg/1mg TA-Gelatin) 0,00537 Khối lƣợng TA có trong 100 mg TA-Gelatin mTA(mg/100mg TA-Gelatin) 0,53725 Số mol TA có trong 100 mg TA-

Gelatin

nTA(mmol/100mg TA-Gelatin)

Kết quả phân tích lƣợng TA trong TA-Gelatin cho thấy trong 100mg TA-Gelatin có 0,538mg TA tƣơng đƣơng 0,00392 mmol TA.

3.2.2. Tổng hợp hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP Gelatin/BCP

a. Xác định lượng H2O2 tối thiểu để tạo gel

Theo nghiên cứu của Kurisawa [97] số mol H2O2 tối thiểu cần phản ứng là 60% số mol TA. Trên cơ sở đó, chúng tôi tính lƣợng H2O2 tối thiểu cần phản ứng với TA trong 10mg TA-Gelatin để tạo gel là 0,00235 mmol tƣơng đƣơng lƣợng H2O2 là 0,008% trong dung dịch TA-Gelatin 10%. Ngoài ra nồng độ H2O2 không sử dụng cao hơn 0,25% vì sẽ gây độc đối với tế bào [119].

b. Khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP

Thời gian gel hóa của hydrogel là thông số có ý nghĩa trong việc định hƣớng ứng dụng vật liệu nhƣ: tiêm hydrogel trực tiếp vào vết thƣơng hoặc định hình hydrogel trƣớc khi ghép hydrogel vào vết thƣơng. Kết quả khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA- Gelatin/BCP bằng cách thay đổi lƣợng H2O2 và lƣợng HRP trong dung dịch TA-Gelatin đƣợc thể hiện thông qua hình 3.8 và hình 3.9.

Hình 3.8: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP theo lƣợng H2O2/TA-Gelatin tại lƣợng

HRP/TA-Gelatin là 0,00025% và nồng độ TA-Gelatin 10%

Hình 3.9: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP theo lƣợng HRP/TA-Gelatin tại lƣợng

H2O2/TA-Gelatin là 0,01% và nồng độ TA-Gelatin 10%

Các đồ thị trên cho thấy thời gian gel hóa của hydrogel khá nhanh trong vài phút, và lƣợng H2O2, lƣợng HRP ảnh hƣởng đến thời gian tạo gel.

Khi tăng lƣợng H2O2/TA-Gelatin từ 0,008 lên 0,025% (lƣợng HRP/TA- Gelatin 0,00025%, nồng độ TA-Gelatin 10%) thời gian tạo gel của hydrogel TA-Gelatin tăng từ 70 đến 180 giây. Kết quả này phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trƣớc Jin [96], Kurisawa [97], Veitch [119]. Điều này đã đƣợc giải thích nhƣ sau: khi lƣợng H2O2 cao, H2O2 ức chế enzyme HRP làm cho thời gian tạo gel tăng lên.

Khi tăng lƣợng HRP/TA-Gelatin từ 0,00013 đến 0,001% (lƣợng H2O2/TA-Gelatin 0,01%, nồng độ TA-Gelatin 10%) thời gian tạo gel của hydrogel TA-Gelatin giảm từ 98 còn 48 giây. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: khi lƣợng HRP tăng thời gian tạo gel nhanh hơn do lƣợng enzyme xúc tác nhiều hơn nên liên kết ngang tạo thành nhanh hơn dẫn đến rút ngắn thời gian tạo gel [96].

Trong trƣờng hợp hydrogel composit TA-Gelatin/BCP thời gian tạo gel ít thay đổi so với thời gian tạo gel của hydrogel TA-Gelatin. Ví dụ: thời gian tạo gel của TA-Gelatin là 70 giây khi nồng độ TA-Gelatin 10%, lƣợng HRP/TA-Gelatin 0,00025 % và lƣợng H2O2/TA-Gelatin 0,008%, khi có thêm BCP với lƣợng 10% thời gian tạo gel là 68 giây.

Điều này có thể giải thích do tƣơng tác của các hạt BCP và gelatin. Nhóm chức NH2, OH, COOH của gelatin liên kết hydrogen với nhóm OH của HAp trong BCP, ngoài ra còn có liên kết tạo phức của nhóm NH2 của gelatin và ion Ca2+ của BCP [120-123]. Các liên kết giữa các hạt BCP và gelatin làm mật độ liên kết của hydrogel composit tăng do đó thời gian tạo gel của hydrogel composit giảm. Trái lại, BCP làm tăng độ nhớt của dung dịch nên ảnh hƣởng đến quá trình khuếch tán xúc tác dẫn đến thời gian tạo liên kết ngang tăng dần. Dẫn đến kết quả thời gian tạo gel của hydrogel composit TA- Gelatin/BCP ít thay đổi so với thời gian tạo gel của hydrogel TA-Gelatin.

Tóm lại: thời gian gel hóa có thể điều chỉnh cho phù hợp với nhu cầu thực tiễn ứng dụng bằng cách thay đổi lƣợng H2O2 hoặc HRP trong dung dịch TA-Gelatin.

3.2.3. Khảo sát hình thái của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP

Hình 3.10: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau

Hình ảnh SEM đƣợc sử dụng để khảo sát hình thái học của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau (hình 3.10). Kết quả cho thấy hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP có cấu trúc không gian ba chiều xốp. Trong khi vật liệu đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp đúc không có cấu trúc xốp nhƣ hydrogel [124-127].

Cấu trúc không gian 3 chiều, xốp của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP tạo khoảng cƣ trú cho tế bào dịch chuyển và lƣu thông các yếu tố chuyển hóa tạo xƣơng. Ngoài ra, tế bào và mạch máu có thể phát triển bên trong các lỗ xốp của vật liệu giúp xƣơng phát triển bên trong vật liệu [27, 123]. Do đó, cấu trúc xốp của hydrogel và hydrogel composit phù hợp cho ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.

3.2.6. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA- Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP

Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng theo thời gian đƣợc sử dụng để khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/ BCP, kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.11.

Hình 3.11: Đồ thị khối lƣợng (%) suy giảm của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP theo thời gian

Kết quả khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP cho thấy hydrogel không có BCP khối lƣợng suy giảm nhanh hơn nhiều so với hydrogel composit có BCP. Lƣợng BCP trong hydrogel composit càng tăng thì khối lƣợng (%) suy giảm của hydrogel composit càng nhỏ. Ví dụ: sau 18 giờ TA-Gelatin suy giảm 97% và TA-Gelatin-5%BCP suy giảm 66%, TA-Gelatin-10%BCP suy giảm 45%. Điều này có thể giải thích do tƣơng tác của các hạt BCP và gelatin. Nhóm

chức NH2, OH, COOH của gelatin liên kết hydrogen với nhóm OH của HAp

trong BCP, ngoài ra còn có liên kết tạo phức của nhóm NH2 của gelatin và ion Ca2+ của BCP [120-123].

Tuy vậy, khối lƣợng suy giảm gần 100% sau 42 giờ không phù hợp để ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.

3.3.1. Tổng hợp TA-PEG-Gelatin

a. Xác định thành phần, cấu trúc của TA-PEG-Gelatin

Tổng hợp NPCPEGNPC

Để tổng hợp TA-PEG-Gelatin cần phải hoạt hóa hai nhóm OH cuối của PEG bởi pnitrophenyl chloroformate tạo sản phẩm trung gian NPC-PEG- NPC theo phản ứng sau:

Hình 3.12: Sơ đồ tổng hợp PEG  NPC Phổ 1H NMR đo trong dung môi H2O

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPCPEGNPC đƣợc thể hiện qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (hình 3.13). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong PEG nhƣ pic đơn ở δ = 3,64ppm chứng tỏ sự có mặt của proton H trên mạch PEG ở vị trí liên kết với nhóm (-O-CH2-CH2-).Tín hiệu pic ở δ = 4,42ppm là tín hiệu của proton H trên mạch PEG liên kết với nhóm NPC (NPC-O-CH2-). Hai tín hiệu pic ở δ = 7,38ppm và δ = 8,26ppm là tín hiệu của proton H của nhóm NPC (-CH=CH-). Các kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Park [117]. Mức độ hoạt hóa đạt khoảng 97% đƣợc tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methylene (PEG).

Tổng hợp TAPEGNPC

Trong giai đoạn này, liên kết urethane đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nguyên tử nitơ trong phân tử tyramin và nhóm C=O của hợp chất NPC-PEG- NPC tạo sản phẩm TA-PEG-NPC.